CN107881124A - 一种产γ‑聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种产γ‑聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产γ‑聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌，其分类命名为Bacillus Subtilis，菌株号为XK，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2016605，保藏日期为2016年11月1日。本发明还公开了前述的枯草芽孢杆菌XK在生产γ‑聚谷氨酸中的应用。与现有技术相比，本发明以枯草芽孢杆菌XK为出发菌株，通过调节发酵培养基中硫酸锰和硫酸镁的浓度，得到小于100kDa、100～700kDa和大于700kDa三种不同分子量区间的γ‑聚谷氨酸，且产量均达到35g/L以上，在肥料、化妆品和污水处理等领域中均有良好的应用。同时，本发明工艺简单，适于工业化推广，具有良好的市场前景和经济效益。

Description

一种产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术
γ-聚谷氨酸是一种由D-谷氨酸单体和L-谷氨酸单体通过α-氨基和γ-羧基形成的酰胺键所连接起来的阴离子高聚物。因为γ-聚谷氨酸的水溶性、生物可降解性、可食用性和对人以及环境的无毒害性，近年来γ-聚谷氨酸和它的衍生物在各种领域得到广泛的应用，可以作为水处理中的絮凝剂、化妆品和药物中的成分以及作为肥料添加剂等。
目前，商业化的γ-聚谷氨酸的生产主要通过微生物深层液体发酵制得，常用的生产菌种枯草芽孢杆菌以味精为主要底物在胞外产生γ-聚谷氨酸。一般而言，由枯草芽孢杆菌产生的γ-聚谷氨酸的平均分子量在105～8×106Da之间，分子量越大，流变性也就越大，难以被化学试剂修饰，限制了γ-聚谷氨酸的应用。不同的行业领域对γ-聚谷氨酸的分子量都有不同的需求，污水处理中絮凝剂要求γ-聚谷氨酸分子量在1000kDa以上，用更多的γ-聚谷氨酸上的阴离子来吸引胶体微粒，通过粘附、交联形成更大的胶团从而达到絮凝的目的；化妆品行业要求γ-聚谷氨酸分子量在700kDa左右，作为产品里的保湿剂，减少皮肤表面水分的散失速率；一些肥料助剂等产品要求γ-聚谷氨酸分子量在80kDa以下，与普通肥料配合施用，在植物根部形成保护膜的同时使得肥料的利用率更高。
现在工业生产中常用酸/碱水解法来获得低分子量的γ-聚谷氨酸。惠明等在研究pH值对聚谷氨酸结构的影响时发现，γ-聚谷氨酸在低pH值呈低分子质量片段，并且在酸性溶液中和至pH中性后，碎片状的γ-聚谷氨酸不能恢复到中性状态时的长链状规则结构。中国专利CN 105296558 A公开了一种通过调整和优化发酵工艺来生产低分子量γ-聚谷氨酸的方法，在不同的发酵阶段，控制不同的培养温度、通气流量、搅拌速度以得到低分子量的(35-260kDa)的γ-聚谷氨酸发酵液。中国专利CN 105385717 A公开了一种铁离子在枯草芽孢杆菌发酵生产低分子量γ-聚谷氨酸的应用，使得高于245kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸的百分数从原来的66.16％下降到27.38％～4.01％，而低于100kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸的百分数从原来的4.59％上升到33.13％～81.03％。
目前，得到低分子量γ-聚谷氨酸的方法不是后续工艺复杂，有较高的γ-聚谷氨酸损失率，就是低分子量γ-聚谷氨酸占总聚谷氨酸的比例较低。因此，需要一种在发酵过程中通过调节工艺就能得到不同分子量γ-聚谷氨酸的方法，同时该方法还要有较高的低分子量γ-聚谷氨酸产量。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌，以解决现有技术存在的产率较低等问题。
本发明还要解决的技术问题是提供上述产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌，其分类命名为Bacillus Subtilis，菌株号为XK，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉市武汉大学，邮编为430072，保藏编号为CCTCC M 2016605，保藏日期为2016年11月1日。
