CN105087423B - 新型贝莱斯芽孢杆菌cjbv及含有其的抗菌组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种保藏号为KCCM11528P的新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV(Bacillus velezensis CJBV)菌株、从其分离的芽孢菌霉素D类似物以及利用其的抗菌组合物，新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV及所述菌株产生的芽孢菌霉素D类似物对1种以上不同种类的真菌类及细菌具有抗菌效果，能够作为植物及作物用抗菌剂、具有抗菌活性的食品以及预防、改善和治疗细菌感染疾病的饲料、保健食品、准药品、医药品使用。

Description

新型贝莱斯芽孢杆菌CJBV及含有其的抗菌组合物
技术领域
本发明涉及一种对真菌类及引起食物中毒的细菌有特定抗菌活性的新型贝莱斯芽孢杆菌CJBV(Bacillus velezensis CJBV)菌株、利用从所述菌株分离的芽孢菌霉素D类似物的抗菌组合物，以及含有所述抗菌组合物并用于预防和治疗细菌感染疾病的药物组合物。
背景技术
以传统方法制造发酵大豆食品时，因其属于利用微生物的食品，所以微生物中含有的有害菌极有可能引起食物中毒，使人体处于危险之中。然而，通常的杀菌方法很难彻底杀灭病原性真菌类及引起食物中毒的细菌等有害菌，其产生毒性物质，进而引起食物中毒。
因此，使用化学保存剂或防腐剂，防止变质或腐烂，并长期保持所述食品等的品质。但是，化合物本身有可能会起到环境激素的作用，或者存在引起皮肤过敏的危险性，所以消费者对化学保存剂或防腐剂越来越反感。
天然保存剂作为能够阻碍腐败菌生长的微生物或其代谢产物，越来越受到人们的关注。其中，细菌素(Bacteriocin)或类细菌素(Bacteriocin-like substances)作为能够用于保存剂的天然抗菌物质之一，备受人们的关注。细菌素是一种天然无毒防腐剂，是一种抗菌蛋白，由革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌产生的蛋白质或蛋白质和碳水化合物组成。尤其，随着美国食品药品监督管理局于1998年批准涂抹型再制干酪食品中使用作为细菌素的乳酸链球菌肽(nisin)，细菌素被认为是一种可以在食品工业中使用的抗菌剂。
人们对芽孢杆菌属或乳酸菌生成的所述抗菌物质的研究非常活跃，芽孢杆菌菌株产生的细菌素与能够抑制革兰氏阳性菌生长的乳酸菌细菌素不同，其抗菌活性范围广，具有多种特性。
具体而言，芽孢杆菌属能够产生多种抗菌物质(Sholberg et al.,1995Can.J.Microbio.41,247-252)，已有报告的抗菌物质有抗霉枯草菌素(mycosubtilin)、抗真菌素(eumycin)、芽孢菌霉素(bacillomycin)、表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)家族、aminopolyol物质、脂蛋白(lipoprotein)等，已有报告的同时具有抗细菌和抗真菌活性的物质有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)产生的杆菌溶素(bacilysin)。
有关的先前技术文献，即，据韩国专利10-2013-0008673记载，芽孢菌霉素D1为解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens GYL4)产生的抗菌物质，对植物病原真菌有广泛的活性。
另外，据韩国专利10-2013-0025453记载，新型抗菌物质UV254-B为枯草芽孢杆菌产生的抗菌物质，其完全不同于含有芽孢菌霉素的伊枯草菌素物质，只对引起食物中毒的细菌——蜡样芽胞杆菌及单核细胞增多性李斯特氏菌表现出特定的抗细菌活性。
但是，根据已有报告，只有关于细菌素对特定微生物抗菌活性的报告，暂时没有对引起各种作物的病害以及包括食物中毒在内的细菌感染疾病在内的各种病原菌有关的报告。而且，所述文献中记载的解淀粉芽孢杆菌为发酵食品中对酱类发酵有益的细菌，在将细菌素应用于发酵大豆食品时，很难认为其只对引起食物中毒的真菌类及细菌类具有特定的活性，因此存在很难直接用于发酵食品的问题。
因此，本发明人致力于研究一种既对人体无害，同时又能抑制各种真菌类及细菌类的方法，经过不懈努力，确认传统酱曲中分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV不仅对病原性霉菌、酵母等一种以上的各种真菌类具有抗菌活性，而且对酱类发酵细菌不具有抗菌活性，只对引起食物中毒的细菌等食品中主要有害细菌具有特定的抑制作用和抗菌活性，据此完成本发明。
发明内容
(要解决的技术问题)
本发明的主要目的在于，提供一种新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV菌株，其对真菌类及引起食物中毒的细菌具有特定抗菌活性。
本发明的另一目的在于，提供一种所述贝莱斯芽孢杆菌CJBV菌株产生的芽孢菌霉素D类似物。
