CN107828702A - 一种春雷霉素发酵培养基及发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种春雷霉素发酵培养基及发酵方法，包括如下步骤：（1）配置培养基，将培养基消毒，灭菌；所述的培养基的配方为：黄豆粕粉5.0～8.0%；NaCl：0.3～0.5%；玉米浆干粉：0.5～1.0%；麦芽糖：2.0～2.5%；鱼油：3.5～4.0%；KH₂PO₄：0.03～0.05%；肌醇：0.01%～0.05%；pH值为6.8～7.2；（2）在培养基中接种小金色链霉菌株，接种量为10～15vol%，在28～30℃发酵168～170h，对发酵产物过滤，取滤液，即得。本发明实现春雷霉素发酵效价提高，发酵周期缩短，从而达到降低生产成本，提升产品品质。

Description

一种春雷霉素发酵培养基及发酵方法

技术领域

本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种春雷霉素发酵培养基及发酵方法。

背景技术

春雷霉素（Kasugamycin）由春日链霉菌（Streptomyces kasugaensis）所产生，属氨基糖苷类抗生素，于1964年4月从日本奈良县春日神社境内发现，故又名春日霉素。我国于1963年从江西土良地区也分离到一株春雷霉素产生菌，与日本菌株在碳源利用和各种培养基上培养特征有很多不同之处，故命名为小金色链霉菌（S. microaureus）。

春雷霉素自研发以来，其在亚洲和南美洲就被广泛应用于农业。它对水稻稻瘟病（包括叶瘟、稻头瘟、谷瘟）等的防治尤为显著，一般可达到80%以上。不仅如此，春雷霉素的适用作物还包括马铃薯、黄瓜、芹菜、高粱、辣椒、菜豆、柑橘等，可防治甜菜上的甜菜生尾孢、马铃薯上的胡萝卜软鸥文氏菌、菜豆上的栖菜豆假单孢菌、黄瓜上的流泪假单孢菌、番茄叶霉病、黄瓜细菌性角斑病等。

值得一提的是，因春雷霉素对人畜无毒、无残留、无污染，符合现代环保要求，被中国绿色食品发展中心推荐为AA级绿色食品生产资料，被农业部列为无公害农产品生产推荐农药，被上海市列为蔬菜标准化工程首推杀菌剂。随着人们对农药安全意识的提高，春雷霉素高效、广谱、无公害的生物特性展示了越来越广泛的市场前景。由于其具有显著的抗植物病原真菌活性，故自创制成功便在农业上广泛使用。其低毒，安全，高效，对环境友好，是目前最具推广前景的绿色农药之一，也是当前农作物病虫害防治中具有广阔发展前景的农药之一。

春雷霉素的结构由二碳侧链( two-carbon side chain )、春雷胺( kasugamine)、D-肌醇( D-inositol )三部分组成（如下式）。

目前，国内春雷霉素的发酵生产采用三级发酵模式，该方式存在的主要问题有以下几点：

1、工业化大生产发酵水平较低，其发酵水平维持在10000～12000ug/ml左右。

2、春雷霉素大生产发酵周期长，一般在200h左右，能耗高。

3、春雷霉素发酵生产成本较高，产品缺乏市场竞争力。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，降低春雷霉素的生产成本，有效提高春雷霉素发酵效价，本发明旨在提供一种春雷霉素发酵培养基及发酵方法，实现春雷霉素发酵效价提高，发酵周期缩短，从而达到降低生产成本，提升产品品质。

本发明采用如下技术方案：一种春雷霉素发酵培养基，所述的培养基的配方为：黄豆粕粉5.0～8.0%；NaCl：0.3～0.5%；玉米浆干粉：0.5～1.0%；麦芽糖：2.0～2.5%；鱼油：3.5～4.0%；KH₂PO₄：0.03～0.05%；肌醇：0.01%～0.05%；pH值为6.8～7.2。

在本发明的优选的实施方案中，所述肌醇来源为春季玉米的肌醇，由玉米浸泡液中的植酸钠水解提取，浓度优选为0.03%。

本发明还保护一种春雷霉素发酵培养基的发酵方法，包括如下步骤：

（1）培养基配方：黄豆粕粉5.0～8.0%；NaCl：0.3～0.5%；玉米浆干粉：0.5～1.0%；麦芽糖：2.0～2.5%；鱼油：3.5～4.0%；KH₂PO₄：0.03～0.05%；肌醇：0.01%～0.05%；pH值为6.8～7.2；

