CN104789511A - 一株具有广谱抑菌特性的植物乳杆菌ab-2及其应用 - Google Patents

一株具有广谱抑菌特性的植物乳杆菌ab-2及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有广谱抑菌特性的植物乳杆菌，该菌被命名为Lactobacillus plantarum AB-2，已于2014年09月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No.9654。本发明的植物乳杆菌在MRS液体培养基培养的条件下表现出较强的广谱抑菌特性，且该菌株有较好益生特性，其MRS发酵上清液经不同pH、过氧化氢酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后依然能表现出较好的广谱抑菌特性，最终证明其有较好的广谱抑菌特性和在人体肠道存活能力。

Description

一株具有广谱抑菌特性的植物乳杆菌AB-2及其应用
技术领域
本发明涉及一株分离自四川泡菜中的植物乳杆菌菌株(Lactobacillusplantarum AB-2)和以该菌株为发酵剂或添加剂的发酵乳制品及其它健康保健食品中的应用。
技术背景
随着公众卫生和安全意识的提升，食品安全问题被越来越多的公众所重视，因食品安全问题可能会导致重大的经济损失，严重危害人体健康和社会治安。这其中食品微生物污染问题是食品安全的主要问题之一。食品微生物的污染主要是细菌污染，特别是常见致病性的单细胞李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和伤寒沙门氏菌等细菌均能引起食源性疾病，现在这一问题已经引起了公众的注意，普通的化学药物治疗方法又易使致病菌产生抗药性、药物残留和治疗效果不佳等缺陷。乳酸菌被用于多种发酵食品加工，已被人类食用上千年，最近的研究表明乳酸菌能有效的抑制致病菌的生长，又因其具有稳定性、免疫性和安全性等优势，被认为是新型食品防腐剂和保健食品研究的重要方向。
乳酸菌对一些肠道致病菌有较好的抑制作用。这些抑制作用可能是由于产生酸性物质使不耐酸致病菌生长繁殖受到抑制；产生类似细菌素的小分子肽类使致病菌受到抑制作用；产生溶菌酶、过氧化氢等物质杀死潜在的病原菌。乳酸菌可维持人体中基本的营养物质，清除食物中的毒性物质，根除发酵食物中的病原体，清除肠道微生物产生的毒素和废物，形成生物学屏障。然而，乳酸菌想要应用于具有抑菌功能的保健品生产，还需要对其抑菌物质的稳定性和益生特性进行评价，其中稳定性包括在不同的pH、排除不稳定的抑菌物质过氧化氢和对蛋白酶的稳定性，而益生特性则是要检测其在人体内应用的可行性。
发明内容
本发明的另一目的在于提供一种新型乳杆菌菌株，其具有优异的作为益生菌基本性质的耐酸性、耐胆汁酸性、过氧化氢酶的稳定性、蛋白酶稳定性和温度稳定性。
本发明的另一目的是提供新型乳杆菌用于预防和治疗肠道疾病的组合物。
本发明的另一目的是提供新型乳杆菌广谱抑菌活性的应用。
本发明的另一目的是提供新型乳杆菌在食品防腐剂和保健食品中的应用。
本发明的另一目的是提供新型乳杆菌在农业生物农药和果蔬保鲜剂方面的应用。
本发明的另一目的是提供新型乳杆菌在整肠中的应用，具有良好的益生特性。
本发明的另一目的是提供新型乳杆菌以作为发酵剂或添加剂在发酵乳制品及其他健康保健食品中的应用。
为了实现上述目的，本发明提供一株植物乳杆菌的新菌株(L.plantarum AB-2)及其制备方法。该菌株(L.plantarum AB-2)已于2014年9月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No.9654。
本发明的植物乳杆菌(L.plantarum AB-2)是经过筛选的、从四川泡菜中分离得到的具有广谱抑菌活性的植物乳杆菌。
本发明的植物乳杆菌(L.plantarum AB-2)是通过如下方法分离得到。
a.菌株分离方法:
