CN111875681B - 一种具有专一、高效抑菌活性的细菌素Toyoncin - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有专一、高效抑菌活性的细菌素Toyoncin，合成所述细菌素Toyoncin的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，共213个核苷酸组成；所述细菌素Toyoncin的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，共编码70个蛋白质。所述细菌素Toyoncin产自东洋芽胞杆菌XIN‑2，其对两类食源性病原菌蜡样芽胞杆菌及单核细胞增生李斯特菌具有专一、高效的抑菌活性。

Description

一种具有专一、高效抑菌活性的细菌素Toyoncin
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种具有专一、高效抑菌活性的细菌素Toyoncin。
背景技术
化学防腐剂广泛用于食品的防腐保鲜。但部分化学防腐剂因对心脏、肾脏、血压等会造成不良影响，甚至有些具有诱癌性、致畸性等问题，而寻找天然、安全的食品防腐剂成为食品行业的研究热点。
细菌素是由细菌通过核糖体合成机制产生的一类具有抗菌活性的蛋白质或多肽类物质。细菌素本身具有很多优良特性：体内、体外的高效抑菌活性；对人体或动物低度或无毒，且易被动物消化道中的一些蛋白酶所降解；蛋白属性而易于生物改造；具有热稳定性及耐酸碱能力，便于长时间贮藏；本身无色无味，使用时不会影响食品、饲料的口感、味道等。目前，细菌素在食品、饲料、医药等行业都有着广阔的应用前景。
目前研究发现蜡样芽胞杆菌群(Bacillus cereus group)菌株可以产生多种多样的细菌素，如Sactipeptide类细菌素、羊毛硫细菌素、非修饰细菌素等。而生物信息学分析发现，目前已公布基因组序列的蜡样芽胞杆菌群菌株还含有大量未鉴定的新型细菌素。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术所存在的缺陷，提供一种对蜡样芽胞杆菌和单核细胞增生李斯特菌具有专一、高效抑菌活性的细菌素Toyoncin。
本发明具有专一、高效抑菌活性的细菌素Toyoncin，分子量为7817.1012Da(用单一同位素测定)。
合成所述细菌素Toyoncin的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，共213个核苷酸组成。
所述细菌素Toyoncin的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，共编码70个蛋白质。
本发明细菌素Toyoncin产自东洋芽胞杆菌XIN-2，所述东洋芽胞杆菌XIN-2的分类命名为： Bacillus toyonensisXIN-2，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2020年7月14日，保藏编号：CCTCC NO：M 2020312。
本发明通过抑菌活性筛选确定东洋芽胞杆菌XIN-2(Bacillus toyonensisXIN-2)菌株可产生对蜡样芽胞杆菌及单核细胞增生李斯特菌具有特异性抑菌活性的物质。经提取东洋芽胞杆菌 XIN-2菌株产生的抑菌活性物质为一新型的细菌素，该细菌素被命名为Toyoncin。Toyoncin对两类病原菌-蜡样芽胞杆菌及单核细胞增生李斯特菌具有特异、高效的抑菌活性。
附图说明
图1：东洋芽胞杆菌XIN-2菌落形态图(A)，东洋芽胞杆菌XIN-2在LB液体培养基中培养的一步生长曲线图(B)，东洋芽胞杆菌XIN-2不同生长时期的发酵上清对蜡样芽胞杆菌ATCC14579的抑菌活性检测结果(C)。
图2：东洋芽胞杆菌XIN-2菌株产生的细菌素-Toyoncin的HPLC分析结果。
图3：东洋芽胞杆菌XIN-2菌株产生的细菌素-Toyoncin的一级质谱分析结果。
