CN113755360A - 一株广谱抑菌高海拔源植物乳杆菌及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一株广谱抑菌高海拔源植物乳杆菌及应用。本发明提供的植物乳杆菌S2菌株(Lactobacillus plantarum S2)保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 2021340。本发明提供的植物乳杆菌可抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌，具有很强的抑菌性。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株广谱抑菌高海拔源植物乳杆菌及应用。
背景技术
植物乳杆菌是益生菌的一类，被广泛的应用于酸奶、酸菜及饲料中。植物乳杆菌作为一种优良益生菌，可有效改善宿主的肠道环境、抑制有害菌的生长、提高免疫力、调节肠道黏膜屏障功能、降低胆固醇含量，为宿主健康生长提供保证。
植物乳杆菌可以抑制有害菌生长。现有技术中的化学防腐剂，一方面不符合国家倡导的绿色，环保，可持续发展；另外一方面，化学防腐剂的使用量对人们的健康不利。化学防腐剂虽然可以使食物防腐，但是对长远的人类健康跟环保是不利的。所以，现在急需一种新型的绿色环保并且对人体无害的防腐剂。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有广谱抑菌的植物乳杆菌S2菌株(Lactobacillusplantarum S2)，克服现有的化学防腐剂的不足，提供了一种新型绿色、环保、安全的生物防腐剂。
第一方面，本发明提供一株广谱抑菌高海拔源植物乳杆菌S2菌株(Lactobacillusplantarum S2)，所述植物乳杆菌S2菌株(Lactobacillus plantarum S2)保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 2021340。
优选地，所述植物乳杆菌S2菌株的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
第二方面，本发明还提供所述的植物乳杆菌S2菌株发酵得到的发酵液。
优选地，所述发酵液的制备方法包括以下步骤，培养所述的植物乳杆菌S2菌株。
优选地，所述发酵液的制备方法包括如下步骤：
(1)所述的植物乳杆菌S2菌株进行种子培养，得到植物乳杆菌S2菌株种子培养液；
(2)将所述的植物乳杆菌S2菌株种子培养液加入到发酵培养基中进行发酵，发酵40-60h后，获得所述发酵液。
优选地，步骤(1)中所述种子培养的温度为35-37℃；
优选地，所述种子培养时间为20-30h。
优选地，所述步骤(1)或步骤(2)中的培养基为MRS培养基。
优选地，所述步骤(2)中接种量为重量比1-10％；
优选地，步骤(2)中发酵温度为35-37℃。
第三方面，本发明提供所述的发酵液的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)所述的植物乳杆菌S2菌株进行种子培养，得到植物乳杆菌S2菌株种子培养液；
(2)将所述的植物乳杆菌S2菌株种子培养液加入到发酵培养基中进行发酵，发酵40-60h后，获得所述发酵液。
优选地，所述的制备方法步骤(1)中所述种子培养的温度为35-37℃；
优选地，所述种子培养时间为20-30h。
优选地，所述的制备方法步骤(1)或步骤(2)中的培养基为MRS培养基。
优选地，所述的制备方法步骤(2)中接种量为重量比1-10％；
优选地，步骤(2)中发酵温度为35-37℃。
第四方面，本发明提供所述的植物乳杆菌S2菌株或所述的发酵液在抑制细菌或真菌中的应用。
优选地，所述细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌中的一种或两种以上的组合；
优选地，所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌；
优选地，所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌。
优选地，所述真菌为霉菌中的一种或两种以上的组合。
第五方面，本发明提供所述的植物乳杆菌S2菌株或所述的发酵液在防腐剂、抑菌剂、风味剂或改善肠道环境产品中的应用。
优选地，所述产品为食品、保健品或药品。
经过试验验证本发明提供的植物乳杆菌可抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌，所得的试验结果证明该菌株具有很强的抑菌性。
本发明提供的植物乳杆菌S2菌株不仅可以有效的解决化学防腐剂的安全隐患，还可以改良食物的风味，改善肠道消化问题等。
菌种保藏信息