（2）配制方法为：①称取黄豆粕粉、NaCl、玉米浆干粉、麦芽糖、鱼油、KH₂PO₄和肌醇，加水溶解均匀，定容到消前体积；②用30%NaOH调pH6.8～7.2；

（3）灭菌：在121～125℃高温下消毒，灭菌；

（4）接种：培养基温度降到30℃接种春雷霉素种子液，发酵培养；

（5）发酵条件：温度28～30℃，发酵168～170h，收集发酵产物，过滤，取滤液，即得。

在本发明的优选的实施方案中，步骤（3）的灭菌时间为30min。

在本发明的优选的实施方案中，步骤（4）中，小金色链霉菌株的接种量为10～15vol%，优选为15vol%。

在本发明的优选的实施方案中，步骤（5）中的发酵条件还包括：通气量1:1、搅拌转速150～200rpm、罐压0.02MPa。

在本发明的优选的实施方案中，所述发酵方法包括如下步骤：

（1）配置总体积为1000L的培养基，所述培养基含有终浓度为：黄豆粕粉 8.0%；NaCl0.5%；玉米浆干粉 0.8%；麦芽糖 2.5%；鱼油 3.5%；KH₂PO₄ 0.03%；肌醇 0.03%；pH值为7.0，将所述培养基121～125℃高温下消毒，灭菌30min；

（2）培养基温度降到30℃时，在培养基中接种小金色链霉菌株，接种量为10～15vol%，在28～30℃发酵168～170h，对发酵产物过滤，取滤液，即得。

采用HPLC法分析春雷霉素效价和纯度，春雷霉素发酵168～170h后，取10mL发酵液于试管中，用2mol/L的盐酸调pH2.0～3.0左右，将发酵液酸化处理可以破坏链霉菌的细胞，从而达到释放菌体中春雷霉素的作用，然后将菌液置于恒温水浴锅内80～85℃左右孵育15～20min，最后将理好的菌液倒入离心管内，5000r/min离心15min，用移液枪吸取上清液待用。本发明得到的滤液的春雷霉素效价经过，可达到16000ug/ml以上，远高于现有方法所得的滤液效价结果10000～12000ug/ml。此发酵培养基及发酵方法对提高春雷霉素效价的作用显著。

与现有技术相比，本发明设计出新的春雷霉素发酵培养基，各组分相互配合，并且结合本发明的发酵方法能够使得发酵菌株对发酵培养基的利用率提高，利用率可以达到85%以上，平均能够缩短约24h的发酵时间，显著提高发酵液中春雷霉素的含量，一般的，发酵液中春雷霉素的平均效价不低于16000ug/ml，对国内春雷霉素的发酵生产具有很重要的现实意义。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明并不仅仅局限于下述实施例。

实施例1

本实施例公开了发酵春雷霉素的一种具体实施方式，包括如下步骤：

（1）配制培养基，按照春雷霉素液体发酵培养基配方配比，配制1000L培养基；

黄豆粕粉8.0% NaCl 0.5% 玉米浆干粉0.8% 麦芽糖2.5%

鱼油3.5% KH₂PO₄ 0.03% 肌醇0.03% pH7.0。

（2）将所述培养基在121～125℃高温下消毒，灭菌30min。

（3）培养基温度降到30℃接种春雷霉素种子液，接种量15vol%，发酵培养。

（4）发酵温度28～30℃、通气量1:1、搅拌转速180rpm、罐压0.02MPa，条件下发酵170h，收集发酵清液提纯获得春雷霉素。

（5）取10mL发酵液于试管中，用2mol/L的盐酸调pH2.0～3.0左右，然后将菌液置于恒温水浴锅内80～85℃左右孵育15～20min，最后将理好的菌液倒入离心管内，5000r/min离心15min，用移液枪吸取上清液待用。测定该滤液的春雷霉素效价17523ug/ml。

实施例2

本实施例与实施例1的不同仅在于调整了发酵配方配比。

（1）配制培养基，按照春雷霉素液体发酵培养基配方配比，配制1000L培养基；

黄豆粕粉5.0% NaCl 0.3% 玉米浆干粉0.5% 麦芽糖2.0%

鱼油3.5% KH₂PO₄ 0.03% 肌醇0.01% pH6.8。

（2）将所述培养基在121～125℃高温下消毒，灭菌30min。

（3）培养基温度降到30℃接种春雷霉素种子液，接种量15vol%，发酵培养。

（4）发酵温度28～30℃、通气量1:1、搅拌转速180rpm、罐压0.02MPa，条件下发酵170h，收集发酵清液提纯获得春雷霉素。

（5）取10mL发酵液于试管中，用2mol/L的盐酸调pH2.0～3.0左右，然后将菌液置于恒温水浴锅内80～85℃左右孵育15～20min，最后将理好的菌液倒入离心管内，5000r/min离心15min，用移液枪吸取上清液待用。测定该滤液的春雷霉素效价15962ug/ml。

实施例3

本实施例与实施例1的不同仅在于调整了发酵配方配比。

（1）配制培养基，按照春雷霉素液体发酵培养基配方配比，配制1000L培养基；

黄豆粕粉8.0% NaCl 0.5% 玉米浆干粉1.0% 麦芽糖2.5%

鱼油4.0% KH₂PO₄ 0.05% 肌醇0.05% pH7.2。

（2）将所述培养基在121～125℃高温下消毒，灭菌30min。

（3）培养基温度降到30℃接种春雷霉素种子液，接种量15vol%，发酵培养。

（4）发酵温度28～30℃、通气量1:1、搅拌转速180rpm、罐压0.02MPa，条件下发酵170h，收集发酵清液提纯获得春雷霉素。

（5）取10mL发酵液于试管中，用2mol/L的盐酸调pH2.0～3.0左右，然后将菌液置于恒温水浴锅内80～85℃左右孵育15～20min，最后将理好的菌液倒入离心管内，5000r/min离心15min，用移液枪吸取上清液待用。测定该滤液的春雷霉素效价15010ug/ml。