先将从四川采集的泡菜进行前处理，再做梯度稀释后(10-4，10-5，10-6)涂布于含有放线菌酮(0.1wt％，OXID公司)和硫酸粘菌素(0.1wt％，OXID公司)的MRS琼脂培养基或者M17琼脂培养基(OXID公司)上，30℃厌氧培养48h～72h，挑取单菌落，转接于TPY增菌培养液中，30℃培养24h～48h，划线接种于MRS琼脂培养基(OXID)，30℃培养24h～48h，观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征，并同时进行过氧化氢酶试验。将革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌，暂定为乳酸菌。将菌株接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h～48h后，做进一步鉴定和保存。
b.分子生物学鉴定:
本发明的植物乳杆菌(L.plantarum AB-2)是通过如下方法进行分子生物学鉴定的。将冷冻保存的供试菌株接种于TPY液体培养基中，30℃恒温培养24h，经TPY传代培养2～3代后，取2mL对数生长末期的菌体培养物置于无菌EP管内离心，经8000×g离心3min(4℃)后收集菌体，弃上清，采用乳酸菌专用CTAB冻融法提取菌株的基因组DNA。
采用通用引物，正向引物是27f(对应于Escherichia coil 8-27位碱基)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物是1495r(对应于Escherichia coil 1495-1515位碱基)：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，以菌体DNA为扩增模板PCR扩增16S rRNA基因区域，扩增产物经纯化后进行16S rRNA基因序列测定，然后通过基因序列比对和系统发育关系研究进行种属鉴定。所得菌株显示出了与植物乳杆菌最高的分子系统学上的亲缘关系。将上述微生物鉴定为植物乳杆菌，命名为L.plantarumAB-2。植物乳杆菌L.plantarum AB-2的系统发育树状图见图3。
c.形态学特性:
本发明的植物乳杆菌L.plantarum AB-2具有如下形态学特征:细胞呈直杆状，有圆形末端，长3.0-8.0μm，宽0.9-1.2μm，呈单个、成对，或短链状出现(见图1)，有些菌能减少硝酸盐，偶尔有些菌株表现出拟过氧化氢酶活性。
d.菌落形态特性:
本发明的植物乳杆菌L.plantarum AB-2在MRS琼脂培养基上生长形成乳白色菌落，不透明，圆形，表面光滑，中央凸起，直径约为1.2-1.5mm(见图2)。
植物乳杆菌(L.plantarum)AB-2抑菌性能测定
e.植物乳杆菌MRS发酵上清的制备方法
以广泛采集的347株植物乳杆菌作为筛选具有抑制致病菌活性植物乳杆菌的来源并进行对比，该347株植物乳杆菌由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室提供，它们分别分离自内蒙古、新疆、青海、西藏、甘肃、云南、四川以及蒙古国地区的传统发酵食品中。把冻存管中的保藏液接种到5mL的MRS液体培养基中，震荡混匀，37℃恒温培养24h，以2％的接种量连续活化三代，取第三代的发酵液以4000×g离心10min，取上清，上清液经0.22μm微膜过滤，-20℃冰箱保存备用。
f.指示菌浓度的确定：
将活化好的5株指示菌(单细胞李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7、伤寒沙门氏菌、弗氏志贺氏菌)按2％(V/V)接入各自培养基中，37℃发酵24h，使菌体充分富集，以MRS为培养基用平板计数法计数。得到计数结果后，将肠道致病菌菌液制成104、105、106、107的指示菌细胞悬液，以乳酸调节pH为4.0的MRS无细胞悬液为标准，利用打孔琼脂扩散法，确定抑菌圈最易观测的肠道致病菌的生长量作为指示菌悬液的最佳浓度，最终确定106为最佳观测浓度，指示菌菌落生长情况见表1。
表1不同浓度指示菌的抑菌效果
g.琼脂打孔扩散法测定菌株上清液抑菌活性
将指示菌菌悬液稀释到106cfu/mL，以1:100的量加到冷至45℃的灭菌MRS琼脂培养基中，摇匀后定量加入20mL/平皿，冷却制成含菌平板，在每个平板上用8mm打孔器均匀打出6个小孔并标注菌号。每孔加入100μL相对应植物乳杆菌MRS发酵上清液，于4℃冰箱中扩散12h后37℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小。
