CN104311645B - 具有抑菌活性的螺旋藻多肽p1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种新型的具有抑菌活性的螺旋藻多肽P1，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示。本发明首次从螺旋藻中提取出具有抑菌活性的多肽P1，实验证明其能够有效抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，且无任何毒副作用，可作为广谱抗菌剂或细菌防腐剂使用，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质工程领域，具体地说，涉及一种具有抑菌活性的螺旋藻多肽P1及其应用。
背景技术
螺旋藻(Spirulina)是一类单细胞生物，属于蓝藻门颤藻科。大量研究表明，螺旋藻含有非常丰富的营养成分，蛋白质含量高达50%-70%，氨基酸组成比例非常理想，是一种极好的蛋白质来源。但蛋白质属于大分子物质，遇水膨胀后粘度较大，不利于加工，且也不利于人体对其消化和吸收。对螺旋藻蛋白质进行水解有利于提高蛋白质的溶解性，提高利用率。螺旋藻蛋白水解后形成多肽及小分子肽，能被人体快速吸收。
随着人们的生活水平和安全意识的不断提高，国内外对食品的微生物污染问题十分关注，对食品中的防腐剂要求也越来越高。由于天然防腐剂具有抗菌性强，安全无毒，水溶性好，热稳定性好，作用范围广等特点，这些特点是化学合成的防腐剂无法比拟的。而近几十年来，肽类做为一种新型的天然防腐剂，其研究和应用也在逐渐增多。
以螺旋藻作为制备活性肽的来源，有其独特的优点。螺旋藻生长迅速，生物量大，蛋白质含量高，筛选出的抑菌肽既有防腐作用又能提供营养，对于天然防腐剂的应用与开发和螺旋藻的综合利用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的具有抑菌活性的螺旋藻多肽P1。
本发明的另一目的是提供螺旋藻多肽P1在抑菌方面的应用。
为了实现本发明目的，本发明的一种具有抑菌活性的螺旋藻多肽P1，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示。
本发明的螺旋藻多肽P1是从钝顶螺旋藻（Spirulina platensis）中提取出来的一种具有抑菌活性的多肽，多肽氨基酸数目小于20个，无需任何修饰连接，为线性多肽，且人工合成方便。
本发明还提供螺旋藻多肽P1在制备广谱抗菌剂中的应用。
本发明还提供一种抗菌剂，其有效成分为所述螺旋藻多肽P1。
本发明还提供螺旋藻多肽P1在制备防腐剂中的应用。
本发明进一步提供一种防腐剂，其有效成分为所述螺旋藻多肽P1。所述防腐剂为安全无毒的细菌防腐剂。
本发明首次从螺旋藻中提取出具有抑菌活性的多肽P1，实验证明其能够有效抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，且无任何毒副作用，可作为广谱抗菌剂或细菌防腐剂使用，应用前景广阔。
附图说明
图1为本发明螺旋藻多肽P1对革兰氏阳性菌（以金黄色葡萄球菌为例）的抑菌效果。
图2为本发明螺旋藻多肽P1对革兰氏阴性菌（以大肠杆菌为例）的抑菌效果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1螺旋藻蛋白的提取
（1）将适量钝顶螺旋藻干粉溶于蒸馏水中，制成螺旋藻悬浮液，利用超声结合反复冻融法进行破壁处理。
（2）将步骤（1）得到的螺旋藻液离心（-4℃，8000r/min离心20min）收集上清液，将上清液用50%饱和NH4SO4进行盐析纯化。
（3）将步骤（2）盐析后得到的螺旋藻液冷冻离心（10000r/min离心20min），收集沉淀，用浓度为0.005M，pH为6.86的磷酸盐缓冲液溶解，于4℃下透析，透析终点用BaCl2进行检测。脱盐后进行真空冷冻干燥，得到螺旋藻蛋白。
实施例2螺旋藻混合多肽的提取
（1）将实施例1中制备的螺旋藻蛋白进行酶法水解，先使用碱性蛋白酶水解螺旋藻蛋白，酶解条件为：加酶量4300U/g，温度55℃，pH7.0，酶解160min；水解完毕后在85℃水浴中灭活酶15～20min。