本发明的另一目的在于，提供一种利用所述贝莱斯芽孢杆菌CJBV菌株及所述芽孢菌霉素D类似物的抗菌组合物。
本发明的另一目的在于，提供一种含有所述抗菌组合物的食品组合物。
本发明的另一目的在于，提供一种含有所述抗菌组合物的饲料组合物。
本发明的另一目的在于，提供一种含有所述抗菌组合物的植物及作物用抗菌剂。
本发明的另一目的在于，提供一种植物病原性真菌防治方法，其包括使用抗菌剂对植物体或土壤进行处理的步骤。
本发明的另一目的在于，提供一种预防和治疗细菌感染疾病的药物组合物，其含有所述抗菌组合物。
本发明的另一目的在于，提供一种预防和改善细菌感染疾病的保健食品，其含有所述抗菌组合物。
本发明的另一目的在于，提供一种含有所述抗菌组合物的准药品。
(解决问题的手段)
作为实现所述目的的本发明的一个方面，本发明提供一种新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV(Bacillus velezensis CJBV)菌株，其对真菌类及引起食物中毒的细菌具有特定抗菌活性，保藏号为KCCM11528P。
在本发明中，术语——芽孢杆菌是一种自然界中分布广泛的好氧性或兼性厌氧性革兰氏阳性杆菌属，芽孢杆菌属的细菌有贝莱斯芽孢杆菌等。本发明人通过如下方法查明对真菌类及引起食物中毒的细菌具有特定抗菌活性的新型菌株，其作为芽孢杆菌属的细菌，属于贝莱斯芽孢杆菌。
首先，从传统酱曲中分离芽孢杆菌菌株后，对病原性霉菌、酵母等真菌类及引起食物中毒的细菌类进行验证，从中筛选具有很强的抗菌活性的菌株，然后进行16S rDNA及gyrA基因序列分析，对筛选的菌株进行鉴别。将所述筛选菌株的16S rDNA基因序列标记为序列号1，其表现出了与贝莱斯芽孢杆菌99％的同源性。另外，将所述筛选菌株的gyrA基因序列标记为序列号2，其与贝莱斯芽孢杆菌表现出了100％同源性(实施例1)。据此，将所述菌株鉴别为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，命名为贝莱斯芽孢杆菌CJBV，并于2014年4月17日，在隶属于布达佩斯条约的国际保藏机构——韩国微生物保藏中心(KCCM)保藏，其保藏号为KCCM11528P(实施例1)。
因此，所述贝莱斯芽孢杆菌CJBV具有标记为序列号1的16s rDNA序列。
根据本发明的一个方面，所述新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV不仅对植物病原性霉菌及酵母等真菌具有优秀的抗菌活性，还能抑制引起食物中毒的细菌，表现出了对各种真菌类及引起食物中毒的细菌同时起作用的抗菌活性(实施例3,图3及图4)。
作为一个具体实施例，所述真菌类是选自由炭疽病菌(Colletotrichumorbiculare)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum、白色念珠菌(Candida albicans)及拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)组成的组的病原性真菌，但并不限于此。
在本发明中，术语——炭疽病菌是指对黄瓜、香瓜、西瓜等葫芦科作物引起炭疽病(Anthracnose)的真菌。
在本发明中，术语——尖孢镰刀菌是指对黄瓜、香瓜、西瓜等葫芦科作物引起枯萎病(Fusarium wilt)的病原性真菌。
本发明人已确认新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV对所述炭疽病菌及尖孢镰刀菌具有抗菌效果，所述新型菌株抑制黄瓜、香瓜、西瓜等葫芦科作物的炭疽病及枯萎病等植物传染病，可以用于制造防治植物病的微生物制剂。
因此，作为环保无公害的生物农药使用贝莱斯芽孢杆菌CJBV时，有利于解决有机合成农药导致的生态破坏和毒性问题，减轻农户的经济负担。而且，由于微生物的可持续特性，能够长期受益。
另外，所述生物农药可以定义为，为了防治植物病原菌而从自然环境中分离采集微生物并实现产品化的农药。
在本发明中，术语——白色念珠菌是属于半知菌类的真菌的属名，引起皮肤真菌病、念珠菌性口腔炎、肠道疾病、念珠菌性阴道炎(Candida vaginitis)等疾病。尤其，念珠菌性阴道炎是一种常见疾病，约75％的女性一生中阴道和外阴部至少感染一次，约45％的女性每年复发2次以上，大部分都是因为白色念珠菌而引起。当女性荷尔蒙分泌紊乱或免疫力极度降低时，健康人体的口腔、肠道、阴道等正常拥有的白色念珠菌容易受到感染。
本发明人已确认新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV对所述白色念珠菌具有抗菌效果，利用所述新型菌株，能够有效预防和治疗皮肤真菌病、念珠菌性阴道炎、细菌感染性口腔炎以及肠道疾病。
在本发明中，术语——拜耳接合酵母是一种属于酵母属的酵母，其作为腐败性酵母，在饮料产品及淀粉加工产品中发生酒精发酵的同时产生大量的二氧化碳气体，降低食品的品质。
本发明人已确认新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV对所述拜耳接合酵母具有抗菌效果，利用所述新型菌株，能够提高饮料产品及淀粉加工产品等食品的保质期，预防和治疗由此可能引起的食物中毒等细菌感染疾病。
