CN104830713B - 一株联产多种抗菌脂肽和γ‑聚谷氨酸的芽孢杆菌菌株 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，公开了一株能够联产多种抗菌脂肽和γ‑聚谷氨酸的芽孢杆菌菌株。该菌株为枯草芽孢杆菌LM3403，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9377。该菌株具有联产Surfactin、Fengycin、Iturin三种抗菌脂肽和γ‑聚谷氨酸的能力，可用于制备抗菌脂肽和γ‑聚谷氨酸，可应用于微生物饲料、饲料添加剂、微生物肥料、植物病害防治、食品防腐保鲜、化妆品、医药、环保等领域，具有十分巨大的应用价值和市场开发潜力。本发明的枯草芽孢杆菌菌株LM3403优点在于：具有联产Surfactin、Fengycin、Iturin三种抗菌脂肽和γ‑聚谷氨酸的能力，有利于降低生产成本、提高生产效率和拓宽应用范围，具有巨大的应用价值和市场开发潜力。

Description

一株联产多种抗菌脂肽和γ-聚谷氨酸的芽孢杆菌菌株

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株能够合成Surfactin、Fengycin、Iturin三种抗菌脂肽和γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌菌株。

背景技术

枯草芽孢杆菌是目前国际上公认的安全菌种之一，被美国FDA和环保署列为可商业上应用的微生物菌种，也是我国农业部规定的免做安全鉴定的一级菌种之一，已在生物肥料、生物饲料和生物农药等农业领域和食品领域得到了广泛的应用。

脂肽类化合物是枯草芽孢杆菌产生的最主要的抗菌物质，主要包括有Surfactin、Iturin和Fengycin三大家族，由1个β-羟基脂肪酸与7-10个氨基酸肽链以酰胺键连接成环肽。除具有优良的表面活性外，还具有抑制细菌、病毒、支原体、真菌、肿瘤等的作用。面对日益严重的食品微生物污染、农作物病原菌侵染、人畜致病菌抗药性，人民对食品安全和环境保护的日益关注，安全无毒、高效广谱的天然抗菌物质的开发已经成为当前食品、农业、医药等领域的研究热点。脂肽类抗菌物质因其抗菌谱宽、热稳定性好、适用pH范围广、不易抗药性等特点倍受关注，正开发应用于微生物饲料及其添加剂、微生物肥料、植物病害防治、食品防腐保鲜、医药化妆品、环保等多个领域。

γ-聚谷氨酸是微生物发酵合成的胞外粘性物质，由谷氨酸通过γ-酰胺键连接而成。γ-聚谷氨酸具有保水、增稠、乳化、成膜、缓释和黏接等功能，在食品、农业、医药、化妆品和环保等领域有着广泛的应用。在食品领域，γ-聚谷氨酸食用安全，可作为食品苦味掩盖剂，改善口感；可作为高钠调味剂的替代品，为高血压患者和糖尿病患者所用；能使面粉的抗冻性增加，用其制作蛋糕和面包时延缓面粉变质，维持食品外形；能增强钙的溶解度，促进钙在肠内的吸收，为骨质疏松患者也提供福音；还可以作为食品增稠剂、食品稳定剂、膳食纤维辅助材料、保健食品等。在农业领域，γ-聚谷氨酸可改善土壤结构，提高土壤保水性、透水性和透气性，最终改善土壤质量，提高农作物产量；可用作缓释剂，提高肥料、农药和除草剂等的利用率；可保持植物根系水分，具有良好的保水作用，用γ-聚谷氨酸处理种籽，使其外部形成保湿膜，有利于种子发芽、出苗和生根，尤其适用于干旱地区、沙漠改造和珍稀花卉苗木。在医药和化妆品领域，γ-聚谷氨酸主链上具有大量活性较高的游离羧基(-COOH)，使之容易结合一些药物形成比较稳定的复合物，是一种理想的可体内生物降解的医用高分子物质。γ-聚谷氨酸可作为化妆品支持材料、皮肤保湿剂、表皮因子缓释剂、天然美容面膜等；可改善药物的水溶性，提高药物的利用率，降低药物的毒副作用，增强药物的稳定性，提高药物的缓释和控制作用，增强药物的靶向作用。在环保领域，γ-聚谷氨酸可吸附重金属离子，对冶金、工业废水等的处理极具价值，而且还可作为阻垢剂来处理水垢，作为絮凝剂处理污水。