实施例4

本实施例与实施例1的不同仅在于没有添加肌醇。

（1）配制培养基，按照春雷霉素液体发酵培养基配方配比，配制1000L培养基；

黄豆粕粉8.0% NaCl 0.5% 玉米浆干粉 1.0% 麦芽糖2.5%

鱼油4.0% KH₂PO₄ 0.05% pH7.2。

（2）将所述培养基在121～125℃高温下消毒，灭菌30min。

（3）培养基温度降到30℃接种春雷霉素种子液，接种量15vol%，发酵培养。

（4）发酵温度28～30℃、通气量1:1、搅拌转速180rpm、罐压0.02MPa，条件下发酵170h，收集发酵清液提纯获得春雷霉素。

（5）取10mL发酵液于试管中，用2mol/L的盐酸调pH2.0～3.0左右，然后将菌液置于恒温水浴锅内80～85℃左右孵育15～20min，最后将理好的菌液倒入离心管内，5000r/min离心15min，用移液枪吸取上清液待用。测定该滤液的春雷霉素效价9803ug/ml。

实施例5

本实施例与实施例1的不同仅在于：

（1）配制培养基，按照表1，配制6份各1000L培养基。

（2）将所述培养基在121～125℃高温下消毒，灭菌30min。

（3）培养基温度降到30℃接种春雷霉素种子液，接种量15vol%，发酵培养。

（4）发酵温度28～30℃、通气量1:1、搅拌转速180rpm、罐压0.02MPa，条件下发酵170h，收集发酵清液提纯获得春雷霉素。

（5）取10mL发酵液于试管中，用2mol/L的盐酸调pH2.0～3.0左右，然后将菌液置于恒温水浴锅内80～85℃左右孵育15～20min，最后将理好的菌液倒入离心管内，5000r/min离心15min，用移液枪吸取上清液待用。测定该滤液的春雷霉素效价（见表1）。

表1 春雷霉素液体发酵培养基及效价

上述结果表明，当向培养基中加入肌醇的浓度为0.01%～0.03%时，其提高春雷霉素效价的作用显著，当肌醇浓度大于0.03%时，春雷霉素发酵效价有所下降，这说明肌醇作为培养基基质浓度超过一定的范围反而不利于小金色链霉菌代谢春雷霉素。所以，本发明专利的肌醇优选浓度为0.03%，这时其与其他培养基的成分相互配合取得的春雷霉素效价最高。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种春雷霉素发酵培养基，其特征在于，所述的培养基的配方为：黄豆粕粉5.0～8.0%；NaCl：0.3～0.5%；玉米浆干粉：0.5～1.0%；麦芽糖：2.0～2.5%；鱼油：3.5～4.0%；KH₂PO₄：0.03～0.05%；肌醇：0.01%～0.05%；pH值为6.8～7.2。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述肌醇来源为春季玉米的肌醇，由玉米浸泡液中的植酸钠水解提取，浓度优选为0.03%。

3.一种春雷霉素发酵培养基的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1) 培养基配方：黄豆粕粉5.0～8.0%；NaCl：0.3～0.5%；玉米浆干粉：0.5～1.0%；麦芽糖：2.0～2.5%；鱼油：3.5～4.0%；KH₂PO₄：0.03～0.05%；肌醇：0.01%～0.05%；pH值为6.8～7.2；

(2) 配制方法为：①称取黄豆粕粉、NaCl、玉米浆干粉、麦芽糖、鱼油、KH₂PO₄和肌醇，加水溶解均匀，定容到消前体积；②用30%NaOH调pH6.8～7.2；

(3) 灭菌：在121～125℃高温下消毒，灭菌；

(4) 接种：培养基温度降到30℃接种春雷霉素种子液，发酵培养；

(5) 发酵条件：温度28～30℃，发酵168～170h，收集发酵产物，过滤，取滤液，即得。

4.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，步骤（3）的灭菌时间为30min。

5.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，步骤（4）中，小金色链霉菌株的接种量为10～15vol%，优选为15vol%。

6.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，步骤（5）中的发酵条件还包括：通气量1:1、搅拌转速150～200rpm、罐压0.02MPa。

7.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵方法包括如下步骤：

（1）配置总体积为1000L的培养基，所述培养基含有终浓度为：黄豆粕粉 8.0%；NaCl0.5%；玉米浆干粉 0.8%；麦芽糖 2.5%；鱼油 3.5%；KH₂PO₄ 0.03%；肌醇 0.03%；pH值为7.0，将所述培养基121～125℃高温下消毒，灭菌30min；

（2）培养基温度降到30℃时，在培养基中接种小金色链霉菌株，接种量为10～15vol%，在28～30℃发酵168～170h，对发酵产物过滤，取滤液，即得。