h.菌株胃肠液耐受性检测
胃肠液耐受性：活化培养两代，离心洗菌两次，收集菌体，取0.5ml复筛菌液加入到4.5mL的模拟人工胃液(pH 2.5)中，37℃消化3h，同时分别于0h和3h用MRS琼脂培养基倾注法计数测定活菌数。之后，取0.5ml已消化3h的人工含菌胃液加入到4.5ml的人工肠液中，继续于37℃水浴培养，分别于4h和8h用MRS琼脂培养基倾注法计数测定活菌数，每个样品做4个平行。
i.菌株胆盐耐受性检测
将活化好植物乳杆菌按1％接种量接入含牛胆盐(DIFCO,加拿大)MRS液体培养基中(0.3％Oxgall+0.2％巯基乙酸钠)，以不加牛胆盐的MRS为对照。将菌株置于37℃水浴培养，每小时取样于620nm测定其OD值，至OD值增加0.3个单位为止。试验菌株耐受胆盐的能力以延迟时间的长短为评价标准，其中试验组与空白组菌株OD值增加0.3个单位所需时间的差值即为延迟时间(LT,lag time)，每个菌均做三个平行。
j.pH对植物乳杆菌上清液抑菌活性的影响：
pH稳定性：将上述植物乳杆菌的MRS发酵上清液分别用5mol/LNaOH调节pH至6.0，将乳酸、乙酸调节pH至6.0作为对照，进行抑菌试验，每个抑菌圈读数三次取平均值。
k.过氧化氢酶对植物乳杆菌上清液抑菌活性的影响：
将过氧化氢酶溶解在50mmol/L的磷酸缓冲液(pH7.0)中配成母液，将过氧化氢酶加入到植物乳杆菌的MRS发酵上清液中并使其最终浓度达到5mg/mL，将其37℃水浴2h，以未处理的植物乳杆菌发酵上清为对照做抑菌试验，测定抑菌物质对过氧化氢酶的稳定性。
l.蛋白酶对植物乳杆菌上清液抑菌活性的影响：
将植物乳杆菌的发酵上清液进行胃蛋白酶、胰蛋白酶的处理，将发酵上清液分别调节pH至2.5和8.0(胃蛋白酶和胰蛋白酶的最适pH)，分别加入3mg/mL胃蛋白酶、1mg/mL胰蛋白酶，消化2h，再将pH调节至原来发酵上清液的pH，以未处理的植物乳杆菌发酵上清液为对照做抑菌试验。
本发明提供植物乳杆菌L.plantarum AB-2具有一般乳酸菌的特性，可作为发酵剂或添加剂，在发酵乳制品及其他健康保健食品中应用。
本发明的植物乳杆菌L.plantarum AB-2抑制肠道致病菌，改善宿主的肠内微生物环境，具有整肠效果。本发明的植物乳杆菌L.plantarumAB-2具有耐酸性、耐胆汁酸性、耐过氧化氢酶和蛋白酶的稳定性，能存活于包括人在内的动物的胃肠器官内，从而对宿主的健康有利的微生物。本发明的植物乳杆菌L.plantarum AB-2是具有益生菌活性的益生菌，当以干燥的细胞形态或发酵产物形态用于人或动物的情况下，能够对宿主的肠道菌群产生有利的影响。
本发明提供含有本发明植物乳杆菌的用于预防和治疗肠道疾病的组合物及其用途，能够用于预防或治疗包括人在内的哺乳动物的肠道疾病，优选为包括牛、马、猪等家畜。肠道危害细菌感染、以及炎症性肠道疾病等都包括在上述“肠道疾病”中，例如，包括由病原性微生物(大肠杆菌、沙门氏菌、梭菌等)引起的感染性腹泻、肠胃炎、炎症性肠道疾病、神经性肠炎综合症、小肠细菌过度生长、急性腹泻等，但是并不限于这些。
上述用于预防和治疗肠道疾病的组合物中含有的植物乳杆菌L.plantarum AB-2能够以活菌体或死菌体方式存在，但是优选为以活菌体方式存在。一般活菌体具有治疗并改善由肠道菌群的异常发酵而引起的诸多症状的效果，用于人以及动物时，能够密集、停留在肠内的消化管道壁上，从而起到使有害菌不能够停留的作用，并且产生乳酸来降低肠内的pH值，抑制有害细菌的繁殖。并且，所用的活菌体生成细菌素和过氧化物，从而能够抑制病原菌的繁殖，对负责吸收营养成分的肠绒毛的活动起到帮助作用。此外，能够生成帮助吸收、利用营养素的物质，对于动物来说改善其饲料转化率，还能够产生一种能够中和病原菌产生的毒性物质的物质。
对于上述本发明的用于预防或治疗肠道疾病的组合物的给药方式没有特别限定，但是优选为经口给药。虽然给药量根据肠道疾病的种类、疾病程度、年龄、性别、人种、治疗或预防目的等有所不同，但是一般情况下以成人为基础。