该植物乳杆菌S2菌株(Lactobacillus plantarum S2)于2021年4月8日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2021340，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：027-68754052。
附图说明
图1所示为对植物乳杆菌S2菌株构建的系统发育树结果图；
图2所示为植物乳杆菌S2菌株的发酵液对大肠杆菌的抑菌圈图；
图3所示为植物乳杆菌S2菌株的发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈图。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。本领域技术人员应当理解的是，这不应被理解为对本发明权利要求范围的限定。同时需要注意的是，本发明中的试剂或仪器无特别说明的均可通过市售购买得到。
本发明所用试剂及仪器具体来源列于下面的表1中。
表1本发明所用试剂厂商
实施例1植物乳杆菌S2菌株的分离、筛选和鉴定
(1)菌株富集：将从西藏5400m高海拔地区的野生牦牛粪用生理盐水溶解定容至10ml，充分振荡混匀。取1ml样品进行梯度稀释至10-3，取2ml稀释液加入到20ml石蕊牛乳培养基中，然后放到37℃培养箱培养，待培养基酸化凝固并呈现粉红色时取出。
(2)培养单菌落：将石蕊牛乳培养基菌液稀释浓度到10-5-10-6，接种到含有10ppm放线菌酮和10ppm硫酸粘菌素的BL琼脂培养基，在37℃培养24～48h，待菌落形成。在BL琼脂培养基上，菌落圆形，中等大小，直径3mm±1mm，微白色，凸起，边缘整齐。
(3)筛选产酸菌种：将初筛得到的单菌落，在加0.6％CaCO3的BL琼脂培养基中划线培养，培养40h，结束培养后观察有无透明圈，选择透明圈大的单菌落进行纯化实验。
(4)革兰氏染色初步鉴定：对复筛菌株进行革兰氏染色，如果菌体是紫色，则为革兰氏阳性菌，留下来进行后续研究，如果染色呈现红色，该菌株是革兰氏阴性菌直接淘汰。鉴定结果显示：所得复筛菌株为革兰氏阳性菌，菌体呈短粗杆状，成对存在，无芽孢。此菌株是目标菌株。
对获得的目的菌株进行16S rRNA分子生物学鉴定：使用高保真酶对待鉴定菌株进行16SrDNA测序及菌种鉴定，并绘出系统发育树。采用的引物为：正向引物27F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'；反向引物1492R：5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反应体系是：25μlMix；1μl样品；20μl ddH2O；2μl 27F；2μl 1492R；PCR反应温度：98℃，2min；98℃，10s，58℃，10s，72℃，7s，35x；72℃，2min；4℃保存。对PCR产物测序，之后采用MEGA8.0构建系统发育树。
测序结果如SEQ ID NO.1所示。构建的系统发育树如图1。根据图1所示的系统发育树可知本发明获得的株菌为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌S2菌株(Lactobacillusplantarum S2)。该植物乳杆菌S2菌株(Lactobacillus plantarum S2)于2021年4月8日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2021340。
实施例2植物乳杆菌S2菌株发酵液制备
(1)活化菌株：用移液枪吸取1ml甘油管保存的植物乳杆菌S2菌液，接种到9ml MRS液体培养基中，37℃，活化培养24h。
(2)种子培养：用移液枪吸取1ml植物乳杆菌S2活化培养液，接种到9ml MRS液体培养基中，37℃，培养24h得到种子培养液。
(3)发酵：用移液枪吸取5ml植物乳杆菌S2种子培养液，接种到45ml MRS液体培养基中，37℃，培养48h。
(4)离心发酵液：将发酵48h的发酵液1000rpm离心10min，收集上清。
(5)过滤发酵液：将收集的发酵上清液，用0.45μm的滤膜过滤到无菌离心管中备用，即得到植物乳杆菌S2菌株发酵液上清。
实施例3植物乳杆菌S2菌株对大肠杆菌的抑菌性能测定
甘油管保存的大肠杆菌(菌株编号：ATCC25922)菌液按5％接种LB培养基37℃180rpm震荡培养活化12h，按相同方式进行大肠杆菌种子液培养，至大肠杆菌种子液OD600为2.5。取100μl的大肠杆菌的种子液涂布到LB培养基上，使用灭过菌并且烘干的牛津杯立在表面，加入100μl的实施例2中制备的植物乳杆菌S2菌株发酵液；空白对照加入100μl的灭过菌的MRS液体培养基，48h观察并测量抑菌圈的大小。结果如图2所示。测量显示：植物乳杆菌S2发酵液对大肠杆菌的抑菌圈直径为26.4mm。
根据抑菌圈的大小可以看出本发明提供的植物乳杆菌S2菌株的发酵液对大肠杆菌有明显的抑菌作用。
实施例4植物乳杆菌S2菌株对金黄色葡萄球菌的抑菌性能测定