现有的菌株只能生产抗菌脂肽或者只能生产γ-聚谷氨酸或者只能生产一种抗菌脂肽和γ-聚谷氨酸，存在有生产成本高、原料利用率低、应用范围有限等问题，难以进行规模化生产和广泛应用；而本发明的菌株LM3403能够联产三种抗菌脂肽和γ-聚谷氨酸，可以大大降低生产成本和提高生产效率，更重要的是拓宽了菌株的应用范围。因此，本发明的菌株LM3403具有巨大的应用价值和市场开发潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一株能够联产多种抗菌脂肽和γ-聚谷氨酸的芽孢杆菌菌株以及该菌株的用途。

本发明提供的菌株LM3403可以用于生产三种抗菌脂肽、γ-聚谷氨酸，可以用于生产微生物饲料及其添加剂、微生物肥料，可以用于生产生防制剂防控植物病害，也可以用于生产医药化妆品添加剂、食品防腐剂、环保制剂等。

本发明提供的菌株LM3403已于2014年6月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.9377。枯草芽孢杆菌LM3403在NA平板上生长良好，菌落圆形、不透明，乳白色、边缘不整齐。细胞杆状，革兰氏阳性，芽孢中生、椭圆形。

本发明提供的枯草芽孢杆菌LM3403及其抗菌脂肽的特征为：

菌株LM3403具有合成Surfactin、Fengycin、Iturin三种抗菌脂肽的能力。ESI-MS质谱分析结果显示，m/z值1030、1044、1058处离子峰分别与C₁₃-Surfactin[M+Na⁺]、C₁₄-Surfactin[M+Na⁺]、C₁₅-Surfactin[M+Na⁺]分子量吻合，推测为脂肽Surfactin同系物；m/z值1065、1079、1093处离子峰分别与C₁₄-Iturin[M+Na⁺]、C₁₅-Iturin[M+Na⁺]、C₁₆-Iturin[M+Na⁺]分子量吻合，推测为脂肽Iturin同系物；m/z值1449、1463、1477处离子峰分别与C₁₅-Fengycin[M+H⁺]、C₁₆-Fengycin[M+H⁺]、C₁₇Fengycin[M+H⁺]分子量吻合，推测为脂肽Fengycin同系物。

本发明提供了以枯草芽孢杆菌LM3403或其发酵产物或含有枯草芽孢杆菌LM3403的菌剂在饲料领域、农业领域的应用。

本发明提供了以枯草芽孢杆菌LM3403或其发酵产物或含有枯草芽孢杆菌LM3403的菌剂在食品、医药、化妆品领域的应用。

本发明提供了以枯草芽孢杆菌LM3403或其发酵产物或含有枯草芽孢杆菌LM3403的菌剂在环境保护领域的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供了一株能够合成Surfactin、Fengycin、Iturin三种抗菌脂肽和γ-聚谷氨酸的芽孢杆菌菌株，可以大大降低生产成本和提高生产效率，更重要的是拓宽了菌株的应用范围。

本发明提供的菌株属于是国际上公认的安全菌种，被美国FDA和环保署列为可商业上应用的微生物菌种之一，也是我国农业部规定的免做安全鉴定的一级菌种之一。

本发明提供的菌株LM3403能够合成Surfactin、Fengycin、Iturin三种抗菌脂肽，抗菌谱广，适用范围大，协同作用下对病原细菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌等）、腐败真菌（黑曲霉、黄曲霉、灰绿曲霉、扩展青霉等）、病原真菌（禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、尖孢镰孢菌、链格孢霉、细极链格孢、根菌索菌、橄榄色盾壳霉、尖孢镰刀菌、灰葡萄孢、禾谷丝核菌、绿色木霉等）等均具有较好的抑制作用。

附图说明

图1 菌株LM3403菌落形态。

图2 菌株LM3403美兰染色。

图3 菌株LM3403抗菌脂肽合成酶基因扩增电泳图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1：广谱抑菌菌株LM3403的分离筛选