制备成上述各个剂型时，可以加入各个剂型的制备所需的并在药剂学可接受的载体或添加剂来制备。制备成具有典型的用于经口给药的剂型时，上述载体可以使用选自稀释剂、润滑剂、粘结剂、崩解剂、甜味剂、稳定剂以及防腐剂中的一种或多种，作为添加剂可以使用选自香料、维生素类以及抗氧化剂
上述载体以及添加剂只要是药剂学上允许使用的均可，优选地，作为稀释剂具体有乳糖、玉米淀粉、大豆油、微晶纤维素或甘露醇等，作为润滑剂有硬脂酸镁或滑石粉，作为粘合剂有聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基纤维素。此外，优选地，作为崩解剂有羧甲基纤维素钙、羧基乙酸淀粉钠、波拉克林钾或交联聚维酮，作为甜味剂有白糖、果糖、山梨醇或阿斯巴甜，作为稳定剂有羧甲基纤维素钠、环糊精、白蜡或黄原胶，作为防腐剂有对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸钾。
上述本发明的组合物可以作为食品使用。例如发酵乳制品及其他健康保健食品中，还包括人们每日经常摄取的一般的食品。用于保健功能性食品的情况下，可以和食品学上允许的载体或添加剂一起制备成本技术领域公知的常规保健功能性食品的剂型，作为所述保健功能性食品例如可以制备成散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮剂、乳剂、糖浆剂、液体剂、浸膏、茶、果冻或饮料等。上述食品学允许使用的载体或添加剂，根据需要制备的剂型可以选择使用在本技术领域允许使用的公知的任一载体或添加剂。
上述本发明的组合物还可以作为饲料添加剂或饲料来使用。上述饲料添加剂还可以使用包括选自柠檬酸、富马酸、己二酸、乳酸、苹果酸等有机酸；或膦酸钠、磷酸钾、酸性焦磷酸盐、聚磷酸盐(聚合磷酸盐)等磷酸盐；或多元酚、儿茶酸、α-生育酚、迷迭香提取物、维生素C、绿茶提取物、甘草提取物、壳聚糖、鞣酸、植酸等天然抗氧化剂中的一种或多种。作为饲料使用的情况下，可以将上述组合物制备成常规饲料形态，可以包括常规饲料成分。
m.植物乳杆菌对甜瓜疫霉菌的抑菌活性
将在PDA培养基(OXID公司)上活化好的甜瓜疫霉菌用PBS缓冲液洗下来制成105cfu/mL的孢子菌悬液，把菌悬液按1％(V/V)的量接入PDA培养基中，震荡混匀，然后把含菌培养基倒到培养皿中，制成含菌平板。
在每个平板上用7mm打孔器均匀打出2个小孔并标注植物乳杆菌的菌号，每孔加入100μL相对应植物乳杆菌MRS发酵上清液，于4℃冰箱中扩散12h后37℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小。
疫霉属真菌对农作物、果树、林木、观赏植物、草本植物和灌木都有相当大的危害，可侵染这些植物的根、根颈、叶、花、果实，引起根腐、根颈腐、果腐、溃疡、萎蔫和斑点等症状，给农业生产带来严重的损失。目前对植物卵菌病害依靠化学防治，常用杀菌剂如瑞毒霉、杀毒矾、甲霜灵等药物。这些药剂价格昂贵，长期大量施用对人和环境造成极大危害。因此开发环保、高效的生物农药具有重要意义。本发明的植物乳杆菌L.plantarum AB-2能够抑制甜瓜疫霉菌活性，为开发生物农药提供了可能。
因此，本发明提供植物乳杆菌L.plantarum AB-2在开发生物农药中的应用。本发明提供植物乳杆菌L.plantarum AB-2和包含植物乳杆菌L.plantarum AB-2的组合物可用于阻止或消除甜瓜疫霉菌引起的植物疾病或危害。
本发明含有植物乳杆菌L.plantarum AB-2农药组合物可根据施用加工成各种剂型，如粉剂、可湿性粉剂、可溶性粉剂、乳剂、乳油、浓乳剂、乳膏、糊剂、胶体剂、熏烟剂、熏蒸剂、烟雾剂、油剂、颗粒剂、微粒剂等。
本发明的植物乳杆菌L.plantarum AB-2及与之相关的技术方案带来如下有益效果：
(1)所述植物乳杆菌L.plantarum AB-2能抑制五种致病菌(大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单细胞李斯特氏菌)的生长；
(2)植物乳杆菌L.plantarum AB-2在模拟胃肠液中有较高的存活率；
(3)植物乳杆菌L.plantarum AB-2为胆盐抗性菌株；
(4)植物乳杆菌L.plantarum AB-2发酵上清pH调到6.0时，有较好的抑菌活性；