甘油管保存的金黄色葡萄球菌(菌株编号：ATCC 6538)菌液按5％接种LB培养基37℃180rpm震荡培养活化12h，按相同方式进行金黄色葡萄球菌种子液培养，至金黄色葡萄球菌种子液OD600为2.5。取100μl的金黄色葡萄球菌的种子液涂布到LB培养基上，使用灭过菌并且烘干的牛津杯立在表面，加入100μl的实施例2中制备的植物乳杆菌S2菌株发酵液；空白对照加入100μl的灭过菌的MRS液体培养基，48h观察并测量抑菌圈的大小。结果如图3所示。测量显示：植物乳杆菌S2发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为25.6mm。
根据抑菌圈的大小可以看出本发明提供的植物乳杆菌S2菌株的发酵液对金黄色葡萄球菌有明显的抑菌作用。
实施例5植物乳杆菌S2菌株对霉菌的抑菌性能测定
(1)霉菌孢子活化：甘油管保存的霉菌(菌株编号：ATCC 48113)孢子液在PDA培养基上涂布，30℃，倒置培养72h，待茄瓶培养基表面长满菌丝。
(2)霉菌孢子液制备：向茄瓶内加入20ml无菌水，用接种环将霉菌孢子刮到无菌水中，测霉菌孢子液浓度105个/mL。
(3)抑菌实验：在无菌试管中加入4ml PDB培养基、2ml实施例2中制备的植物乳杆菌S2菌株发酵液和1ml步骤(2)所得霉菌孢子指示菌悬液，在30℃条件下培养48h后，测定580nm波长下的吸光值，以2ml MRS培养基代替乳酸菌无菌发酵液作为对照组。
(4)抑菌率计算：
抑菌率(％)＝(1-OD580实验组/OD580对照组)*100％
结果显示：本发明提供的植物乳杆菌S2菌株的发酵液对霉菌有显著的抑菌作用，抑菌率达到60.7％。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北安琪生物集团有限公司
<120> 一株广谱抑菌高海拔源植物乳杆菌及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1458
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
<400> 1
acgtccttag gcggctggtt cctaaaaggt taccccaccg actttgggtg ttacaaactc 60
tcatggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg gcatgctgat 120
ccgcgattac tagcgattcc gacttcatgt aggcgagttg cagcctacaa tccgaactga 180
gaatggcttt aagagattag cttactctcg cgagttcgca actcgttgta ccatccattg 240
tagcacgtgt gtagcccagg tcataagggg catgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc 300
tccggtttgt caccggcagt ctcaccagag tgcccaactt aatgctggca actgataata 360
agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacaacca 420
tgcaccacct gtatccatgt ccccgaaggg aacgtctaat ctcttagatt tgcatagtat 480
gtcaagacct ggtaaggttc ttcgcgtagc ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg 540
tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttc agccttgcgg ccgtactccc caggcggaat 600
gcttaatgcg ttagctgcag cactgaaggg cggaaaccct ccaacactta gcattcatcg 660
tttacggtat ggactaccag ggtatctaat cctgtttgct acccatactt tcgagcctca 720
gcgtcagtta cagaccagac agccgccttc gccactggtg ttcttccata tatctacgca 780
tttcaccgct acacatggag ttccactgtc ctcttctgca ctcaagtttc ccagtttccg 840
atgcacttct tcggttgagc cgaaggcttt cacatcagac ttaaaaaacc gcctgcgctc 900
gctttacgcc caataaatcc ggacaacgct tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc 960
acgtagttag ccgtggcttt ctggttaaat accgtcaata cctgaacagt tactctcaga 1020
