CN110117553B - 对几种食源性病原细菌有抑菌活性的蜡样芽胞杆菌及其细菌素 - Google Patents

对几种食源性病原细菌有抑菌活性的蜡样芽胞杆菌及其细菌素 Download PDF

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Abstract

本发明属于农业微生物应用技术领域，具体涉及对几种食源性病原细菌具有抑菌活性的蜡样芽胞杆菌及其细菌素。所述的蜡样芽胞杆菌DDD103，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018041。本发明的蜡样芽胞杆菌能产生一种环状细菌素，申请人命名为蜡样菌素。蜡样菌素的分子量为7066.89Da，其前体肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。蜡样菌素对多种食源性病原细菌如蜡样芽胞杆菌、单核细胞增生李斯特菌具有高效抑菌活性。同时蜡样菌素的耐高温能力较强，在100℃处理30min不失活；对酸碱较耐受，可耐受pH范围为2‑10。

Description

对几种食源性病原细菌有抑菌活性的蜡样芽胞杆菌及其细 菌素
技术领域
本发明属于微生物领域，涉及一株对几种食源性病原细菌具有抑菌活性的蜡样芽胞杆菌及其细菌素。所述的蜡样芽胞杆菌菌株为DDD103，申请人将分离的细菌素类物质命名为蜡样菌素。
背景技术
随着经济快速发展及人们生活水平的提高，人们对自身健康及食品安全越来越重视。而目前食品行业主要通过添加化学防腐剂来防止食品的腐败变质，但长期的研究发现过量食用防腐剂对血压、心脏、肾脏等有造成不良影响，甚至有些具有诱癌性、致畸性等问题，而寻找天然、安全的食品防腐剂成为食品行业的一个研究热点。
细菌素是由细菌通过核糖体合成机制产生的一类具有抗菌活性的蛋白质或多肽类物质。由于细菌素与抗生素有一些相似的活性和作用，因此两者在概念上常常被混淆。而细菌素和抗生素在化学性质、合成机制、抑菌机理等方面存在显著差异。以合成机制为例，抗生素是某些微生物通过一系列酶促反应将初级代谢物转化为结构性的次级代谢产物，而细菌素则是通过基因编码、核糖体合成的蛋白、多肽类物质。细菌素本身具有很多优良特性：体内、体外的高抑菌活性；对人体或动物无毒，且易被动物消化道中的一些蛋白酶所降解；有很好的选择性杀菌效果；易于生物改造，满足人们不同的需求；具有热稳定性及耐酸碱能力，便于贮藏；本身无味，使用时不会影响食品、饲料的口感、味道等等(Cotter etal.,2013)。因此，细菌素在食品、饲料、医药等行业都有着广泛的应用价值和广阔的应用前景。
芽胞杆菌(Bacillus)是一类广泛分布于多种生态环境中的、在形成芽胞的同时产生伴胞晶体的革兰氏阳性细菌。目前在芽胞杆菌已报道了一些细菌素，如在芽胞杆菌中发现的细菌素Thuricin CD可专一性抑制艰难梭菌，且在人体结肠模型下不会引起肠道菌群的失调，未来极有可能成为人类对抗艰难梭菌感染的新型药物(Rea et al.,2010)。另外专利申请人也在芽胞杆菌BMB3201中鉴定了3种新型羊毛硫细菌素Ticin A1、Ticin A3及Ticin A4，它们均具有极强的耐热、酸碱特性，具有作为新型食品防腐剂的应用潜力(Xinet al.,2015)。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一株对几种食源性病原细菌具有抑菌活性的蜡样芽胞杆菌及其细菌素。本发明包括蜡样芽胞杆菌新菌株及其所产细菌素，蜡样芽胞杆菌新菌株及其所产的细菌素对多种引起食源性病原菌具有高效抑菌活性，且具有较强的耐受酸碱和热稳定性等。
本发明通过以下方案实现：
申请人分离筛选得到一株对几种食源性病原菌具有抑菌活性的蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)菌株，将所得的菌株命名为蜡样芽胞杆菌DDD103，Bacillus cereusDDD103，于2018年1月17日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2018041。