测得菌株XK的16S rDNA的大部分序列1420bp，见核苷酸或氨基酸序列表。将所测序列从GenBank数据库中的相关中进行比较，构建以16S rDNA全序列为基础的系统发育树。结果表明：菌株XK与枯草芽孢杆菌(Bacillus Sbubtilis)同源性为99％。结合形态、细胞化学成分及16S rDNA全系列分析的系统发育研究结果，可以将其分类定位为枯草芽孢杆菌。
上述产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌在生产γ-聚谷氨酸中的应用。
其中，所述的应用方法为：将产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌依次接种于种子培养基和发酵培养基中进行好氧培养，发酵得到γ-聚谷氨酸。
利用产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌XK发酵生产γ-聚谷氨酸的方法具体如下：
(1)种子液的制备：将枯草芽孢杆菌XK接种到种子培养基中，摇床转速120～200rpm，28～36℃下培养10～18h至OD660大于5.0，得到种子液；
(2)发酵培养：将步骤(1)中得到的种子液以2～10％的接种量接种于发酵培养基中，7.5L发酵罐发酵培养基装液量为4L，通气比控制在1.0～1.5VVM，初始pH为6.5～7.2、在28～36℃培养24～72小时，得到发酵液；
(3)步骤(2)中得到的发酵液经过稀释(浓度在1g/L以下)，然后通过高效液相色谱对发酵液中γ-聚谷氨酸分子量和产量进行检测。
其中，所述的种子培养基的配方为：谷氨酸或谷氨酸盐10～95g/L，碳源15～100g/L，氮源5～50g/L，其他无机盐0.05～35g/L，其余为水，pH为6.5～7.2。
其中，所述的发酵培养基的配方为：谷氨酸或谷氨酸盐10～95g/L，碳源15～100g/L，氮源5～50g/L，硫酸锰0～1g/L，硫酸镁0.05～2g/L，其他无机盐0.05～35g/L，其余为水，pH为6.5～7.2。
其中，种子培养基和发酵培养基中，
所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、柠檬酸、甘油和糖蜜中的任意一种或几种的组合，优选碳源为葡萄糖和/或柠檬酸，进一步优选为柠檬酸；
所述的氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4、NH4Cl和NH4NO3中的任意一种或几种的组合，优选氮源为豆饼粉、酵母膏和(NH4)2SO4中的任意一种或几种的组合，进一步优选为豆饼粉；
所述的其他无机盐为磷酸盐、磷酸二氢盐和盐酸盐中的任意一种或几种的组合。
其中，
当0≤硫酸锰浓度＜0.1g/L，1≤硫酸镁浓度＜2g/L时，发酵得到的γ-聚谷氨酸的分子量＜100kDa，最佳产量达到46.5g/L；该分子量的γ-聚谷氨酸与农业肥料配合使用，具有明显的增产效果。
当0.1≤硫酸锰浓度＜0.5g/L，0.5≤硫酸镁浓度＜1g/L时，100≤发酵得到的γ-聚谷氨酸的分子量＜700kDa，最佳产量达到43.8g/L；该分子量的γ-聚谷氨酸可应用于化妆品中，具有更好的保湿性能。
当0.5≤硫酸锰浓度＜1g/L，0.05≤硫酸镁浓度＜0.5g/L时，发酵得到的γ-聚谷氨酸的分子量＞700kDa，最佳产量达到39.5g/L；该分子量的γ-聚谷氨酸在污水处理中作为絮凝剂使用，具有良好的效果。
有益效果：
与现有技术相比，本发明以枯草芽孢杆菌XK为出发菌株，通过调节发酵培养基中硫酸锰和硫酸镁的浓度，得到小于100kDa、100～700kDa和大于700kDa三种不同分子量区间的γ-聚谷氨酸，且产量均达到35g/L以上。同时，本发明工艺简单，适于工业化推广，具有良好的市场前景和经济效益。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
利用产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌XK发酵生产γ-聚谷氨酸，具体步骤如下：