作为另一个具体实施例，所述引起食物中毒的细菌可以是蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)或单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，但并不限于此。
在本发明中，术语——蜡样芽胞杆菌是一种革兰氏阳性菌，形成耐热孢子，感染时引起腹泻和呕吐。作为好氧性细菌，存在于土壤、谷物等，自然界中分布广泛。该菌株的孢子相比于其他菌株的孢子，其表面粘附性强，具有很难清洗和消毒的特点。而且，所述蜡样芽胞杆菌在料理后放置数小时的肉菜、蔬菜、米饭及面食中因孢子发芽而繁殖，而在低温杀菌后的牛奶、奶酪等中同样有可能发芽产生耐热性肠毒素，并且对高温表现出抗性，极难抑制。
本发明人已确认新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV所述蜡样芽胞杆菌具有抗菌效果，利用所述新型菌株，能够预防感染引起的食物中毒、腹泻或呕吐。
在本发明中，术语——单核细胞增多性李斯特氏菌是一种人畜共患传染病原菌，有可能通过牛奶或奶酪等畜牧产品传染给人体，是最近在全世界都在关注的食源性致病菌之一。一旦感染所述菌，将会引起李氏杆菌病，其死亡率高达约30％。尤其，人体感染的情况下，婴幼儿、器官移植患者、淋巴瘤、AIDS患者等免疫力低或存在免疫缺陷的人容易感染，有可能引起败血症、脑炎及脑膜炎。据悉，所述病原菌不同于其他病原性细菌，具有在低温下也能生长的特点，相比于37℃下生长的菌，4℃下生长的菌病原性更强。因该菌的此种特性，在家里认为安全的冷藏食物、冷藏食品或保藏食品同样有可能引起单核细胞增多性李斯特氏菌导致的食物中毒，成为了严重的问题。
本发明人已确认新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV对所述单核细胞增多性李斯特氏菌具有抗菌效果，利用所述新型菌株，能够预防和治疗食物中毒、李氏杆菌病等细菌感染疾病。
特别是，本发明人已确认所述新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV不仅对所述蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)具有同时抑制的效果，而且对发酵食物有益的酱类发酵细菌——枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)不具有抗菌活性(实施例3,图4)。
作为另一个具体实施例，所述贝莱斯芽孢杆菌CJBV能够生成和分泌抗生物质——芽孢菌霉素D(Bacillomycin D)以及由式1表达的芽孢菌霉素D类似物(analogue)，即选自由C14-芽孢菌霉素D、C15-芽孢菌霉素D和C16-芽孢菌霉素D组成的组的一个以上芽孢菌霉素D类似物。
[式1]
所述式中，在C14-芽孢菌霉素D中，所述R为CH3，在C15-芽孢菌霉素D中，所述R为CH2-CH3，在C16-芽孢菌霉素D中，所述R为CH2-CH2-CH3。
在本发明中，术语——芽孢菌霉素D是一种属于环肽(cyclic peptide)组之一的伊枯草菌素系物质，由7个-氨基酸(2Asx,Glx,Tyr,Pro,Ser,Thr)和1个-氨基酸组成的环结构，具有抗生活性。
本发明人对新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV产生和分泌的抗菌物质进行分离萃取后对其进行紫外光谱和分子量测量的结果，确认分离萃取的物质为所述芽孢菌霉素D的3种类似物(实施例2,图1及图2)。
作为实现所述目的的本发明的另一个方面，本发明提供一种所述新型贝莱斯芽孢杆菌CJBV菌株产生的芽孢菌霉素D类似物。
所述芽孢菌霉素D类似物由如下式1表达。
[式1]
所述式中，所述R为CH3、CH2-CH3及CH2-CH2-CH3，所述R为CH3时命名为C14-芽孢菌霉素D，所述R为CH2-CH3时命名为C15-芽孢菌霉素D，所述R为CH2-CH2-CH3时命名为C16-芽孢菌霉素D。
本发明人对新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV产生和分泌的抗菌物质进行分离萃取后对其进行紫外光谱和分子量测量的结果，确认分离萃取的物质为所述芽孢菌霉素D的3种类似物(实施例2,图1及图2)。
利用所述新型贝莱斯芽孢杆菌CJBV菌株产生的芽孢菌霉素D类似物，对引起炭疽病的炭疽病菌、引起枯萎病的包括尖孢镰刀菌在内的植物病原菌、感染时引起皮肤真菌病、念珠菌性阴道炎、肠炎和口腔炎等疾病的白色念珠菌、作为腐败性酵母的拜耳接合酵母、引起食物中毒的细菌蜡样芽胞杆菌及单核细胞增多性李斯特氏菌进行处理的结果，确认对所述真菌及细菌具有很强的抗菌效果(图3及图4)。因此，所述新型贝莱斯芽孢杆菌CJBV菌株产生的芽孢菌霉素D类似物能够作为抗菌组合物使用，可以有效应用于预防、改善和治疗细菌感染疾病的饲料、药物组合物、保健食品、准药品组合物、具有抗菌活性的食品、植物及作物用抗菌剂，以及利用其的防治方法。