蜡样芽胞杆菌DDD103菌株具有以下特性：
(1)蜡样芽胞杆菌DDD103菌株可产生对多种食源性病原细菌(例如蜡样芽胞杆菌(代表菌株为ATCC14579，ATCC49064)和单核细胞增生李斯特菌(代表菌株为ATCC19115，LM201)菌株)具有抑菌活性的物质。
(2)蜡样芽胞杆菌DDD103菌株产生的抑菌活性物质为一新型的环状细菌素，该细菌素类物质被命名为蜡样菌素。该蜡样菌素的分子量是7066.89Da(用单一同位素测定)。所述的蜡样菌素的前体肽合成的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，其中在SEQ ID NO:1所示序列的第1-225位的序列是该序列的编码区，其对应编码的蛋白质的氨基酸为74个，该蜡样菌素的前体肽的氨基酸的序列如序列表SEQ ID NO:2所示。蜡样菌素的合成基因簇的核苷酸序列如图8所示。
(3)蜡样菌素对多种革兰氏阳性病原细菌(蜡样芽胞杆菌ATCC14579，蜡样芽胞杆菌ATCC49064，单核细胞增生李斯特菌ATCC19115和单核细胞增生李斯特菌LM201)具有抑菌活性。
(4)蜡样菌素耐高温能力较强，在100℃处理30min不失活；对酸碱较耐受，耐受pH范围为2-10。
本发明的分离的蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)菌株DDD103的微生物菌学特征如下：
菌体大小为(1～1.2)μm×(3～5)μm，细胞呈杆状，芽胞中生，革兰氏染色呈阳性反应。在LB琼脂平板上可形成表面粗糙、扁平、质地软且不规则的白色菌落。最适生长温度为28℃，pH 6-8均生长良好，最适生长pH为7.0-7.2。
蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)菌株按照常规甘油管保藏方法保藏。
更详细的技术方案参见《具体实施方式》的描述。
附图说明：
序列表SEQ ID NO:1是蜡样芽胞杆菌DDD103菌株分泌的环状细菌素-蜡样菌素的前体肽的核苷酸序列。序列长度为225bp。其中在SEQ ID NO:2所示序列的第1-225位的序列是该序列的编码区(CDS，其中第223-225位的TAA三个碱基不翻译氨基酸)，编码74个氨基酸残基。
序列表SEQ ID NO:2是该蜡样菌素的前体肽的氨基酸的序列，共编码74个氨基酸。
图1：蜡样芽胞杆菌DDD103菌株的菌落、营养体及芽胞形态。附图标记说明：图1中的A图是蜡样芽胞杆菌DDD103菌株的菌落形态；图1中的B图是蜡样芽胞杆菌DDD103菌株的营养体形态；图1中的C图是蜡样芽胞杆菌DDD103菌株的芽胞形态。
图2：蜡样芽胞杆菌DDD103菌株的对数生长期的发酵上清对蜡样芽胞杆菌和单核细胞增生李斯特菌抑菌活性检测结果。附图标记说明：图2中的A图是蜡样芽胞杆菌ATCC14579菌株的抑菌活性检测结果；图2中的B图是蜡样芽胞杆菌ATCC49604菌株的抑菌活性检测结果；图2中的C图是单核细胞增生李斯特菌LM201菌株的抑菌活性检测结果；图2中的D图是单核细胞增生李斯特菌ATCC19115的抑菌活性检测结果。
图3：蜡样芽胞杆菌DDD103菌株产生的细菌素-蜡样菌素的HPLC分析及质谱分析结果。
图4：蜡样菌素的前体肽序列和合成基因簇的示意图。附图标记说明：图4中的A图是蜡样菌素的前体肽序列，图4中的B图是蜡样菌素的结构；图4中的C图是蜡样菌素的合成基因簇。
图5：蜡样菌素对蜡样芽胞杆菌和单核细胞增生李斯特菌抑菌活性检测结果。附图标记说明：图5中的A图是蜡样芽胞杆菌ATCC14579菌株的抑菌活性检测结果；图5中的B图是蜡样芽胞杆菌ATCC49604菌株的抑菌活性检测结果；图5中的C图是单核细胞增生李斯特菌LM201菌株的抑菌活性检测结果；图5中的D图是单核细胞增生李斯特菌ATCC19115菌株的抑菌活性检测结果。