图4：东洋芽胞杆菌XIN-2菌株产生的细菌素-Toyoncin的氨基酸序列。红色显示的氨基酸是Toyoncin经溴化氢处理后N端测序测得的氨基酸序列。
具体实施方式
实施例1：
1、东洋芽胞杆菌XIN-2菌株抑菌活性的检测
挑取东洋芽胞杆菌XIN-2的单菌落，接种于5ml LB液体培养基中于30℃过夜活化。将1mL 的培养物转移至100mL的LB液体培养基(配方：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，补充蒸馏水至1L，pH7.0，121℃灭菌30min)中，在220rpm/min，30℃下培养30h。从接种起每隔2h在超净台中取1mL培养液，连续取样12次。培养液经12000rpm/min，5min离心后将上清液转移至新的离心管，并测定发酵上清对指示菌的抑菌活性。利用琼脂扩散法检测发酵上清的抑菌活性。在未凝固的琼脂培养基中加入适量的指示菌(细菌个数约为5×105cfu/mL)，混匀，倒平板。选取蜡样芽胞杆菌ATCC14579为指示菌。待其凝固后用孔径为6mm的打孔器打孔。每孔中加入约50μL样品后将平板先放置于4℃，2h左右，让待测样品充分扩散，而后放置于 28℃下培养12h，观察抑菌效果(观察有无透明的抑菌圈出现)。如附图1所示，东洋芽胞杆菌XIN-2在6-10h的发酵上清对指示菌蜡样芽胞杆菌ATCC14579具有明显的抑菌活性。
2、东洋芽胞杆菌XIN-2分泌的细菌素(Toyoncin)的鉴定
(1)东洋芽胞杆菌XIN-2分泌的细菌素(Toyoncin)的粗提取
挑取XIN-2菌株的单菌落于5mL LB液体培养基过夜活化。按1％(V/V)接种量转接至10瓶 200mL LB培养液中，28℃，220r/min培养8h；将发酵液离心(12,000r/min,10min)，并将获得的2L上清用200g的大孔吸附树脂安博莱特(Amberlite)XAD-7HP过柱吸附；吸附后的柱料首先用1L ddH2O冲洗，再用0.5L 30％的乙醇溶液冲洗，最后用0.5L、80％的乙醇(pH2.0)将活性物质洗脱下来；洗脱液于40℃下通过旋转蒸发仪浓缩，旋干至5mL左右后收集并做冻干处理；获得的干粉溶于50％乙腈(pH 5.0)，离心(12,000r/min,，10min)，所获得的上清即为抑菌物质粗提液；
(2)Toyoncin纯品的制备
获得抑菌物质粗体液采用高压液相色谱仪Dionex Ultimate3000system分析：
主要技术参数：
色谱柱：Agilent C18反相柱(250mm×4.6mm，5μL)；
流动相：ddH2O(0.1％TFA)和乙腈；
流动相条件：0-30min，10％-90％乙腈梯度洗脱；
检测波长：220nm
流速：1mL/min
将30min内洗脱的流液分段收集(1min一次，收集30次)，用琼脂扩散法检测收集液对蜡样芽胞杆菌ATCC14579的抑菌活性，判断出抑菌物质保留时间。如图2所示，12号峰段对蜡样芽胞杆菌ATCC14579具有抑菌活性。我们将12号峰段中活性物质命名为Toyoncin。重复上述液相流程并多次收集Toyoncin，再经旋干、冻干处理，获得的粉末称重，并溶于20％乙腈(pH 5.0)。
(3)Toyoncin的一级质谱分析
将以上制备的Toyoncin纯品于质谱仪Agilent Technologies 6540UDHAccurate-Mass Q-TOF LC/MS测定其分子量。
一级质谱分析条件：
毛细管电压：3,500V；
喷雾压力：35lb/in2 gauge；
干燥气流速：9liters/min；
温度：350℃；
Q-TOF扫描范围：100-3,000m/z；
数据采集速率：1spectrum/s。
如图3所示，12号峰段分泌的活性物质在分子量为7817.1012Da(单一同位素峰)。
(4)Toyoncin的N端测序
使用PPSQ-33A蛋白N端测序仪测定(Shimadzu Co.,Ltd,Kyoto,Japan)对Toyoncin进行N端氨基酸序列测定并未获得测序结果，这说明Toyoncin的N端的氨基可能发生了酰化反应。采用溴化氢处理Toyoncin后再进行N端测序，获得氨基酸序列 INTAWKIIKALQKYGTKAYNVIKKGGQAMYDSFMAAKAK(图4)。该段蛋白分子量为 4507.3996Da，与Toyoncin分子量7817.1012Da不相符，说明测得的氨基酸序列不完整，需要做进一步分析。