作为实现所述目的的本发明的另一个方面，本发明提供一种抗菌组合物，其含有选自由所述新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV菌株、所述菌株的孢子、所述菌株的培养物及其浓缩物、萃取物和干燥物形成的组的一个以上有效成分。菌株的状态可以是液态或固态，但并不限于此。
在本发明中，术语——“孢子”是指细菌等的繁殖细胞，根据本发明的目的，所述孢子指贝莱斯芽孢杆菌CJBV的繁殖细胞。在本发明中，所述贝莱斯芽孢杆菌CJBV的孢子对真菌及引起食物中毒的细菌表现出抗菌活性，可以应用于植物病防治用微生物制剂、具有抗菌活性的食品、饲料、药品、准药品及保健食品。
在本发明中，术语——“培养物”是指培养所述菌株获得的产物，可以是包括菌体的培养原液，也可以是培养菌株、沥除培养上清液后或浓缩后的菌体。所述培养物的成分除了通常芽孢杆菌培养所需的成分以外，还可以增加有利于芽孢杆菌生长的成分，具体可由本技术领域的从业人员任意选择。
在本发明中，术语——“浓缩物”是指浓缩的所述培养物。
在本发明中，术语——“萃取物”是指从所述培养物或其浓缩物萃取的产物，只要是对本发明的真菌类及引起食物中毒的细菌有特定的抗菌效果的萃取物即可，具体不限定，可以包括萃取液、萃取液的稀释液或浓缩液，以及对萃取液进行干燥获得的干燥物或其粗制品、精制品或对其进行馏分获得的馏分物。
在本发明中，术语——“干燥物”是指对所述培养物或其浓缩物、萃取物或馏分物进行干燥获得的产物。干燥方法可以采用通风干燥、自然干燥、喷雾干燥及冷冻干燥等方法，但并不限于此。
本发明新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV可以通过通常的芽孢杆菌菌株培养方法进行培养，但并不限于此。培养基可以采用天然培养基或合成培养基。培养基的碳源可以使用诸如葡萄糖、蔗糖、糊精、甘油、淀粉等，氮源可以使用蛋白胨、肉类萃取物、酵母萃取物、烘干的酵母、大豆、氨盐、硝酸盐及其他有机或无机含氮化合物，但并不限于这些成分。培养基中包含的无机盐可以使用镁、锰、钙、铁、磷等，但并不限于此。所述碳源、氮源及无机盐成分以外，还可以在培养基中添加氨基酸、维他命、核酸及相关化合物。
所述抗菌组合物可以含有培养贝莱斯芽孢杆菌CJBV过程中生成的其他副产物。
作为实现所述目的的本发明的另一个方面，本发明提供一种含有所述抗菌组合物的食品组合物。
所述食品种类并无特别限制，包括所有通常意义上的食品。能够添加所述物质，无限制的食品有肉类、香肠、面包、巧克力、糖果类、点心类、饼干类、比萨、方便面、其他面类、口香糖类、包括冰激凌类的乳制品、各种汤类、饮料、茶、保健饮料、酒精饲料及复合维生素等。所述组合物作为食品添加剂使用时，既可以直接添加所述组合物，也可以与其他食品或食品成分一起使用，只要按照通常方法合理使用即可。
所述食品组合物可以包含食品学上允许使用的载体。
特别是，本发明人已确认所述新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV不仅对作为腐败性酵母的拜耳接合酵母、引起食物中毒的细菌——蜡样芽胞杆菌、单核细胞增多性李斯特氏菌具有同时抑制的效果，而且对发酵食物有益的酱类发酵细菌——枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)不具有抗菌活性(实施例3,图4)，可将所述抗菌组合物用于包括发酵食品在内的所有食品。
作为实现所述目的的本发明的另一个方面，本发明提供一种含有所述抗菌组合物的饲料组合物。
在本发明中，术语——“饲料”是指为了使动物食用和摄取、消化而提供的任意天然或人工定量餐或一次性餐等或者所述一次性餐的成分。
所述饲料并无特别限制，可以使用相应领域通常使用的饲料。所述饲料组合物可以包括饲料添加剂。本发明的饲料添加剂相当于饲料管理法中的辅助饲料，可以包含益生菌。无限制的所述饲料有谷物类、根果类、食品加工副产物类、藻类、纤维质类、制药副产物类、油脂类、淀粉类、葫芦类或谷物副产物类等植物性饲料；蛋白质类、无机物类、油脂类、矿物类、单细胞蛋白质类、浮游生物类或食物等动物性饲料等。这些饲料，可以单独使用或2种以上饲料混合使用。
此时，本发明的含有抗菌组合物的饲料组合物还可以含有赋形剂、稀释剂、添加剂。
已确认本发明新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV对作为腐败性酵母的拜耳接合酵母、引起食物中毒的细菌——蜡样芽胞杆菌、单核细胞增多性李斯特氏菌同时具有抑制效果。本发明提供具有抗菌及抗真菌性饲料组合物，能够预防家畜食物中毒在内的细菌感染疾病。
作为实现所述目的的本发明的另一个方面，本发明提供一种含有所述抗菌组合物的植物及作物用抗菌剂。
本发明人已确认新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV对包括引起炭疽病的炭疽病菌、引起枯萎病的尖孢镰刀菌等在内的植物病原菌具有抑制效果(图3)。本发明的抗菌组合物可作为环保无公害的生物农药使用，有利于解决有机合成农药导致的生态破坏和毒性问题，减轻农户的经济负担。而且，由于微生物的可持续特性，能够长期受益。