图6：蜡样菌素的耐受酸碱和耐受热能力的测定结果。
图7：蜡样芽胞杆菌DDD103菌株的16SrRNA序列。序列长度为1458bp。
图8：蜡样菌素的合成基因簇的核苷酸序列。序列长度为9247bp。
具体实施方式
实施例1
一、蜡样芽胞杆菌DDD103菌株的分离、鉴定及抑菌活性的检测
1、土壤中对蜡样芽胞杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌具有抑菌活性的芽胞杆菌的筛选
(1)土壤中芽胞杆菌的分离与筛选
称取中国，湖北省，武汉市华中农业大学试验农场的1g土壤，在超净台中将土壤加入到称有LB-NaAc培养基(配方：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，醋酸钠34.02g，补充蒸馏水至1L，pH为7.0，121℃灭菌30min)的250mL的三角瓶中，30℃，220rpm/min摇床培养4h。培养4h后将三角瓶置于80℃水浴3min。待三角瓶冷却后，在超净台中用移液枪吸取100μL培养液涂布于Luria-Berta medium(LB)固体培养基(配方：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂粉4.5-6g，补充蒸馏水至1L，pH7.0，121℃灭菌30min)，将涂布后的平板放置于30℃培养12-16h。在超净台中将平板中菌落生长形态似芽胞杆菌的菌落在T3固体培养基(配方：蛋白胨5g，酵母粉1.5g，氯化猛0.05g，0.05M磷酸钠缓冲液，琼脂粉4.5-6g，补充蒸馏水至1L，pH7.0，121℃灭菌30min)上划线，并置于30℃培养48h。而后挑取上述的挑选出芽胞杆菌的单菌落，用蕃红染色液(配置方法：2.5％蕃红的乙醇溶液10mL，加蒸馏水稀释至100ml，过滤后使用)简单染色后置普通光学显微镜下观察，对于产芽胞的、杆状细菌可初步判断为芽胞杆菌。
(2)对蜡样芽胞杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌具有抑菌活性的芽胞杆菌的筛选
挑取上述获得的、不同的芽胞杆菌的单菌落，接种于5ml LB液体培养基中于30℃过夜活化。将1mL的培养物转移至100mL的LB液体培养基(配方：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，补充蒸馏水至1L，pH7.0，121℃灭菌30min)中，在220rpm/min，30℃下培养30h。从接种起每隔3h在超净台中取2mL培养液，连续取样10次。其中1mL培养液用于测定该时期发酵液的OD600值。另1mL培养液经12000rpm/min，5min离心后将上清液转移至新的离心管，并测定发酵上清对指示菌的抑菌活性。利用琼脂扩散法检测发酵上清的抑菌活性(Cintas etal.,1995)。在未凝固的琼脂培养基中加入适量的指示菌(细菌个数约为5×105cfu/mL)，混匀，倒平板。选取蜡样芽胞杆菌ATCC14579、蜡样芽胞杆菌ATCC49064、单核细胞增生李斯特菌ATCC19115(以上3株菌均购买自美国菌种保藏中心)以及单核细胞增生李斯特菌LM201(来源于华中农业大学动物医学院微生物学与免疫学实验室)为指示菌。待其凝固后用孔径为6mm的打孔器打孔。每孔中加入约50μL样品后将平板先放置于4℃，2h左右，让待测样品充分扩散，而后放置于28℃下培养12h，观察抑菌效果(观察有无透明的抑菌圈出现)。
3、蜡样芽胞杆菌DDD103的鉴定
通过上述对多株芽胞杆菌不同生长时期发酵上清抑菌活性的检测，申请人发现其中一株芽胞杆菌菌株在对数生长期可产生对蜡样芽胞杆菌ATCC14579、蜡样芽胞杆菌ATCC49604、单核细胞增生李斯特菌LM201、单核细胞增生李斯特菌ATCC19115具有抑菌活性的物质(附图2所示)，并将其命名为芽胞杆菌DDD103。接下来申请人对芽胞杆菌DDD103菌株进行了菌种鉴定。鉴定步骤如下：