采集海拔3000米以上高寒无污染草原上生长的野牦牛牛粪样品。准确称取样品25g，放入装有玻璃珠和225mL无菌水的三角瓶中，振荡30min，得到样品悬液。在无菌条件下，用无菌水对样品悬液进行梯度稀释，得到不同稀释度的稀释液。分别吸取各稀释度的样品悬液0.1mL均匀涂布于NA平板上，30℃恒温培养24-36h后，观察长出菌落的形态、颜色、透明度等特征，挑取形态差异明显的菌落进行划线纯化、编号、保存备用。

采用滤纸片法考察待测细菌菌株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制能力，采用平板对峙培养法考察待测细菌菌株对病原真菌的抑制能力。将得到的广谱抗菌能力最强的菌株命名为LM3403。

实施例2：菌株LM3403种属鉴定

参照《常见细菌系统鉴定手册》进行菌株形态学观察和生理生化特性分析。菌株LM3403在NA平板上菌落圆形、不透明乳白色、较黏稠、边缘不整齐（见图1）；细胞呈杆状，革兰氏阳性，芽孢中生、椭圆形（见图2）。需氧生长：阳性，运动性：阳性，V-P试验：阳性，过氧化氢酶试验：阳性，吲哚试验：阳性，淀粉水解：阳性，酪蛋白水解：阳性，明胶液化：阳性，葡萄糖发酵试验：阳性，硝酸盐还原：阳性，尿素利用：阳性，菌株LM3403的形态特征、生理生化特征与枯草芽孢杆菌标准株保持一致。

利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA，以通用引物27F和1492R为引物，对菌株16S rDNA进行PCR扩增。PCR产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测后送交上海生工生物工程有限公司纯化测序。将测序结果与GenBank数据库中已知的16S rDNA序列进行BLAST比对。菌株PCR产物经纯化后测序得到1439bp的序列(GenBank登录号KJ906613)，经BLAST比对，发现菌株LM3403的16S rDNA序列与Bacillus subtilis strain SPA N1(JQ308575)、Bacillus subtilis strain ME2(JQ900623)和Bacillus subtilis strainBDT3(HQ711982)的同源性达到100%。

综合分析确定菌株LM3403为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

实施例3：菌株LM3403抗菌脂肽提取

将菌株发酵液于4℃、12000rpm离心15min，收集无菌上清液；用6mol/L的HCl将无菌上清液调至pH2.0，4℃静置过夜后12000r/min、4℃离心15min，收集沉淀；向沉淀中加入适量甲醇，于磁力搅拌器上搅拌30min后，放入4℃冰箱内静置抽提8h，抽提结束后4℃、12000rpm离心15min，得到甲醇抽提液。经减压浓缩、真空冷冻干燥后，得到抗菌物质，-20℃保存。取真空冷冻干燥后的抗菌物质，溶于pH7.0的磷酸缓冲液中，配制成一定浓度的抗菌物质溶液，4℃保存备用。

实施例4：菌株LM3403抗菌脂肽合成酶基因扩增

利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA，以表1中所列引物进行菌株LM3403抗菌脂肽合成酶基因的PCR扩增，PCR完成后经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测。sfp基因PCR条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，43℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。fenB基因PCR条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，50℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min。ituD基因PCR条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，48℃退火30s，72℃延伸1.5min，33个循环；72℃延伸10min。如图3所示，sfp基因、fenB基因、ituD基因均扩增成功，说明菌株LM3403具有合成Surfactin、Fengycin、Iturin的能力。

表1 抗菌脂肽合成酶基因引物信息表

实施例5：菌株LM3403产抗菌脂肽分析

样品红外光谱结果显示，1652cm⁻¹和1538.66cm⁻¹两处吸收分别为酰胺谱带Ⅰ和Ⅱ，表明样品中含有肽链；2960-2860cm⁻¹和1455-1380cm⁻¹两处吸收是脂肪酸链的C-H伸缩振动，1240cm⁻¹为内酯的特征吸收，表明样品中含有脂肪酸；故推测为脂肽类物质。样品茚三酮反应阴性，说明无自由N端；酸水解后茚三酮反应、双缩脲反应均阳性，故推测为环脂肽。