(1)种子液的制备：将枯草芽孢杆菌接种到含有谷氨酸钠(45g/L)、柠檬酸(50g/L)、豆饼粉(40g/L)、磷酸二氢钾(1g/L)和水的发酵培养基中，摇床转速120～200rpm,28～36℃下培养10～18h至OD660大于5.0；
(2)发酵培养：将步骤(1)中的种子液以3％的接种量接种于含有谷氨酸钠(45g/L)、柠檬酸(50g/L)、豆饼粉(40g/L)、磷酸二氢钾(1g/L)、硫酸锰(0.05g/L)、硫酸镁(1.2g/L)的发酵培养基中，7.5L发酵罐发酵培养基装液量为4L，通气比控制在1.0vvm，初始pH为6.5、在28℃培养48h；
(3)发酵液经过稀释(浓度在1g/L以下)，然后通过高效液相色谱对发酵液中γ-聚谷氨酸分子量和产量进行检测。生产的γ-聚谷氨酸分子量约为50kDa，而且γ-聚谷氨酸产量为46.5g/L。
实施例2：
种子液的制备与实施例1中相同。
(1)发酵培养：将种子液以4％的接种量接种于发酵培养基中，培养基中含有谷氨酸钠(65g/L)、柠檬酸(34g/L)、豆饼粉(20g/L)、磷酸二氢钾(1g/L)、硫酸锰(0.09g/L)、硫酸镁(1.8g/L)的发酵培养基中，7.5L发酵罐发酵培养基装液量为4L，通气比控制在1.5vvm，初始pH为6.9、在32℃培养52h；
(2)发酵液经过稀释(浓度在1g/L以下)，然后通过高效液相色谱对发酵液中γ-聚谷氨酸分子量和产量进行检测。生产的γ-聚谷氨酸分子量约为89kDa，而且γ-聚谷氨酸产量为42.7g/L。
实施例3：
种子液的制备与实施例1中相同。
(1)发酵培养：将种子液以3％的接种量接种于发酵培养基中，培养基中含有谷氨酸钠(51g/L)、柠檬酸(29g/L)、豆饼粉(37g/L)、磷酸二氢钾(1g/L)、硫酸锰(0.02g/L)、硫酸镁(1.1g/L)的发酵培养基中，7.5L发酵罐发酵培养基装液量为4L，通气比控制在1.2vvm，初始pH为6.5、在34℃培养36h；
(2)发酵液经过稀释(浓度在1g/L以下)，然后通过高效液相色谱对发酵液中γ-聚谷氨酸分子量和产量进行检测。生产的γ-聚谷氨酸分子量约为38kDa，而且γ-聚谷氨酸产量为36.8g/L。
实施例4：
种子液的制备与实施例1中相同。
(1)发酵培养：将种子液以2％的接种量接种于发酵培养基中，培养基中含有谷氨酸钠(45g/L)、柠檬酸(50g/L)、豆饼粉(40g/L)、磷酸二氢钾(1g/L)、硫酸锰(0.2g/L)、硫酸镁(0.8g/L)的发酵培养基中，7.5L发酵罐发酵培养基装液量为4L，通气比控制在1.3vvm，初始pH为7.1、在30℃培养48h；
(2)发酵液经过稀释(浓度在1g/L以下)，然后通过高效液相色谱对发酵液中γ-聚谷氨酸分子量和产量进行检测。生产的γ-聚谷氨酸分子量约为560kDa，而且γ-聚谷氨酸产量为43.8g/L。
实施例5：
种子液的制备与实施例1中相同。
(1)发酵培养：将种子液以2％的接种量接种于发酵培养基中，培养基中含有谷氨酸钠(95g/L)、柠檬酸(89g/L)、豆饼粉(50g/L)、磷酸二氢钾(0.5g/L)、硫酸锰(0.5g/L)、硫酸镁(1.0g/L)的发酵培养基中，7.5L发酵罐发酵培养基装液量为4L，通气比控制在1.3vvm，初始pH为7.0、在30℃培养52h；
(2)发酵液经过稀释(浓度在1g/L以下)，然后通过高效液相色谱对发酵液中γ-聚谷氨酸分子量和产量进行检测。生产的γ-聚谷氨酸分子量约为340kDa，而且γ-聚谷氨酸产量为40.9g/L。
实施例6：
种子液的制备与实施例1中相同。
(1)发酵培养：将种子液以8％的接种量接种于发酵培养基中，培养基中含有谷氨酸钠(39g/L)、柠檬酸(30g/L)、豆饼粉(50g/L)、磷酸二氢钾(1g/L)、硫酸锰(0.1g/L)、硫酸镁(0.5g/L)的发酵培养基中，7.5L发酵罐发酵培养基装液量为4L，通气比控制在1.0vvm，初始pH为7.1、在30℃培养72h；
(2)发酵液经过稀释(浓度在1g/L以下)，然后通过高效液相色谱对发酵液中γ-聚谷氨酸分子量和产量进行检测。生产的γ-聚谷氨酸分子量约为190kDa，而且γ-聚谷氨酸产量为35.2g/L。
实施例7：
种子液的制备与实施例1相同。
(1)发酵培养：将种子液以5％的接种量接种于含有谷氨酸钠(45g/L)、柠檬酸(50g/L)、豆饼粉(40g/L)、磷酸二氢钾(1g/L)、硫酸锰(0.6g/L)、硫酸镁(0.2g/L)的发酵培养基中，7.5L发酵罐发酵培养基装液量为4L，通气比控制在1.5vvm，初始pH为7.2、在33℃培养46h；