(5)植物乳杆菌L.plantarum AB-2发酵上清经过氧化氢酶处理后保持抑菌活性；
(6)植物乳杆菌L.plantarum AB-2发酵上清经蛋白酶处理后保持抑菌活性；
(7)植物乳杆菌L.plantarum AB-2能抑制甜瓜疫霉菌的生长。
附图说明
图1L.plantarum AB-1菌落形态图片
图2L.plantarum AB-1菌体显微镜图片(X1000)
图3L.plantarum AB-2系统发育树状图
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，以下实施例仅为说明性的，本发明并不受这些实例的限制。
本发明中的试验菌株：所用的347株植物乳杆菌由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室分离、鉴定并保存，它们分别分离自内蒙古、新疆、青海、西藏、甘肃、云南、四川以及蒙古国地区的传统发酵食品中，347株植物乳杆菌的16S核糖体RNA信息都已上传到NCBI数据库。
甜瓜疫霉菌(Phytophthora drechsleri Tucker)由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室提供，以上菌株面向公众开放。
本发明涉及以下培养基：
MRS琼脂培养基的组成是：大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、Tweeen 801ml、磷酸二氢钠2g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三胺2g、硫酸锰0.02g、硫酸镁0.1g，蒸馏水1L，调节pH至6.2左右，琼脂15g，121℃、15min灭菌后倒到培养皿形成平板。
MRS液体培养基：大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、Tweeen 801ml、磷酸二氢钠2g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三胺2g、硫酸锰0.02g、硫酸镁0.1g，蒸馏水1L，调节pH至6.2左右，121℃、15min灭菌。
M17培养基的组成是：胰蛋白胨5g、大豆蛋白胨5g、肉蛋白胨5g、酵母粉2.5g、抗坏血酸0.5g、硫酸镁0.25g、二钠甘油19g、琼脂11g、蒸馏水1L。
TPY增菌培养液的组成是：乳糖10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、酪蛋白胨10g、大豆蛋白胨5g、磷酸氢二钾2.5g、磷酸二氢钾2.5g、硫酸镁0.1g、吐温800.25g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、蒸馏水1L，121℃、15min灭菌。
LB液体培养基的组成是：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L，调节pH至7.0左右，121℃、15min灭菌。
NB液体培养基的组成是：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、氯化钠5g/L，调节pH至7.4左右，121℃、15min灭菌。
BHI液体培养基的组成是：合成的脑心浸提液培养基(OXID公司)37g/L，调节pH至7.4左右，121℃、15min灭菌。
TSB液体培养基的组成是：胰蛋白胨17g/L、植物蛋白胨3g/L、氯化钠5g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、葡萄糖2.5g/L，调节pH至7.3左右，121℃、15min灭菌。
实施例1：L.plantarum AB-2抑菌活性测定
植物乳杆菌发酵上清液的制备方法：把冻存管中的保藏的植物乳杆菌L.plantarum AB-2和其它植物乳杆菌的保藏液接种到5mL的MRS液体培养基中，震荡混匀，37℃恒温培养24h，以2％的接种量连续活化三代，取第三代植物乳杆菌的发酵液以4000×g离心10min，取上清，上清液经0.22μm微膜过滤，-20℃冰箱保存备用。