作为实现所述目的的本发明的另一个方面，本发明提供一种植物病原性真菌防治方法，其包括使用抗菌剂对植物体或土壤进行处理的步骤。
优选地，所述植物病原性真菌是引起炭疽病的炭疽病菌、引起枯萎病的尖孢镰刀菌，但并不限于此。
优选地，在种植作物前翻耕土壤时，或者种植后15日后开始，或雨季或发病前，通过植物体地面部分的叶面喷施或植物体根部灌药等方法进行杀虫。但并不限于此。
作为实现所述目的的本发明的另一个方面，本发明提供一种含有所述抗菌组合物的预防和治疗细菌感染疾病的药物组合物。
在本发明中，术语——“预防”是指向个体使用根据本发明的预防和治疗细菌感染疾病的组合物，以此抑制或延迟细菌感染疾病发病的所有行为。
在本发明中，术语——“治疗”是指向疑似患上细菌感染疾病的个体使用根据本发明的所述组合物，使症状得到好转或缓解的所有行为。
在本发明中，术语——“改善”是指至少减轻与治疗有关的参数，例如症状程度的所有行为。
在本发明中，术语——“个体”是指细菌感染疾病已发病或有可能发病的包括人类在内的所有动物。
此时，细菌感染疾病是细菌感染引起的疾病，优选地，细菌感染疾病是由于感染真菌类或引起食物中毒的细菌而引起的疾病。
作为一个例子，所述真菌类可以选自由炭疽病菌、番茄枯萎病JCM12575、白色念珠菌及拜耳接合酵母组成的组。
作为另一个例子，所述引起食物中毒的细菌可以是蜡样芽胞杆菌或单核细胞增多性李斯特氏菌。
作为另一个例子，所述细菌感染疾病可以是食物中毒、皮肤真菌病、念珠菌性阴道炎、腹泻、呕吐、肠炎、胃肠炎、便秘、腹痛、腹胀、霍乱、李氏杆菌病、蜂窝组织炎、尿路感染、脑膜炎、腹膜炎、膀胱炎、淋巴盐、指头脓炎、中耳炎、呼吸系统疾病、肺炎、化脓性炎症或败血症。
蜂窝组织炎(cellulitis)是指皮肤和皮下组织出现的急性化脓性炎症，皮肤组织出现化脓性炎症，大量中性粒细胞浸润于组织间，呈现弥漫性、广泛性，伴随充血或水肿。
指头脓炎(felon)是指手指或脚趾出现急性化脓炎症。
本发明人已确认本发明的菌株对于白色念珠菌(其存在于包括人类在内的动物的口腔、肠道、阴道中，感染时引起皮肤真菌病、念珠菌性阴道炎、肠炎、口腔炎等疾病)、拜耳接合酵母(其作为腐败性酵母，感染时引起食物中毒、呕吐、腹泻、发烧等症状)、蜡样芽胞杆菌(感染时引起食物中毒、腹泻、呕吐等症状)、单核细胞增多性李斯特氏菌(感染时引起食物中毒、李氏杆菌病、败血症、脑炎、脑膜炎等疾病)，具有很强的抑制效果(图3及图4)。因此，本发明的抗菌组合物能够有效利用于预防和治疗细菌感染疾病的药物组合物。
本发明的预防和治疗细菌感染疾病的组合物还可以添加药学中允许使用的载体，能够与所述载体一起制成制剂，作为食品、保健食品、药品、准药品、饲料添加剂及饮用水添加剂等提供。本发明中，术语——“药学中允许使用的载体”是指一种载体或稀释剂，其不会刺激生物体，也不会影响所使用的化合物的生物活性及特性。
在本发明中，对允许使用的所述载体种类并无限制，只要属于在该技术领域通常使用并且药学中允许使用的载体即可。无限制的所述载体有生理盐水、消毒水、林格氏溶液、缓冲盐水溶液、白蛋白注射液、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇等。这些物质可以单独使用或将2种以上混合使用。
另外，必要时可以添加抗氧化剂、缓冲液及/或抑菌剂等其他常用的添加剂使用，还可以附加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂、润滑剂等制造为水溶液、悬浮液、乳浊液等注射剂型和丸剂、胶囊、颗粒或片剂等制剂进行使用。
本发明的预防和治疗细菌感染疾病的组合物，对其给药方式无特别限制，可以按照相应技术领域通常的给药方式给药。无限制的所述给药方式有口服组合物或以非口服方式给药。本发明的预防、改善和治疗所述细菌感染疾病的组合物，可以根据其目标给药方式制成各种形状的药剂。
本发明的抗菌物质的药物给药制剂还可以按照药学上允许使用的盐的形态使用，或者单独或与其他药物活性化合物结合使用或以合理地组合使用。
作为本发明的另一个方面，本发明提供一种预防和治疗细菌感染疾病的方法，其包括将预防和治疗所述细菌感染疾病的组合物向个体给药的步骤。在本发明中，术语——“个体”是指细菌感染疾病已发病或有可能发病的包括人类在内的所有动物。
本发明的所述预防和治疗方法具体可以包括向细菌感染疾病已发病或有可能发病的个体，以药学中有效的用量使用所述组合物的步骤。
含有所述萃取物的组合物合理的日服用量可由医生根据准确的医学诊断判断确定，可以分一次或数次给药。但是，优选地，为实现本发明的目的，治疗特定患者时，应根据想要达到的反应的种类和程度、是否根据情况使用其他制剂等在内的具体组合物、患者的年龄、体重、一般健康状态、性别及饮食、给药时间、给药途径及组合物的分泌率、治疗期间、与具体组合物混合使用或同时使用的药物在内的各种因素以及医学领域熟知的类似因素，分别确定具体的有效用量。
本发明的抗菌物质可以通过各种途径向大鼠、小鼠、家畜及人类等所有哺乳动物用药。用药的所有方式都可以预见到，比如可以通过口服或者直肠、静脉、肌肉、皮下、子宫内硬膜或脑室内注射用药。
作为本发明的另一个方面，本发明提供一种预防或改善细菌感染疾病的保健食品，其含有所述抗菌组合物。
此时，细菌感染疾病、预防及改善的含义如上文所述。