(2)发酵液经过稀释(浓度在1g/L以下)，然后通过高效液相色谱对发酵液中γ-聚谷氨酸分子量和产量进行检测。生产的γ-聚谷氨酸分子量约为1190kDa，而且γ-聚谷氨酸产量为39.5g/L。
实施例8：
种子液的制备与实施例1相同。
(1)发酵培养：将种子液以2％的接种量接种于含有谷氨酸钠(83g/L)、柠檬酸(51g/L)、豆饼粉(39g/L)、磷酸二氢钾(1g/L)、硫酸锰(1.0g/L)、硫酸镁(0.05g/L)的发酵培养基中，7.5L发酵罐发酵培养基装液量为4L，通气比控制在1.1vvm，初始pH为7.1、在35℃培养68h；
(2)发酵液经过稀释(浓度在1g/L以下)，然后通过高效液相色谱对发酵液中γ-聚谷氨酸分子量和产量进行检测。生产的γ-聚谷氨酸分子量约为960kDa，而且γ-聚谷氨酸产量为38.1g/L。
实施例9：
种子液的制备与实施例1相同。
(1)发酵培养：将种子液以5％的接种量接种于含有谷氨酸钠(49g/L)、柠檬酸(59g/L)、豆饼粉(43g/L)、磷酸二氢钾(1g/L)、硫酸锰(0.5g/L)、硫酸镁(0.1g/L)的发酵培养基中，7.5L发酵罐发酵培养基装液量为4L，通气比控制在1.5vvm，初始pH为7.2、在33℃培养46h；
(2)发酵液经过稀释(浓度在1g/L以下)，然后通过高效液相色谱对发酵液中γ-聚谷氨酸分子量和产量进行检测。生产的γ-聚谷氨酸分子量约为780kDa，而且γ-聚谷氨酸产量为35.4g/L。
实施例10：γ-聚谷氨酸在肥料中的利用
以盆栽小青菜为实验对象，试验设为3个处理，其中处理1不做任何处理作为空白对照，处理2施加普通肥料，处理3施加含有0.2％γ-聚谷氨酸发酵液的普通肥料，其中添加的γ-聚谷氨酸发酵液为实施例1所得分子量为50kDa的γ-聚谷氨酸。
表1不同肥料对盆栽小青菜生长特性及产量的影响
处理 叶数 颗重(g)
1 13±1 130±4
2 15±1 139±5
3 17±1 148±4
施加普通肥料对小青菜的生长有着显著地影响，能够增加小青菜的叶数和颗重，而γ-聚谷氨酸和肥料的配合使用，更能够发挥肥料的效果，使得小青菜的增产效果更明显。
实施例11：γ-聚谷氨酸在化妆品中用作保湿剂
本实施例中所使用的γ-聚谷氨酸是实施例4所得到的分子量为560kDa的γ-聚谷氨酸。对实施例4中的发酵液进行半框过滤、酒精沉淀、真空干燥得到的γ-聚谷氨酸粉末，然后和透明质酸和胶原蛋白的保水性进行比较。
根据专利CN 105411975 A所述的无水化妆品配方：γ-聚谷氨酸1％-6％,分散剂11％-15％，稳定剂29％-32％，油性基质50％-58％。具体的γ-聚谷氨酸组化妆品使用4％实施例4所得到的分子量为560kDa的γ-聚谷氨酸做保湿剂，13％辛酸甘油酯做分散剂，30％聚二甲基硅氧烷做稳定剂，53％甘油做油性基质；具体的透明质酸组化妆品使用4％透明质酸做保湿剂，13％辛酸甘油酯做分散剂，30％聚二甲基硅氧烷做稳定剂，53％甘油做油性基质；具体的胶原蛋白组化妆品使用4％胶原蛋白做保湿剂，13％辛酸甘油酯做分散剂，30％聚二甲基硅氧烷做稳定剂，53％甘油做油性基质。将三组化妆品等量地分别涂在实验者手臂上同样大小的3片皮肤上，使用皮肤湿分测试仪SK-08测试水分含量，测得的样品水分含量占皮肤含水量的比例为P％如表2所示：
表2三组化妆品对皮肤保湿性能的影响
组别 γ-聚谷氨酸 透明质酸 胶原蛋白
P 59.7±2.5 51.3±1.9 48.5±2.3
注：数值表示为平均值±标准差
由表2可知，添加分子量为560kDa的γ-聚谷氨酸做保湿剂的化妆品在皮肤上的保湿性能最好，这说明该分子量的γ-聚谷氨酸在化妆品方面有着替代透明质酸和胶原蛋白的潜力。
实施例12：γ-聚谷氨酸在污水处理中作为絮凝剂使用
本实施例中所使用的γ-聚谷氨酸是实施例7所得到的分子量为1190kDa的γ-聚谷氨酸。
在1L烧杯中加入495mL蒸馏水，5毫升实施例7中得到的γ-聚谷氨酸发酵液，精确称取2.0g氢氧化钙，倒入烧杯中，调节pH至7.4，同时搅拌5分钟，静置10分钟。用塑料滴管吸取液体高度二分之一的液层，测定570nm处的吸光度，以不加γ-聚谷氨酸溶液的氢氧化钙悬浮液做对照来确定絮凝剂的絮凝活性，并且以絮凝率来表示，根据测得的吸光度计算出来的絮凝率为64.5％。具体的计算方法见参考文献(《浙江工业大学学报》2008年12月第36卷第6期647-650页，共4页)。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京轩凯生物科技有限公司