指示菌：以大肠杆菌O157:H7(Escherchia coli O157:H7)、鼠伤沙门氏菌(Salmonella typhimurium ATCC13311)、弗氏志贺氏菌(Shigellaflexneri CMCC 51592)、金黄色葡萄球(Staphylococcus aureusATCC12600)、单细胞里斯特氏菌(Listeria monocytogenes ATCC15313)等5株肠道致病菌为指示菌。用不同的液体培养基活化指示菌，LB液体培养基用于肠杆菌O157:H7的活化和传代；NB液体培养基用于鼠伤沙门氏菌、弗氏志贺氏菌的活化和传代；BHI液体培养基用于单细胞里斯特氏菌的活化和传代；TSB液体培养基用于金黄色葡萄球菌的活化和传代，以2％的接种量连续活化三代用于抑菌试验。
体外抑菌试验-琼脂打孔扩散法：将5株指示菌菌悬液稀释到106cfu/ml以1:100的量加到冷至45℃的灭菌MRS液体培养基中，摇匀后定量加入20mL/平皿，冷却制成含菌平板，在每个平板上用8mm打孔器均匀打出6个小孔并标注菌号。每孔加入100μL相对应植物乳杆菌MRS发酵上清液，于4℃冰箱中扩散12h后37℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小。用游标卡尺测量菌株的抑菌圈大小。选择具有广谱抑菌活性的31株植物乳杆菌作为复筛菌株(如表3)。347株植物乳杆菌的MRS上清液的抑菌情况统计结果如表2，L.plantarum AB-2和其它30株具有广谱抑菌活性植物乳杆菌的MRS发酵上清液的抑菌效果比较结果见表3。
表2347株植物乳杆菌的MRS上清液的抑菌情况
注:‘高’、‘低’和‘不抑制’分别表示的抑菌圈大小为>12mm,8-12mm和<8mm。
表3L.plantarum AB-2和其它30株植物乳杆菌抑菌圈直径(n＝3,)
注：“-”表示没有抑菌效果。(打孔器直径为8mm)
从表2中可知，L.plantarum AB-2是347株植物乳杆菌中少数能兼具抑制5株指示菌的具有广谱抑菌活性的菌株。从表3中可知，L.plantarumAB-2的MRS发酵上清液对5株指示菌都有抑菌活性，且对大肠杆菌O157:H7(Escherchia coli O157:H7)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneriCMCC 51592)、单细胞里斯特氏菌(Listeria monocytogenes ATCC15313)的抑菌圈都大于30.06±7.07mm，表现出有最强的抑菌活性，对鼠伤沙门氏菌(Salmonella typhimurium ATCC13311)和金黄色葡萄球(Staphylococcus aureus ATCC12600)的抑菌圈分别为17.90±0.01和20.57±0.89mm，综合该菌对5株指示菌的抑菌情况与其它30株具有广谱抑菌活性的菌株的比较可知，L.plantarum AB-2是具有广谱抑菌活性的优良菌株，其广谱抑菌效果优于其他菌株。L.plantarum AB-2的不仅能抑制革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、单细胞里斯特氏菌)，还能抑制革兰氏阴性菌(大肠杆菌O157:H7、鼠伤沙门氏菌、弗氏志贺氏菌)的生长，表现出较强的广谱抑菌活性。
实施例2：L.plantarum AB-2胃肠液耐受性
将PBS灭菌后，用1mol/L HCL调节pH值至2.5，加入3.0mg/ml胃蛋白酶(Sigma，美国)，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制成模拟人工胃液；将PBS灭菌后，用0.1mol/L NaOH调节pH值至8.0，加入0.1wt％胰蛋白酶(Sigma，美国)和1.8wt％牛胆盐(DIFCO，加拿大)，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制成人工模拟胰液。