（2）将步骤（1）的水解产物用木瓜蛋白进行进一步水解，酶解条件为：酶底比4.5%，温度60℃，pH6.5，酶解210min。水解结束后，于80℃水浴中灭活酶15～20min。
（3）将步骤（2）得到的水解产物在4℃，5000r/min离心20min，收集上清液，冻干得到螺旋藻多肽。
实施例3具有抑菌性的螺旋藻多肽的分离纯化及人工合成
（1）将实施例2中制备的螺旋藻混合多肽进行抑菌实验，采用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为实验菌种，确定其具有抑菌活性。
（2）将步骤（1）的具有抑菌性的混合多肽利用分子筛进行分离纯化，采用葡聚糖凝胶G-25柱层析，得到4个组分，分别对各组分进行抑菌实验，结果表明组分2具有抑菌活性。
（3）将步骤（2）得到的组分2利用反相高效液相制备色谱（Zorbax SB-C18柱4.6mm×250mm）进行分离纯化，得到4组峰，收集后分别进行抑菌实验，得到峰1具有抑菌活性。
（4）将步骤（3）得到的峰1利用分子筛进行分离纯化，采用superdex10/300GL柱层析，得到2个组分，分别进行抑菌实验，结果表明组分1具有抑菌活性。
（5）将步骤（4）得到的组分1进行测序，采用液质串联质谱法（液质联用双压线性离子阱质谱仪LTQ-Velos）及Sequest数据库检索得到组分1的氨基酸序列为KLVDASHRLATGDVAVRA，即螺旋藻多肽P1。
（6）将步骤（5）得到的多肽序列进行人工合成。HPLC检测纯度大于98%，同时通过质谱检测确定多肽合成质量。样品以冻干状态保存。
其中，步骤（1）中抑菌实验样品浓度为100mg/mL；步骤（2）中抑菌实验样品浓度为50mg/mL；步骤（3）、（4）中的样品由于是直接由色谱分离浓缩得到，未确定其准确浓度，但不影响抑菌实验结果，估算其浓度可达到mg/mL级别；步骤（6）中合成的多肽样品浓度为20mg/mL。
实施例4多肽抑菌活性实验检测
（1）菌悬液的制备：选取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为实验菌种。准备2个装有适量0.85%浓度生理盐水的三角烧瓶，灭菌后用接种环挑取3-4环经过24小时培养的活化菌接种于三角瓶中，混合均匀，600nm下测定OD值，当OD值达到0.1时即得到浓度为1×106-1×107cfu/ml的菌悬液。
（2）带菌平板的制备：将灭菌后的牛肉膏蛋白胨培养基按照每平皿15ml-20ml的量制成平板，凝固后，向每个培养皿中加入事先步骤（1）的菌悬液0.1ml，均匀涂布，待用。
其中，牛肉膏蛋白胨培养基的配制方法为：称取1.5g牛肉膏，5g蛋白胨，7.5g琼脂，2.5g NaCl，置于1000mL容量瓶中，加去离子水定容至刻度，摇匀备用。
（3）样品溶液制备：称取一定量的螺旋藻多肽粉末，用0.85%的生理盐水溶解，配成一定浓度的溶液。
（4）实验方法：利用无菌打孔器对带菌平板进行打孔，孔径为6mm，向孔中加待测样品0.1ml。然后将培养皿置于37℃恒温箱中培养24h，观察统计抑菌圈大小，抑菌圈直径以毫米计算。所有实验均重复三次，且在无菌环境下操作。溶剂对照为生理盐水。
结果表明，本发明的螺旋藻多肽P1对革兰氏阳性菌（以金黄色葡萄球菌为例）和革兰氏阴性菌（以大肠杆菌为例）均有一定抑菌效果，且对大肠杆菌的抑菌效果优于对金黄色葡萄球菌的抑菌效果。其中，当多肽P1的浓度为20mg/mL时，对大肠杆菌的抑菌圈直径为16.0mm（图1），对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为12.0mm（图2）。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种具有抑菌活性的螺旋藻多肽P1，其特征在于，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示。
2.权利要求1所述的螺旋藻多肽P1在制备广谱抗菌剂中的应用。
3.一种抗菌剂，其有效成分为权利要求1所述的螺旋藻多肽P1。
4.权利要求1所述的螺旋藻多肽P1在制备防腐剂中的应用。
5.一种防腐剂，其有效成分为权利要求1所述的螺旋藻多肽P1。
6.根据权利要求5所述的防腐剂，其特征在于，其为细菌防腐剂。
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