(5)Toyoncin氨基酸序列的解析
将东洋芽胞杆菌XIN-2菌株送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行全基因组测序(通过 Illuminate Hiseq2500测序仪完成)。测序使用双端测序，测序读长为125bp，测序数量为1G。最终测序数据经基因组拼接软件PGCGAP完成XIN-2的基因组拼接、注释工作。
在XIN-2菌株基因组中有一个蛋白ToyA，其氨基酸序列为： MINTAWKIIKALQKYGTK AYNVIKKGGQAMYDSFMAAKAKGWTHAAWWLVEHGSTLG TFYDLLKAAGLID。该段蛋白序列包含溴化氢处理Toyoncin后测得的蛋白序列(下划线部分)，且该蛋白预测分子量为7789.0606Da，比Toyoncin小28Da。说明蛋白ToyA的N端发生了甲酰化修饰(+28Da)，并合成了Toyoncin，Toyoncin的氨基酸序列如图4所示。Toyoncin 的氨基酸序列通过BlastP分析，其与已鉴定的细菌素的氨基酸序列均无同源性，说明其为一新型的细菌素。
3、Toyoncin抑菌活性的测定
将上述获得的Toyoncin纯品制成终浓度为(0.19，0.39，0.78，1.56，3.13，6.25，12.5， 25，50，100μM)的试验样品。利用上述介绍的琼脂扩散法检测不同浓度下的Toyoncin对15 种指示菌的抑菌活性。如表1所示，Toyoncin只对蜡样芽胞杆菌和单核细胞增生李斯特菌(蜡样芽胞杆菌ATCC14579、蜡样芽胞杆菌CMCC63301、单核细胞增生李斯特菌LM201、单核细胞增生李斯特菌605、单核细胞增生李斯特菌ATCC19115)具有抑菌活性，最低抑菌浓度范围在0.78-3.13μM。Toyoncin对粪肠球菌ATCC29212、粪肠球菌ATCC51299、屎肠球菌ATCC33186、金黄色葡萄球菌ATCC29213、金黄色葡萄球菌ATCC43300、金黄色葡萄球菌ATCC6538、表皮葡萄球菌CMCC26069、酿脓链球菌ATCC19615、肺炎链球菌ATCC49619和猪链球菌SC19 10种病原菌均无抑菌活性。
表1 Toyoncin抑菌活性的检测
Figure BDA0002636012990000041
Figure BDA0002636012990000051
aNB，牛肉膏蛋白培养基；LB，细菌基础培养基；TSB，胰酪大豆胨液体培养基；BHI，脑
心浸液培养基
b-表示toyoncin浓度达到100μM对该病原菌仍无活性。
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Claims (2)

1.一种产生细菌素Toyoncin的东洋芽胞杆菌XIN-2，其特征在于：
所述东洋芽胞杆菌XIN-2的分类命名为：Bacillus toyonensis，保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2020年7月14日，保藏编号：CCTCC NO：M 2020312；
所述细菌素Toyoncin的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，且其N端发生了甲酰化修饰。
2.一种细菌素Toyoncin的应用，其特征在于：
所述细菌素Toyoncin由权利要求1所述东洋芽胞杆菌XIN-2产生；
所述细菌素Toyoncin用于制备食品添加剂、饲料添加剂或抗菌药物；
所述细菌素Toyoncin的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，且其N端发生了甲酰化修饰；
所述细菌素Toyoncin对蜡样芽胞杆菌和单核细胞增生李斯特菌具有抑菌活性。
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