将实施例1中的复筛菌株(即表3涉及的具有广谱抑菌活性的31株植物乳杆菌)活化培养两代，离心洗菌两次，收集菌体，取0.5ml复筛菌液加入到4.5mL的模拟人工胃液(pH 2.5)中，37℃消化3h，同时分别于0h和3h用MRS琼脂培养基倾注法计数测定活菌数。之后，取0.5mL已消化3h的人工含菌胃液加入到4.5mL的人工肠液中，继续于37℃水浴培养，分别于4h和8h用MRS琼脂培养基倾注法计数测定活菌数。
菌株存活率计算公式
N1――菌株处理后活菌数；
N0――菌株初始活菌数。
L.plantarum AB-2对胃肠液中的存活率如表4所示，在模拟胃液(pH2.5)中存活3h后的活菌数呈现下降的趋势，在3h时的存活率为82.27±1.17％，表现出对模拟胃液有较好的耐受性。L.plantarum AB-2菌株从pH 2.5人工胃液中37℃保持3h后，转入pH 8.0的人工肠液中保持8h，其结果如表4所示。
表4L.plantarum AB-2在模拟胃肠液中的存活率
从表4中看出在pH 8.0的人工肠液中该菌株存活率的存活率较胃液中高，4h时的存活率为79.78±0.79％，保持至8h时该菌株存活率为74.75±1.54％，呈现出一定的稳定性。证明L.plantarum AB-2有较好的胃肠液耐受性。
实施例3：L.plantarum AB-2胆盐耐受性
将活化好的L.plantarum AB-2的发酵液(如实施1中的制备方法)按1wt％接种量接入含牛胆盐MRS液体培养基中(0.3wt％Oxgall+0.2wt％巯基乙酸钠)，以不加牛胆盐(DIFCO，加拿大)的MRS为对照。将菌株置于37℃水浴培养，每小时取样于620nm测定其OD值，至OD值增加0.3个单位为止。试验菌株耐受胆盐的能力以延滞期的长短为评价标准，其中试验组与空白组菌株OD值增加0.3个单位所需时间的差值即为延滞时间(LT，lag time)(表5)。
表5L.plantarum AB-2在胆盐溶液中的延迟时间(h)
由表5可知，L.plantarum AB-2的延迟时间为0.23h，根据Gilliland etal.(1984)的判定方法，菌株L.plantarum AB-2为胆盐抗性菌株，对胆盐有较好的耐受性。
实施例4：L.plantarum AB-2抑菌活性对pH的稳定性测定
将如实施例1制备的植物乳杆菌的MRS发酵上清液分别用5mol/LNaOH调节pH至6.0，将乳酸、乙酸调节pH至6.0作为对照，进行抑菌圈的测定和结果的测量，每个抑菌圈读数三次取平均值。抑菌圈的大小见表6。
表6L.plantarum AB-2经不同处理后的抑菌圈大小(mm)
由表6可知，L.plantarum AB-2对于5株指示菌的抑菌圈直径与原液的抑菌直径相比变化不显著(P>0.05)，证明其发酵上清液对pH 6.0的条件有较好的耐受性。
实施例5：L.plantarum AB-2发酵上清的过氧化氢酶稳定性
将过氧化氢酶溶解在50mmol/L的磷酸缓冲液(pH7.0)中配成母液，将过氧化氢酶加入到如实施例1制备的L.plantarum AB-2的MRS发酵上清液中并使其最终浓度达到5mg/mL，将其37℃水浴2h，以未处理的植物乳杆菌发酵上清液为对照做抑菌试验，测定其过氧化氢酶的稳定性，菌株经处理后的发酵上清液的抑菌圈的大小见表5。
由表6可知，经过氧化氢酶处理后，L.plantarum AB-2对于5株指示菌的抑菌圈直径与原液的抑菌直径相比变化不显著(P>0.05)，证明其发酵上清液中对致病菌有抑制作用的抑菌物质不是过氧化氢，且抑菌物质对过氧化氢酶有耐受性。
实施例6：L.plantarum AB-2发酵上清的蛋白酶稳定性测定
将如实施例1制备的植物乳杆菌的发酵上清液用胃蛋白酶、胰蛋白酶处理，将发酵上清液分别调节pH至2.5和8.0(胃蛋白酶、胰蛋白酶的最适pH)，分别加入一定量的3mg/mL胃蛋白酶、1mg/mL胰蛋白酶，消化2h，再将pH调节至原来发酵上清液的pH，以未处理的植物乳杆菌发酵上清液为对照做抑菌试验，以测定抑菌物质对蛋白酶的稳定性，分别经胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后上清液的抑菌圈大小见表6。
由表6可知，该菌的上清液分别经过胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后，对5株指示菌的抑菌圈大小跟原液相比变化不显著(P>0.05)，证明其抑菌物质不会被蛋白酶破坏，对蛋白酶有较好的稳定性。