作为本发明的另一个方面，本发明提供一种含有所述抗菌组合物的准药品组合物。
在本发明中，术语——“准药品”是指：以治疗、减轻、处置或预防人或动物疾病为目的使用的纤维、橡胶制品或类似物品；对人体的作用微弱或不直接产生作用，不属于仪器或器械的物品和类似物品；作为以预防感染为目的使用的杀菌、杀虫或类似用途的制剂之一，除了以诊断、治疗、减轻、处置或预防人或动物疾病为目的使用的物品中不属于仪器、器械或设备的物品以及以药理学方式影响人或动物的结构和机能为目的使用的物品中不属于仪器、器械或设备的物品之外的物品。另外，所述准药品可以包括外用皮肤病药物及个人护理用品。优选地，可以是消毒清洁剂、沐浴露、漱口水、湿巾、肥皂、洗手液或软膏等，但不限于此。
本发明人已确认新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV对所述白色念珠菌具有抗菌效果，利用所述新型菌株的抗菌组合物能够有效应用于治疗、减轻、处置或预防包括皮肤真菌病、念珠菌性阴道炎在内的细菌感染疾病的准药品。
(发明的效果)
本发明新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV对病原性霉菌、酵母等1种以上不同种类的真菌类及细菌具有抗菌效果，能够作为植物及作物用抗菌剂、具有抗菌活性的食品以及预防、改善和治疗细菌感染疾病的饲料、保健食品、准药品、医药品使用。
尤其，本发明新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV具有只抑制食品中的引起食物中毒的细菌等主要有害菌的特定抗菌活性，能够直接使用于发酵食品。
附图说明
图1显示从本发明的贝莱斯芽孢杆菌CJBV分离抗菌有效成分——芽孢菌霉素D类似物的过程。
图2显示本发明的菌株产生的抗菌物质的ESI-MS和紫外光谱。
图3显示对4种真菌类，即炭疽病菌、尖孢镰刀菌、白色念珠菌、拜耳接合酵母的抗菌活性。
图4显示对引起食物中毒的细菌——蜡样芽胞杆菌、单核细胞增多性李斯特氏菌和酱类发酵细菌——枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌的抗菌活性。
具体实施方式
以下，结合实施例，对本发明进行详细说明。但是，以下内容仅为本发明的实施例而已，并非用于限定本法明。
实施例1：对产生抗菌物质的菌株进行分离和鉴别
(1)菌株的分离及筛选
为了筛选具有抗菌活性的菌株，使用了从传统酱曲分离的芽孢杆菌菌株。在大豆发酵液体培养基中，37℃温度下，对菌株进行36个小时预培养。在病原性霉菌及引起食物中毒的细菌形成菌苔(lawn cell)的固体琼脂培养基上，放置直径8mm的纸圆片后，对预培养的菌株进行接种。培养12小时以后，筛选培养基上接种的菌株周围对真菌类及细菌同时生成透明圈的菌株。
(2)菌株的鉴别
按照业内熟知的通常方法，对所述筛选的菌株进行16S rDNA和gyrA基因序列分析。进行基因序列分析时，利用国家生物技术信息中心(NCBI)的基本本地队列搜索工具(BLAST)，与GenBank数据库和所筛选菌株的16S rDNA基因序列(序列号1)及gyrA基因序列(序列号2)进行比较。比较结果显示，本菌株的16S rDNA序列与芽孢杆菌表现出99％同源性，gyrA基因序列与芽孢杆菌表现出100％同源性。
根据以上结果，将通过本发明获得的菌株鉴别为贝莱斯芽孢杆菌菌株，命名为贝莱斯芽孢杆菌CJBV，并于2014年4月17日，将所述菌株保藏于韩国微生物保藏中心(KCCM)，其保藏号为KCCM11528P。
实施例2：抗菌物质的分离及纯化
进行实验，分离出新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV产生的抗菌物质。其过程如图1所示。
将所述菌株接种于400Ml大豆发酵液体培养基之后，在37℃温度下，以200rpm振荡培养48小时。在8000x g下，对所述培养液进行20分钟离心分离后，取得上清液，并利用丁醇萃取。
对分离的萃取液进行真空蒸发以后，利用YMC HPLC色谱柱(column)和C18胶柱(Sep-Pak C18Cartridge)进行色谱分析。各个馏分以一定比例混合80％v/v甲醇显色，从中分离和纯化具有抗菌活性的馏分。
在甲醇溶剂中溶解纯化的试料，采用ESI-MS方法测定，获得分离后活性物质的紫外光谱和分子量(Mass)。
图2显示分离的抗菌物质的ESI-MS和紫外光谱。
通过所述分析，确认根据本发明分离的物质是可由下面的式1表达的3种芽孢菌霉素D类似物。
[式1]
在C14-芽孢菌霉素D中，所述R为CH3，在C15-芽孢菌霉素D中，所述R为CH2-CH3，在C16-芽孢菌霉素D中，所述R为CH2-CH2-CH3。
实施例3：真菌类及引起食物中毒的细菌的抗菌活性试验
进行如下抗菌活性实验，确认新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV是否对真菌类及引起食物中毒的细菌具有抑制效果。
(1)酵母及霉菌(真菌类)的抗菌活性试验