(1)总DNA的抽提
挑取蜡样芽胞DDD103菌株的单菌落接种于5ml LB液体培养基中30℃过夜活化将0.5mL的培养物转移至50mL的LB液体培养基中，同样条件培养3-4小时；然后在12000rpm，处理5min，离心收集菌体，用5mLSTE[配方：0.1mol/L NaCL，10m mol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1mmol/L EDTA(pH 8.0)]洗涤一次，加3mL溶液I[配方：1mol/L Tris-HCl(pH 8.0)，0.5mol/LEDTA(pH 8)，50m mol/L葡萄糖]和50μL溶菌酶(浓度：50mg/mL)，在37℃作用30min以上；加入3mL10％的十二烷基磺酸钠(SDS)于55℃水浴30min：加入3.6mL 5M NaCl混和，冰上静置10min，在12000rpm/min，处理15min，取上清置另一离心管；再加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(按体积比：25∶24∶1)，并颠倒混匀200次，而后离心12000rpm，5min，吸取上清液，并重复抽提1-2次；将上层DNA溶液转移至新离心管，加入等体积95％的乙醇，室温下静置30min后以12000rpm离心5min，沉淀用1mL 70％的乙醇洗涤一次，冷冻抽干后溶于200μLTE溶液中。
(2)芽胞杆菌DDD103的16S rDNA序列的PCR扩增
根据真细菌1 6S rDNA保守区设计通用引物27F和1492R进行PCR扩增。
通用引物的DNA序列如下：
27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
PCR扩增反应程序：第1步94℃预变性5min；第2步94℃变性1min；第3步56℃复性1min；
第4步72℃延伸1.5min；第5步转到第2步继续运行28个重复；第6步72℃延伸至5min。
(3)PCR产物的序列测定及分析
将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后，切下DNA片段所在的琼脂糖块，使用OMEGA公司生产的DNA片段回收试剂盒回收DNA片段(按试剂盒说明书操作)。将所得DNA片段送至北京奥科生物技术有限责任公司测序。通过两个测序反应获得PCR扩增产物的全长1458bp，测序结果输入NCBI数据库，用Blastn程序交送GenBank数据库进行比较分析，表明该序列与GenBank数据库中的蜡样芽胞杆菌L49和苏云金芽孢杆菌SY两株菌的16S rDNA同源性最高，相似性均为99.9％。另外，蜡样芽胞杆菌DDD103菌株在形成芽胞时显微镜下未观测到晶体蛋白的形成(苏云金芽胞杆菌在形成芽胞同时会生成晶体蛋白)，所以可断定该菌株属于芽胞杆菌科(Bacillaceae)芽胞杆菌属(Bacillus)蜡样芽胞杆菌种(Bacillus cereus)，申请人将其命名蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)DDD103菌株。
二.蜡样芽胞杆菌DDD103分泌的细菌素(蜡样菌素)的鉴定
(1)蜡样芽胞杆菌DDD103菌株的全基因组测序及抑菌活性物质的预测和分析
将上述制备好的总DNA样品进行全基因组测序(通过Illuminate Hiseq2500测序仪完成)。测序使用双端测序，测序读长为125bp，测序数量为1G。最终测序数据经基因组拼接软件Abyss完成DDD103的基因组拼接工作。