tatgttcttc tttaacaaca gagttttacg agccgaaacc cttcttcact cacgcggcgt 1080
tgctccatca gactttcgtc cattgtggaa gattccctac tgctgcctcc cgtaggagtt 1140
tgggccgtgt ctcagtccca atgtggccga ttaccctctc aggtcggcta cgtatcattg 1200
ccatggtgag ccgttacccc accatctagc taatacgccg cgggaccatc caaaagtgat 1260
agccgaagcc atctttcaag ctcggaccat gcggtccaag ttgttatgcg gtattagcat 1320
ctgtttccag gtgttatccc ccgcttctgg gcaggtttcc cacgtgttac tcaccagttc 1380
gccactcact caaatgtaaa tcatgatgca agcaccaatc aataccagag ttcgttcgac 1440
tgcatgtata gccgcgcc 1458
Claims (17)
1.一株广谱抑菌高海拔源植物乳杆菌S2菌株(Lactobacillus plantarum S2)，其特征在于，所述植物乳杆菌S2菌株(Lactobacillus plantarum S2)保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 2021340。
2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌S2菌株，其特征在于，所述植物乳杆菌S2菌株的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1或2所述的植物乳杆菌S2菌株发酵得到的发酵液。
4.根据权利要求3所述的发酵液，其特征在于，所述发酵液的制备方法包括以下步骤，培养权利要求1或2所述的植物乳杆菌S2菌株。
5.根据权利要求3或4所述的发酵液，其特征在于，所述发酵液的制备方法包括如下步骤：
(1)权利要求1或2所述的植物乳杆菌S2菌株进行种子培养，得到植物乳杆菌S2菌株种子培养液；
(2)将所述的植物乳杆菌S2菌株种子培养液加入到发酵培养基中进行发酵，发酵40-60h后，获得所述发酵液。
6.根据权利要求3-5任意一项所述的发酵液，其特征在于，步骤(1)中所述种子培养的温度为35-37℃；
优选地，所述种子培养时间为20-30h。
7.根据权利要求3-6任意一项所述的发酵液，其特征在于，所述步骤(1)或步骤(2)中的培养基为MRS培养基。
8.根据权利要求3-5任意一项所述的发酵液，其特征在于，所述步骤(2)中接种量为重量比1-10％；
优选地，步骤(2)中发酵温度为35-37℃。
9.权利要求3或4所述的发酵液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)权利要求1或2所述的植物乳杆菌S2菌株进行种子培养，得到植物乳杆菌S2菌株种子培养液；
(2)将所述的植物乳杆菌S2菌株种子培养液加入到发酵培养基中进行发酵，发酵40-60h后，获得所述发酵液。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述种子培养的温度为35-37℃；
优选地，所述种子培养时间为20-30h。
11.根据权利要求9或10所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)或步骤(2)中的培养基为MRS培养基。
12.根据权利要求9-11任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中接种量为重量比1-10％；
优选地，步骤(2)中发酵温度为35-37℃。
13.权利要求1或2所述的植物乳杆菌S2菌株或权利要求3-8任意一项所述的发酵液在抑制细菌或真菌中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌中的一种或两种以上的组合；
优选地，所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌；
优选地，所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌。
15.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述真菌为霉菌中的一种或两种以上的组合。
16.权利要求1或2所述的植物乳杆菌S2菌株或权利要求3-8任意一项所述的发酵液在防腐剂、抑菌剂、风味剂或改善肠道环境产品中的应用。
17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述产品为食品、保健品或药品。
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