首先，进行试验确认新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV是否对霉菌——炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)、番茄枯萎病JCM12575(Fusarium oxysporumf.sp.lycopersici JCM12575)、白色念珠菌(Candida albicans)、病原性酵母——拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)具有抗菌活性。
将所述4种真菌类分别在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA；Potato dextrose agar)培养基进行培养。然后，在乙醇里溶解根据所述实施例2真空蒸发的抗菌组合物——贝莱斯芽孢杆菌CJBV培养液的丁醇萃取物后，在涂布所述4种菌株的各个平板培养基上面放置直径8mm的纸圆片，以25μl为单位添加所述抗菌物质后，在30℃温度下培养24小时至48小时，观察分离菌株产生的抗菌物质是否生成抑菌圈。
(2)引起食物中毒的细菌的抗菌活性试验
另外，进行如下实验，确认新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV是否只对发酵食品中引起食物中毒的细菌具有特定的抗菌活性。
在TSA(Tryptic soy agar)培养基上分别培养引起食物中毒的细菌——蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)和酱类发酵细菌——枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。
然后，在乙醇里溶解根据所述实施例2真空蒸发的抗菌组合物——贝莱斯芽孢杆菌CJBV培养液的丁醇萃取物(Extraction with BuOH)后，在涂布所述4种菌株的各个平板培养基上面放置直径8mm的纸圆片，以25μl为单位添加所述抗菌物质后，在37℃温度下培养24小时至48小时，观察分离菌株产生的抗菌物质是否生成抑菌圈。
对于2种酱类发酵细菌，除了所述实验组以外，由丁醇(BuOH)代替贝莱斯芽孢杆菌CJBV培养液——丁醇萃取物，作为对照组使用。
图3及图4显示根据所述实施例3的结果，如下表1显示根据不同抑菌圈的生成程度抗菌活性程度。
【表1】
微生物 抗菌活性
炭疽病菌 +++
番茄枯萎病 +++
白色念珠菌 ++
拜耳接合酵母 ++
蜡样芽胞杆菌 +
单核细胞增多性李斯特氏菌 +
枯草芽孢杆菌 -
解淀粉芽孢杆菌 -
所述表1中，‘-’表示不能抑制生长，‘+’表示抑菌圈的直径为3mm至5mm以下，‘++’表示抑菌圈的直径为6mm至10mm以下，‘+++’表示抑菌圈直径10mm以上。
如图3上部所示，利用含有本发明新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV菌株、所述菌株的孢子、所述菌株的培养物及其浓缩物、萃取物、干燥物中的一种以上有效成分的抗菌组合物，对病原性真菌类——炭疽病菌、尖孢镰刀菌进行处理的结果显示，形成10mm以上的抑菌圈，确认其抑制真菌类生长的抗菌活性非常强。
因此，本发明新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV及抗菌组合物抑制黄瓜、香瓜、西瓜等葫芦科蔬菜作业的炭疽病及枯萎病等植物传染病，能够有效利用于植物病防治用微生物制剂以及利用其的植物病原性真菌的防治方法。
另外，如图3下部所示，利用本发明新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV、所述菌株产生的芽孢菌霉素D类似物或抗菌组合物，对病原性真菌类——白色念珠菌、拜耳接合酵母进行处理的结果，形成6mm至10mm的抑菌圈，确认其抑制真菌类生长的抗菌活性非常强。
因此，本发明新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV、所述菌株产生的芽孢菌霉素D类似物及抗菌组合物对皮肤真菌病、念珠菌性阴道炎、口腔炎、肠炎等细菌感染疾病具有效果，能够有效应用于预防、改善和治疗以上疾病的准药品、保健食品、饲料等。另外，可以作为引起食物中毒危险低的食品有效使用。
另外，如图4所示，利用本发明新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV或抗菌组合物，对引起食物中毒的细菌和发酵酱类时使用的有益菌同时进行处理的结果，确认其对引起食物中毒的细菌——蜡样芽胞杆菌及单核细胞增多性李斯特氏菌具有很强的抗菌活性，但是不会抑制酱类发酵细菌的生长。
已有报告的以往根据微生物产生的细菌素，其不仅对引起食物中毒的细菌具有特定的抗菌活性，还影响酱类发酵细菌的生长，存在难以直接使用于发酵食品的问题。
与此相反，根据本发明新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV、所述菌株产生的芽孢菌霉素D类似物以及利用其的抗菌组合物对酱类发酵细菌不具有抗菌活性，只对引起食物中毒的细菌等食品中主要有害细菌具有抑制作用和抗菌活性，能够直接用于食品。