实施例7：L.plantarum AB-2发酵上清对温度的稳定性测定
对如实施例1制备的菌株的MRS发酵上清液进行热稳定性的研究，将发酵上清液加热至100℃保持20min，以未处理的植物乳杆菌发酵上清液为对照做对于5株指示菌的抑菌试验，抑菌圈大小如表6所示。
由表6可知，菌株的发酵上清液经100℃加热20min后，除对单细胞里斯特氏菌外，对大肠杆菌O157:H7、弗氏志贺氏菌、鼠伤沙门氏菌和金黄色葡萄球的抑菌圈大小与原液相比变化不显著(P>0.05)，表现出对热较强的稳定性，抑菌作用可以在100℃的条件下发挥作用。
实施例8：L.plantarum AB-2对甜瓜疫霉菌的抑制活性测定
甜瓜疫霉菌(Phytophthora drechsleri Tucker)(由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室提供)，培养基为PDA(PotatoDextrose Agar)培养基。
将在PDA培养基上活化好的甜瓜疫霉菌用PBS缓冲液洗下来制成105cfu/mL的孢子菌悬液，把菌悬液按1％(V/V)的量接入PDA培养基中，震荡混匀，然后把含菌培养基倒到培养皿中，制成含菌平板。
在每个平板上用7mm打孔器均匀打出2个小孔并标注植物乳杆菌的菌号，每孔加入100μL相对应植物乳杆菌MRS发酵上清液(制备方法参照实施例1)，于4℃冰箱中扩散12h后37℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小。
如表7所示，利用琼脂扩散法检测到L.plantarum AB-2对甜瓜枯萎的抑菌圈大小分别为33.51±0.13mm，如表8所示，在347株L.plantarum的抑霉菌数据中属于较高水平，此结果表明该菌株在抑制霉菌生长的方面具有一定的开发价值。
表7L.plantarum AB-2对甜瓜疫霉菌的抑菌圈大小(mm)
表8347株植物乳杆菌对甜瓜疫霉抑菌情况统计
注：“高”、“低”、“不抑制”分别代表抑菌圈>30.00mm、8-30mm和<8mm
综上所述，本发明的植物乳杆菌L.plantarum AB-2具有较强的广谱抗菌性，能抑制五种致病菌(大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单细胞李斯特氏菌)的生长，在抗菌添加剂领域具有应用前景；能抑制甜瓜疫霉菌的生长，能够以农药组合物的形式用于抑制作物病害；在模拟胃肠液、胆盐和多种蛋白酶中具有抗性，因此适合应用到食品或食品添加剂中，因而具有显著开发价值。

Claims (9)

1.一株具有广谱抑菌特性的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AB-2，已于2014年9月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No.9654。
2.含有权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AB-2的组合物。
3.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AB-2在抑制致病菌中的应用，所述细菌为：
(1)大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌或单细胞李斯特氏菌；或者
(2)甜瓜疫霉菌。
4.权利要求1所述的植物乳杆菌在食品防腐剂中的应用。
5.权利要求1所述的植物乳杆菌在农业生物农药或果蔬保鲜剂中的应用。
6.权利要求1所述的植物乳杆菌作为发酵剂或食品添加剂在保健食品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述保健食品是发酵食品。
8.权利要求1所述的植物乳杆菌在制备预防或治疗肠道疾病的药物中的用途。
9.权利要求1所述的植物乳杆菌在动物饲料中的应用。
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