CN105543312A - 基于微生物发酵的n-乙酰-d-氨基葡萄糖的制备方法 - Google Patents

基于微生物发酵的n-乙酰-d-氨基葡萄糖的制备方法 Download PDF

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CN105543312A CN201610064158.4A CN201610064158A CN105543312A CN 105543312 A CN105543312 A CN 105543312A CN 201610064158 A CN201610064158 A CN 201610064158A CN 105543312 A CN105543312 A CN 105543312A
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Abstract

本发明实施例涉及一种基于微生物发酵的N-乙酰-D-氨基葡萄糖的制备方法，先将经过特殊保存的工程菌种(产N-乙酰-D-氨基葡萄糖代谢短杆菌)进行两级培养，然后将发酵培养基移入30000L发酵罐中，同时加入灭菌后的葡萄糖，再将二级培养的种子接种于30000L发酵罐中，严格控制发酵参数直至发酵充分，然后再将发酵液进行灭菌，灭菌后经过陶瓷膜或板框过滤除去菌体，滤液加入壳聚糖进行絮凝除蛋白，加入活性炭脱色后过滤，再经离子交换混床，在料液中加入一定量的酒精低温浓缩结晶，结晶的物料再加浓度在95％以上的酒精进行漂洗，再离心干燥即得高纯度的N-乙酰-D-氨基葡萄糖。

Description

基于微生物发酵的N-乙酰-D-氨基葡萄糖的制备方法
技术领域
本发明涉医药加工工艺技术领域，尤其涉及一种基于微生物发酵的N-乙酰-D-氨基葡萄糖的制备方法。
背景技术
N-乙酰-D-氨基葡萄糖，英文名称N-Acetylglucosamine，分子结构式为：
化学名称：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖。
N-乙酰-D-氨基葡萄糖是一种较高甜度的还原性单糖，在生物体内具有许多重要的生理功能，临床上是治疗风湿性及类风湿性关节炎的药物，亦作为食品抗氧化剂、婴幼儿食品添加剂和糖尿病患者的甜味剂以及用于化妆品，在生命科学、医学和精细化工领域有极其重要的意义。
目前生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖主要有两种工艺，一种工艺是虾蟹壳经酸脱钙，碱脱脂和蛋白质而加工成甲壳素，再由甲壳素经盐酸酸解成D-氨基葡萄糖盐酸盐，然后再由D-氨基葡萄糖盐酸盐加醋酐乙酰化反应而制得，但是工艺中有易制毒化学品醋酐，有毒品扩散的风险，甲壳素的原料是虾蟹壳，其供应易受季节变化而受到影响。另一种工艺是甲壳素通过甲壳素酶的作用制得N-乙酰-D-氨基葡萄糖，但甲壳素酶价格昂贵，使得生产成本太高而难以实现工业化，且现有工艺在纯化过程中浓缩时温度较高，容易使产品部分氧化变性而使产品得率降低和含量下降。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术所存在的缺陷，提供一种基于微生物发酵的N-乙酰-D-氨基葡萄糖的制备方法，利用可再生资源，能实现大规模工业化生产，降低了生产成本，在除蛋白工序中，加入壳聚糖进行絮凝，使得在发酵工艺中难以去除的小分子蛋白质及氨基酸得到了有效的去除，在浓缩时通过加入酒精降低了溶液的沸点，从而最大限度地保护产品不被氧化变性。
为实现上述目的，本发明提供了一种基于微生物发酵的N-乙酰-D-氨基葡萄糖的制备方法，包括：