而且，已确认对各种食品污染源具有很强的抗菌活性，本发明新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV、所述菌株产生的芽孢菌霉素D类似物以及利用其的抗菌组合物对食物中毒、腹泻、呕吐等在内的细菌感染疾病具有预防、改善和治疗效果，能够有效应用于预防、改善和治疗以上疾病的准药品、保健食品、饲料等。
如上所述，因为本发明新分离的贝莱斯芽孢杆菌CJBV及所述菌株产生的芽孢菌霉素D类似物对1种以上不同种类的真菌类及细菌具有抗菌效果，能够作为植物及作物用抗菌剂、具有抗菌活性的食品以及预防、改善和治疗细菌感染疾病的饲料、保健食品、准药品、医药品使用。
本发明所属技术领域的从业人员应当理解，根据如上说明，在不脱离本发明的技术思想和必须特征的范围内，可以对本发明进行多种变更和修改。因此，应当理解，以上所述实施例仅为本发明的说明内容而已，并非限定本发明。比起所述详细说明，对于本发明的保护范围应当解释为：本发明的权利要求的意义及范围以及从其同等概念延伸的所有变更或修改形态，均属于本发明的保护范围。
【保藏号】
保藏机构名称：韩国微生物保藏中心(国外)
保藏机构地址：Yurin B/D
45，Hongjenae-2ga-gil
Seodaemun-gu
首尔，120-861
大韩民国
生物材料的分类命名：贝莱斯芽孢杆菌CJBV
保藏号：KCCM11528P
保藏日：20140417

Claims (15)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌CJBV(Bacillus velezensis CJBV)菌株，其特征在于：
其对真菌类及引起食物中毒的细菌具有特定抗菌活性，保藏号为KCCM11528P。
2.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌CJBV菌株，其特征在于：
所述菌株对酱类发酵细菌——枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)不具有抗菌活性。
3.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌CJBV菌株，其特征在于：
所述真菌类选自由炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、白色念珠菌(Candida albicans)及拜耳接合酵母(Zygosaccharomycesbailii)组成的组。
4.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌CJBV菌株，其特征在于：
所述引起食物中毒的细菌是蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)或单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)。
5.一种抗菌组合物，其含有选自由权利要求1至4中任意一项所述的贝莱斯芽孢杆菌CJBV菌株、所述菌株的孢子、所述菌株的培养物及其浓缩物、萃取物、干燥物组成的组中的一种以上有效成分。
6.一种含有权利要求5所述的抗菌组合物的食品组合物。
7.一种含有权利要求5所述的抗菌组合物的饲料组合物。
8.一种含有权利要求5所述的抗菌组合物的植物及作物用抗菌剂。
9.一种含有权利要求5所述的抗菌组合物的药物组合物，其用于预防或治疗菌感染疾病。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于：
所述菌是真菌类或引起食物中毒的细菌。
11.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于：
所述菌感染疾病选自由食物中毒、皮肤真菌病、念珠菌性阴道炎、腹泻、呕吐、肠炎、胃肠炎、便秘、腹痛、腹胀、霍乱、李氏杆菌病、蜂窝组织炎、尿路感染、脑膜炎、腹膜炎、膀胱炎、淋巴炎、指头脓炎、中耳炎、呼吸系统疾病、肺炎、化脓性炎症或败血症组成的组。
12.一种含有权利要求5所述的抗菌组合物的保健食品，其预防或改善菌感染疾病。
13.一种含有权利要求5所述的抗菌组合物的准药品组合物。
14.组合物用于制备针对引起食物中毒的细菌的抗菌药物的应用，所述引起食物中毒的细菌选自蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)或其组合，所述组合物包含在根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌CJBV菌株中产生的式1的芽孢菌霉素D类似物：
[式1]
其中R是CH3或CH2-CH2-CH3。
15.组合物用于制备针对引起食物中毒的细菌的抗菌药物的应用，所述引起食物中毒的细菌选自蜡样芽胞杆菌、单核细胞增多性李斯特氏菌或其组合，所述组合物包含在根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌CJBV菌株中产生的式2的芽孢菌霉素D类似物：
[式2]
其中R是CH2-CH3。
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