ESI-MS质谱分析结果显示，m/z值1030、1044、1058处离子峰分别与C₁₃-Surfactin[M+Na⁺]、C₁₄-Surfactin[M+Na⁺]、C₁₅-Surfactin[M+Na⁺]分子量吻合，推测为脂肽Surfactin同系物；m/z值1065、1079、1093处离子峰分别与C₁₄-Iturin[M+Na⁺]、C₁₅-Iturin[M+Na⁺]、C₁₆-Iturin[M+Na⁺]分子量吻合，推测为脂肽Iturin同系物；m/z值1449、1463、1477处离子峰分别与C₁₅-Fengycin[M+H⁺]、C₁₆-Fengycin[M+H⁺]、C₁₇Fengycin[M+H⁺]分子量吻合，推测为脂肽Fengycin同系物。

实施例6：菌株LM3403产抗菌脂肽抑菌谱

以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、黑曲霉、黄曲霉、灰绿曲霉、扩展青霉、禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、链格孢霉、细极链格孢、根菌索菌、橄榄色盾壳霉、尖孢镰刀菌、灰葡萄孢、禾谷丝核菌、绿色木霉为指示菌，采用牛津杯法测定菌株LM3403抗菌脂肽抑菌谱，结果见表2。

表2 菌株LM3403产抗菌脂肽抑菌谱

注：“+”表示抑菌带宽＜3mm，“++”表示抑菌带宽在3-5mm，“+++”表示抑菌带宽＞5mm

实施例7：菌株LM3403产γ-聚谷氨酸的提取

菌株发酵液加入2-4倍体积的去离子水进行稀释，后10000r/min下离心20min去除菌体，得无菌上清液。加入5-8倍体积的预冷无水乙醇，均匀搅拌后于4℃静置过夜，10000r/min下离心10min，收集沉淀。以少量无水乙醇洗涤沉淀2次，用少量去离子水溶解，再次离心去除不溶物，经去离子水反复透析去除盐、糖等小分子，透析液冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸样品，备用。

实施例8：菌株LM3403产γ-聚谷氨酸的鉴定

称取上述提取得到的γ-聚谷氨酸样品0.5g放入水解管中，加入6mol/L盐酸10mL，抽真空，于110℃下水解24h，冷却后移至100mL容量瓶定容，经0.45µm微孔滤膜过滤收集滤液。采用HPLC法检测酸水解滤液中谷氨酸及其含量，L-谷氨酸标准品作为对照。酸水解产物检测方法同L-谷氨酸标准品，衍生化之前先需将样品酸水解滤液pH调至中性。

将L-谷氨酸标准品0.1g和0.9mL的0.2mol/L的NaHCO₃混合均匀，取混合液0.1mL加入0.lmL的8g/L的DABS-Cl，30℃避光衍生30min后，加入0.2mL的0.01mol/L的盐酸终止反应。从中取反应液0.1mL，加0.9mL去离子水稀释，过滤后取上清液10µL进样进行HPLC。色谱柱Aglien SB-aq（150*4.6mm，5µm），柱温室温，检测波长334nm，流速1mL/min，流动相A：50mmol/L醋酸钠，流动相B：色谱甲醇。根据HPLC图谱显示，酸水解滤液HPLC主峰出峰时间与谷氨酸标准品出峰时间相同，推断酸水解滤液为单一的谷氨酸，说明菌株LM3403具有产γ-聚谷氨酸的能力。

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Claims (7)

1.一株联产抗菌脂肽和γ-聚谷氨酸的菌株，该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilius)LM3403，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9377。

2.权利要求1所述的菌株LM3403在制备抗菌脂肽方面的应用。

3.权利要求1所述的菌株LM3403在制备γ-聚谷氨酸方面的应用。

4.权利要求1所述的菌株LM3403在微生物饲料、饲料添加剂方面的应用。

5.权利要求1所述的菌株LM3403在微生物肥料、植物病害防治方面的应用。

6.权利要求1所述的菌株LM3403在食品、化妆品方面的应用。

7.权利要求1所述的菌株LM3403在医药、环保方面的应用。