<120> 一种产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌及其应用
<130> SG161213001
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1420
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌XK的16S rDNA序列
<400> 1
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cccgaagtcg gtgaggtaac cttttaggag ccagccgccg 1420

Claims (10)

1.一种产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌，其分类命名为Bacillus Subtilis，菌株号为XK，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2016605，保藏日期为2016年11月1日。
2.权利要求1所述的产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌在生产γ-聚谷氨酸中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的应用方法为：将产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌依次接种于种子培养基和发酵培养基中进行好氧培养，发酵得到γ-聚谷氨酸。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的种子培养基的配方为：谷氨酸或谷氨酸盐10～95g/L，碳源15～100g/L，氮源5～50g/L，其他无机盐0.05～35g/L，其余为水，pH为6.5～7.2。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基的配方为：谷氨酸或谷氨酸盐10～95g/L，碳源15～100g/L，氮源5～50g/L，硫酸锰0～1g/L，硫酸镁0.05～2g/L，其他无机盐0.05～35g/L，其余为水，pH为6.5～7.2。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、柠檬酸、甘油和糖蜜中的任意一种或几种的组合。
7.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述的氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4、NH4Cl和NH4NO3中的任意一种或几种的组合。
8.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述的其他无机盐为磷酸盐、磷酸二氢盐和盐酸盐中的任意一种或几种的组合。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，
当0≤硫酸锰浓度＜0.1g/L，1≤硫酸镁浓度＜2g/L时，发酵得到的γ-聚谷氨酸的分子量＜100kDa；
当0.1≤硫酸锰浓度＜0.5g/L，0.5≤硫酸镁浓度＜1g/L时，100≤发酵得到的γ-聚谷氨酸的分子量＜700kDa；
当0.5≤硫酸锰浓度＜1g/L，0.05≤硫酸镁浓度＜0.5g/L时，发酵得到的γ-聚谷氨酸的分子量＞700kDa；
10.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在种子培养基中，培养温度为28～36℃，培养时间为10～18h；在发酵培养基中，培养温度为28～36℃，培养时间为24～72h。
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