将保藏工程菌种的甘油管置于常温下融化形成混合液；所述工程菌种为产N-乙酰-D-氨基葡萄糖代谢短杆菌；
用接种环蘸取所述混合液涂布于含有链霉素和安普霉素的平板或斜面，37℃培养18～24小时，完成菌种活化；
挑取活化后得到的工程菌单菌落于装液量10mlLB的三角瓶中，37℃振荡培养8小时，得到一级种子；所述三角瓶为50ml或者100ml，所述三角瓶中还包括链霉素50mg/L和安普霉素50mg/L；
将10ml一级种子接种于装液量1L二级种子培养基的5L摇瓶中，34℃振荡培养16～20小时，OD600＝2～4，并4～5瓶，接入3000L种子罐中，得到二级种子；所述二级种子培养基包括：含量为14g/L的KH2PO4，0.02g/L的CaCl2,21g/L的KH2PO4·3H2O，1g/L的柠檬酸钠·2H2O，7.5g/L的硫酸铵，0.25g/L的MgSO4·7H2O，20g/L的葡萄糖和0.1ml/L的1000倍微量元素母液；所述摇瓶中还包括50mg/L的链霉素和50mg/L的安普霉素；
在种子罐中加入链霉素50mg/L，搅拌；其中，搅拌转速为220rpm,通风比1:0.8；
在30000L发酵罐中将发酵培养基进行灭菌，并加入灭菌后的葡萄糖，截止后体积为21000升，加氨水调pH至6.9，再将所述二级种子接种于所述30000L发酵罐中发酵；
37℃，搅拌速度0～150转/分钟，溶氧保持在20％以上，用氨水控制pH在6.9，通风比1:0.5，罐压：0.05MPa；
当葡萄糖耗完后，以2g/L.h的速度补加葡萄糖，保持比生长速率为0.3～0.6；
检测OD600，当OD600＝10±1，以6.5g/L.h的速度补加650g/L的葡萄糖母液；
当OD600＝25±1时，加入诱导剂开始诱导；所述诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷IPTG，终浓度为0.2mM；
37℃培养，其中，葡萄糖浓度保持在5g/L～10g/L；
监测发酵罐溶氧，待溶氧开始下降后，减慢补加葡萄糖的速度，使葡萄糖浓度至5g/L以下，直至溶氧为0；
待溶氧回升至30％～50％，控制添加葡萄糖速度以使发酵液中葡萄糖浓度保持在3g/L～5g/L；
每隔4小时取样一次，检测N-乙酰-D-氨基葡萄糖的含量，至含量增加量为小于0.5％时，停止发酵，得到所述N-乙酰-D-氨基葡萄糖的发酵液；
将所述发酵液进行经65℃1小时灭菌，经陶瓷膜或板框过滤去除菌体，并水洗滤出的菌体浓缩液，至所述菌体浓缩液中N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量低于2％；
加入1％的305活性炭室温搅拌30～60分钟脱色后过滤；
加入0.3％～2％的无机酸和/或有机酸至滤液中，搅拌均匀；
向搅拌均匀的滤液中加入壳聚糖或壳聚糖的溶液，使加入后料液中的壳聚糖所占比例为0.2％～2％；
再向料液中加入5％～30％无机碱液和/或有机碱，将料液的pH调至7.8～8.2，使壳聚糖完全絮凝析出，静置0.5～2小时；
经抽滤或离心，将滤液抽入贮存罐中；
滤液经离子交换混床后，在滤液中加入5％～30％的无水酒精，搅拌均匀，经50℃～60℃减压浓缩至有晶体析出时，静置12小时；
将析出的结晶物料移入过滤槽进行抽滤或移入离心机进行离心，得白色固体物料；
将白色固体物料移入漂洗槽中，加入浓度在95％以上的酒精进行漂洗，然后再进行离心；
将再次离心后的物料移入真空干燥箱中，60℃～70℃真空干燥，得白色结晶粉末，即为制备得到的N-乙酰-D-氨基葡萄糖。
优选的,在所述将保藏工程菌种的甘油管置于常温下融化形成混合液之前还包括：