蜡样芽胞杆菌DDD103菌株抑菌活性物质合成基因簇的预测分析由在线分析软件Antismath 3.0及Bagel 3.0完成。如附图5中的C图所示，蜡样芽胞杆菌DDD103菌株基因组中有一完整的环状细菌素合成基因组。该基因簇中细菌素前体肽序为MLFNVVSKLGWTGINIGTANALIGALMTGSDIWTAISVAGLAFGGGIGTAISTIGRKAIMEMVEKVGKKKAAQW。该前体肽序列通过BlastP分析，其与已报道的环状细菌素的氨基酸序列同源性均低于40％，说明其为一新型的环状细菌素。申请人将该合成基因簇分泌的产物命名为蜡样菌素。
(2)蜡样芽胞杆菌DDD103菌株分泌的细菌素-蜡样菌素粗体品的制备
挑取蜡样芽胞杆菌DDD103菌株的单菌落于5mL LB液体培养基过夜活化。按1％(V/V)接种量转接至10瓶200mL LB培养液中，28℃，220r/min培养OD600至3.0；将发酵液离心(12,000r/min,10min)，并将获得的2L上清用200g的大孔吸附树脂安博莱特(Amberlite)XAD-7HP过柱吸附；吸附后的柱料首先用1L ddH2O冲洗；再用0.5L 30％的乙醇溶液冲洗；最后用0.5L，80％的乙醇(pH 2.0)将活性物质洗脱下来；洗脱液于40℃下通过旋转蒸发仪浓缩(注意浓缩过程中调节旋液pH，保持pH 6.0左右)；旋干至5mL左右后收集并做冻干处理；获得的干粉溶于50％乙腈(pH 5.0)，离心(12,000r/min,，10min)，所获得的上清即为抑菌物质粗提液；
(3)蜡样菌素纯品的制备
获得抑菌物质粗体液采用高压液相色谱仪(Water 1525)system分析：
主要技术参数：
色谱柱：Agilent C18反相柱(250mm×4.6mm，5μL)；
流动相：ddH2O(0.1％TFA)和乙腈；
流动相条件：0-30min，20％-60％乙腈梯度洗脱；
检测波长：220nm
流速：1mL/min
将30min内洗脱的流液分段收集(2min一次，共计收集15次)，用常规琼脂扩散法检测收集液的抑菌活性，判断出抑菌物质保留时间。当抑菌物质保留时间确定后，反复收集多次，旋干、并作冻干处理，将获得的粉末称重，溶于20％乙腈(pH 5.0)，并在相同流动相条件下检测其纯度。
(4)蜡样菌素的一级质谱分析
将以上制备的抑菌物质纯品于质谱仪Agilent Technologies 6540UDHAccurate-Mass Q-TOF LC/MS测定其分子量。
一级质谱分析条件：
毛细管电压：3,500V；
喷雾压力：35lb/in2gauge；
干燥气流速：9liters/min；
温度：350℃；
Q-TOF扫描范围：100-3,000m/z；
数据采集速率：1spectrum/s。
结果如图3所示，蜡样芽胞杆菌DDD103菌株分泌的活性物质在分子量为7066.89Da(用单一同位素峰定)。而当预测的环肽前体肽MLFNVVSKLGWTGINIGTANALIGALMTGSDIWTAISVAGLAFGGGIGTAISTIGRKAIMEMVEKVGKKKAAQW在剪切掉前导肽MLFN后剩余氨基酸序列：VVSKLGWTGINIGTANALIGALMTGSDIWTAISVAGLAFGGGIGTAISTIGRKAIMEMVEKVGKKKAAQW，经氨基端和羧基端发生环化反应后生成的成熟肽，分子量为7066.84Da(用单一同位素峰测试)。而该分子量与蜡样芽胞杆菌DDD103菌株分泌的活性物质在分子量为7066.8852Da几乎是吻合的，这证明蜡样芽胞杆菌DDD103菌株分泌的活性物质即为蜡样菌素。
(5)蜡样菌素酶解后的多肽片段的一级质谱分析
将上述制备的活性物质纯品(约0.4mg)溶于0.1mL 100mM碳酸氢铵缓冲液中，胰蛋白酶(0.01mg)溶于0.1mL100mM碳酸氢铵缓冲液，两者混合后置于37℃处理12h。处理后的样品再经的质谱分析。最终获得多肽片段有VGK，VGKK，AAQWVVSK，AIMEMVEK，KAAQWVVSK，KAIMEMVEK，AIMEMVEKVGK(见表1)。这六个片段均为蜡样菌素内存在的多肽片段，这进一步证实了蜡样芽胞杆菌DDD103菌株分泌的活性物质即为蜡样菌素。
表1蜡样菌素经胰蛋白酶水解后的多肽片段
Figure BDA0001569930400000071