挑取抗性平板上生长的工程菌单菌落，加入抗性LB培养基中形成菌液，于37℃培养8～12小时；
向培养好的菌液中加入1/2体积的50％灭菌甘油混匀，分装至无菌的保菌管里，每管1ml，置于-80℃保藏；其中，加入后的甘油终浓度为16.7％。
优选的，在所述将保藏工程菌种的甘油管置于常温下融化形成混合液之前还包括：挑取抗性平板上生长的工程菌单菌落，加入抗性LB培养基中形成菌液，于37℃培养8～12小时；
向培养好的菌液中加入1/2体积的50％灭菌甘油混匀，分装至无菌的保菌管里，每管1ml，置于-20℃保藏，并每半年至少活化一次；其中，加入后的甘油终浓度为16.7％。
优选的，所述工程菌单菌落为产N-乙酰-D-氨基葡萄糖代谢短杆菌；
所述加入抗性LB培养基中形成菌液的培养时间为9～10小时。
优选的，所述滤液经离子交换混床后，在滤液中加入无水酒精，加入的量所占总比例为10％～25％。
优选的，所述34℃振荡培养的时间为16～19小时。
优选的，在所述将发酵培养基移入30000L发酵罐中进行灭菌之前，所述方法还包括：
按照初始体积21000升的量加入含量为6.67g/L的KH2PO4，3.55g/L的一水柠檬酸，0.025g/L的CaCl2·H2O，0.25g/L的消泡剂，2.5g/L的MgSO4·7H2O，5g/L的葡萄糖和1ml/L的1000倍微量元素，配制发酵培养基。
优选的，所述将所述二级种子接种于所述发酵罐中，37℃进行搅拌的搅拌速度具体为10～100转/分钟。
优选的，所述无机酸包括：盐酸、硝酸、磷酸或硫酸中的任意一种或多种的组合；所述有机酸包括：甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、酒石酸或琥珀酸中的任意一种或多种的组合。
优选的，所述无机碱液包括：氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液或氨水中的任意一种或多种的组合；所述有机碱包括：乙醇钠、甲胺、乙胺、乙醇胺、乙二胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、丙胺、异丙胺、三乙醇胺、1,3-丙二胺、1,2-丙二胺或三丙胺中的任意一种或多种的组合。
本发明实施例提供的基于微生物发酵的N-乙酰-D-氨基葡萄糖的制备方法，先将经过特殊保存的工程菌种进行两级培养，然后将发酵培养基移入发酵罐中，同时加入灭菌后的葡萄糖，再将二级培养的种子接种于发酵罐中，严格控制发酵参数直至发酵充分，然后将过滤后的发酵液进行脱色、加壳聚糖絮凝除蛋白、过滤和加酒精浓缩结晶，最后洗涤、烘干得到N-乙酰-D-氨基葡萄糖。生产利用了可再生资源，价格便宜，也不受季节性因素的影响，采用无毒的天然高分子材料壳聚糖作絮凝剂，不仅可有效去除小分子蛋白质和氨基酸，还可以吸附和螯合重金属，有效提高了产品的含量，降低了产品中的杂质。浓缩结晶中加入一定量的酒精，降低了待浓缩液体的沸点，从而降低了结晶时的温度，使N-乙酰-D-氨基葡萄糖与氧气的接触减少，进而最大限度地保护了N-乙酰-D-氨基葡萄糖不被氧化变色，降低了产品产生其他杂质的概率。
附图说明
图1为本发明实施例提供的基于微生物发酵的N-乙酰-D-氨基葡萄糖的制备方法流程图。
具体实施方式
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
图1为本发明实施例提供的基于微生物发酵的N-乙酰-D-氨基葡萄糖的制备方法流程图，下面结合图1，对本发明实施例提供基于微生物发酵的N-乙酰-D-氨基葡萄糖的制备方法进行说明。
本发明实施例提供的制备方法包括如下步骤：
S101,将保藏工程菌种的甘油管置于常温下融化形成混合液；
具体的，所述工程菌种为产N-乙酰-D-氨基葡萄糖代谢短杆菌。
S102，用接种环蘸取所述混合液涂布于含有链霉素和安普霉素的平板或斜面，37℃培养18～24小时。在较优的实施例中，培养时间为19～22小时；
当然，在进行菌种活化之前，还需要对菌种进行保藏，保藏可以在-80℃下，也可以是在-20℃下进行。
保藏方法具体包括：挑取抗性平板上生长的工程菌单菌落，加入抗性LB培养基中形成菌液，于37℃培养8～12小时；培养时间优选为9～10小时；工程菌单菌落为产N-乙酰-D-氨基葡萄糖代谢短杆菌；
向培养好的菌液中加入1/2体积的50％灭菌甘油混匀，分装至无菌的保菌管里，每管1ml，置于-80℃或-20℃保藏；其中，加入后的甘油终浓度为16.7％。
需要注意的是，在-20℃下保藏，每半年至少活化一次。
S103，将菌种活化后的工程菌种进行两级培养得到二级种子；
具体的，挑取活化后得到的工程菌单菌落于装液量10mlLB的三角瓶中，37℃振荡培养8小时，得到一级种子；三角瓶为50ml或者100ml，三角瓶中还包括链霉素50mg/L和安普霉素50mg/L；
将10ml一级种子接种于装液量1L二级种子培养基的5L摇瓶中，34℃振荡培养16～20小时，优选振荡培养时间为16～19小时；OD600＝2～4，并4～5瓶，接入3000L种子罐中；其中二级种子培养基经过121℃灭菌20分钟；二级种子培养基包括：含量为14g/L的KH2PO4，0.02g/L的CaCl2,21g/L的KH2PO4·3H2O，1g/L的柠檬酸钠·2H2O，7.5g/L的硫酸铵，0.25g/L的MgSO4·7H2O，20g/L的葡萄糖和0.1ml/L的1000倍微量元素母液；所述摇瓶中还包括50mg/L的链霉素和50mg/L的安普霉素；
在种子罐中加入链霉素50mg/L，搅拌；其中，搅拌转速为220rpm,通风比1:0.8。
S104,在30000L发酵罐中将发酵培养基进行灭菌，并加入灭菌后的葡萄糖，再将二级种子接种于所述30000L发酵罐中充分发酵，得到N-乙酰-D-氨基葡萄糖的发酵液；
具体的，发酵培养基需要预先配置好，其配置是按照初始体积21000升的量加入含量为6.67g/L的KH2PO4，3.55g/L的一水柠檬酸，0.025g/L的CaCl2·H2O，0.25g/L的消泡剂，2.5g/L的MgSO4·7H2O，5g/L的葡萄糖和1ml/L的1000倍微量元素，配制而成的。
在配置好发酵培养基后，在发酵培养基中加入水并蒸汽灭菌，灭菌后，加入单独配制灭菌的葡萄糖，截止后体积为21000升；加氨水调pH至6.9；
发酵过程可以具体为：
将二级种子接种于发酵罐中，37℃进行搅拌；其中，搅拌速度0～150转/分钟，优选为10～100转/分钟；溶氧保持在20％以上，氨水控制pH＝6.9，通风比为1:0.5，罐压为0.05MPa；
当葡萄糖耗完后，以2g/L.h的速度补加葡萄糖，保持比生长速率为0.3～0.6，优选为0.4～0.5；
检测OD600，当OD600＝10±1，以6.5g/L.h的速度补加650g/L的葡萄糖母液；
当OD600＝25±1时，加入诱导剂开始诱导；其中，诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，终浓度为0.2mM；
37℃培养，培养基中葡萄糖浓度保持在5g/L～10g/L；
监测发酵罐溶氧，待溶氧开始下降后，减慢补加葡萄糖的速度，使培养基中葡萄糖浓度至5g/L以下，直至发酵液中溶氧为0；
待溶氧回升至30％～50％，控制添加葡萄糖速度以使发酵液中葡萄糖浓度保持在3g/L～5g/L；