三、蜡样菌素抑菌活性和稳定性的测定
将上述获得的蜡样菌素纯品制成终浓度为10μg/mL的试验样品。利用上述常规琼脂扩散法检测该浓度下的蜡样菌素对蜡样芽胞杆菌ATCC14579菌株、蜡样芽胞杆菌ATCC49604菌株、单核细胞增生李斯特菌LM201菌株和单核细胞增生李斯特菌ATCC19115菌株的抑菌活性。结果如附图5所示，蜡样菌素在10μg/mL浓度下对几种食源性病原细菌均具有高效抑菌活性。
将制备的50μL 10μg/mL的蜡样菌素溶液分别置于80℃、90℃、100℃下30min。未处理样品作对照。冷却至室温后采用琼脂扩散法检测处理后样品残留活性。如图6中的A图所示，蜡样菌素在高温处理下并未失活，说明蜡样菌素具有极强耐热性。
将制备的50μL 10μg/mL的蜡样菌素溶液用0.1mol/L氢氧化钠或0.1mol/L盐酸将样品溶液pH分别调至2-10,放置37℃恒温箱内24h，再将各管pH调回至pH 5.0。以未作处理的样品作对照。用灭菌水定容至100μL后采用平板扩散法检测处理后样品残留活性。图6中的B图表明蜡样菌素在酸性条件(pH 2-4)、中性(pH 7)及弱碱性(pH 8)条件下不失活，在强碱性条件下(pH 9-10)丧失约30％抑菌活性。上述结果表明蜡样菌素具有较强的耐酸碱性。
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<211> 225
<212> DNA
<213> 蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)
<400> 1
atgttattta acgttgtgtc aaaattaggt tggacaggta ttaatattgg aacagctaat 60
gcacttatcg gagcacttat gactggtagt gatatctgga ctgcaatttc agttgctggt 120
ttagcattcg gtggtggaat tggtacagct atttctacaa ttggtagaaa agctatcatg 180
gaaatggtag aaaaagtagg taaaaagaaa gctgcacagt ggtaa 225
<210> 2
<211> 74
<212> PRT
<213> 蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)
<220>
<221> BINDING
<222> (1)..(74)
<400> 2
Met Leu Phe Asn Val Val Ser Lys Leu Gly Trp Thr Gly Ile Asn Ile
1 5 10 15
Gly Thr Ala Asn Ala Leu Ile Gly Ala Leu Met Thr Gly Ser Asp Ile
20 25 30
Trp Thr Ala Ile Ser Val Ala Gly Leu Ala Phe Gly Gly Gly Ile Gly
35 40 45
Thr Ala Ile Ser Thr Ile Gly Arg Lys Ala Ile Met Glu Met Val Glu
50 55 60
Lys Val Gly Lys Lys Lys Ala Ala Gln Trp
65 70

Claims (1)

1.一株保藏编号为CCTCC NO ：M 2018041的分泌蜡样菌素的蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）菌株DDD103在制备食品添加剂和饲料添加剂中的应用，其特征在于，所述蜡样芽胞杆菌所分泌的蜡样菌素分子量为7066.89Da；所述蜡样菌素的前体肽的核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
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