每隔4小时取样一次，检测N-乙酰-D-氨基葡萄糖的含量，至含量增加量为小于0.5％时，停止发酵。
S105，将发酵液进行灭菌，经陶瓷膜或板框过滤去除菌体，并水洗滤出的菌体浓缩液，至菌体浓缩液中N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量低于2％；
具体的，发酵液的灭菌温度为65℃，时间为1小时。
S106，加入1％的305活性炭室温搅拌30～60分钟脱色后过滤；
在较优的方案中，搅拌脱色时间为45～60分钟。
S107，加入0.3％～2％的无机酸和/或有机酸至滤液中，搅拌均匀；
具体的，无机酸包括盐酸、硝酸、磷酸或硫酸等中的任意一种或多种的组合，加入比例为0.3％～1.0％；
有机酸包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、酒石酸或琥珀酸等中的任意一种或多种的组合，加入比例为1.0％～2.0％。
S108，向搅拌均匀的滤液中加入壳聚糖或壳聚糖的溶液，使加入后料液中的壳聚糖所占比例为0.2％～2％；
优选的，加入壳聚糖或壳聚糖的溶液后，料液中的壳聚糖所占比例为0.3％～1.5％。
S109，再向料液中加入5％～30％无机碱液和/或有机碱，将料液的pH调至7.8～8.2，使壳聚糖完全絮凝析出，静置0.5～2小时；
具体的，无机碱液的浓度优选为10％～25％，包括：氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液或氨水等中的任意一种或多种的组合；
有机碱包括：乙醇钠、甲胺、乙胺、乙醇胺、乙二胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、丙胺、异丙胺、三乙醇胺、1,3-丙二胺、1,2-丙二胺或三丙胺等中的任意一种或多种的组合。
壳聚糖完全絮凝析出后的静置时间优选为0.5～1.5小时。
S110，经抽滤或离心，将滤液抽入贮存罐中；
S111，滤液经离子交换混床后，在滤液中加入5％～30％的无水酒精，搅拌均匀，经50℃～60℃减压浓缩至有晶体析出时，静置12小时；
在优选的实施例中，在滤液中加入无水酒精的比例为10％～25％，减压浓缩的温度为52℃～58℃，真空度应不低于-0.085MPa。
S112，将析出的结晶物料移入过滤槽进行抽滤或移入离心机进行离心，得白色固体物料；
S113，将白色固体物料移入漂洗槽中，加入浓度在95％以上的酒精进行漂洗，然后再进行离心；
S114，将再次离心后的物料移入真空干燥箱中，60℃～70℃真空干燥，得白色结晶粉末，即为制备得到的N-乙酰-D-氨基葡萄糖。
在优选的实施例中，真空干燥的温度为62℃～68℃，真空度应不低于-0.080MPa。
本发明实施例提供的制备方法中，采用微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖，原料是一种可再生资源，价格便宜，也不会受季节性因素的影响。
采用壳聚糖或壳聚糖衍生物作絮凝剂，壳聚糖或壳聚糖衍生物是无毒的天然高分子材料，不仅可有效去除小分子蛋白质和氨基酸，还可以吸附和螯合重金属，有效提高了产品的含量和降低了产品中的杂质。
本发明在浓缩结晶这一道工序中通过加入一定量的酒精，降低了待浓缩液体的沸点，从而降低了结晶时的温度，使N-乙酰-D-氨基葡萄糖与氧气的接触也减少，进而最大限度地保护了N-乙酰-D-氨基葡萄糖不被氧化变色，降低了产品产生其他杂质的概率。
本发明实施例提供的基于微生物发酵的N-乙酰-D-氨基葡萄糖的制备方法，先将经过特殊保存的工程菌种进行两级培养，然后将发酵培养基移入发酵罐中，同时加入灭菌后的葡萄糖，再将二级培养的种子接种于发酵罐中，严格控制发酵参数直至发酵充分，然后将过滤后的发酵液进行脱色、加壳聚糖絮凝除蛋白、过滤和加酒精浓缩结晶，最后洗涤、烘干得到N-乙酰-D-氨基葡萄糖。生产利用了可再生资源，价格便宜，也不受季节性因素的影响，采用无毒的天然高分子材料壳聚糖作絮凝剂，不仅可有效去除小分子蛋白质和氨基酸，还可以吸附和螯合重金属，有效提高了产品的含量，降低了产品中的杂质。浓缩结晶中加入一定量的酒精，降低了待浓缩液体的沸点，从而降低了结晶时的温度，使N-乙酰-D-氨基葡萄糖与氧气的接触减少，进而最大限度地保护了N-乙酰-D-氨基葡萄糖不被氧化变色，降低了产品产生其他杂质的概率。
下面以一些具体的例子说明本实施例提供的制备方法制备N-乙酰-D-氨基葡萄糖的制备过程。
例1：
1)取-20℃保藏有菌种的甘油管，常温融化，然后用接种环蘸取一些涂布于含有链霉素和安普霉素的平板或者斜面，37℃培养20小时；
2)挑取单菌落于装液量10mlLB(包含链霉素50mg/L，安普霉素50mg/L)的100mL三角瓶中，37℃振荡培养8小时；
3)将10ml一级种子接种于装液量1L二级种子培养基(包含链霉素50mg/L，安普霉素50mg/L)的5L摇瓶中，34℃振荡培养18小时，OD600＝3，并5瓶，接入3000L种子罐中，配方见表1。只加链霉素，不加安普霉素。搅拌转速220rpm,通风比1:0.8；
基本盐培养基 含量(g/L) 备注
KH2PO4 14
CaCl2 0.02
KH2PO4.3H2O 21
柠檬酸钠.2H2O 1
硫酸铵 7.5
MgSO4.7H2O 0.25 单独灭菌
葡萄糖 20 单独灭菌
微量元素母液(1000倍) 0.1mL 过滤除菌
灭菌：121℃20min
表1
4)配制发酵培养基，初始体积按21000升的量加各种成分，先加入水并蒸汽灭菌，保证灭完菌后，加入葡萄糖(单独配制灭菌)后截止后体积为21000升；配方见表2。
发酵培养基 含量(g/L) 备注
KH2PO4 6.67
一水柠檬酸 3.55
CaCl2.H2O 0.025
消泡剂 0.25
MgSO4.7H2O 2.5 单独灭菌
葡萄糖 5 单独灭菌
1000倍微量元素 1ml 过滤灭菌
灭菌：121℃20min
表2
5)灭菌后将葡萄糖加入灭过菌的发酵培养基中，加氨水调pH至6.9，然后将二级种子接种于发酵罐中，37℃，搅拌速度10～100转/分钟，溶氧保持在20％以上，用氨水控制pH在6.9，通风比：1:0.5，罐压：0.05MPa；
6)葡萄糖耗完后，开始以2g/L.h的速度补加葡萄糖，保持比生长速率为0.4～0.5；
7)OD600＝10左右，补加650g/L葡萄糖母液的速度为6.5g/L.h；
8)OD600＝25左右时加入诱导剂开始诱导(IPTG终浓度为0.2mM)，37℃培养，培养基中葡萄糖浓度保持在5～10g/L，此时，发酵罐溶氧迅速上升并一直维持，待溶氧开始下降后，减慢补料速度，使培养基中葡萄糖浓度至5g/L以下，直至发酵液中溶氧为0，等溶氧回升至40，加葡萄糖速度以发酵液中葡萄糖浓度保持在3～5g/L；
9)每隔4小时取样一次，检测N-乙酰-D-氨基葡萄糖的含量，至含量增加量小于0.5％，停止发酵；
10)发酵结束，将发酵液经65℃1小时灭菌后，再将发酵液经过陶瓷膜或板框过滤除去菌体，水洗至菌体浓缩液中N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量低于2％；
11)加入1％的305活性炭室温搅拌60分钟脱色后过滤；
12)加入0.6％的盐酸至滤液中，搅拌均匀；
13)向搅拌好的料液中加入0.8％的壳聚糖，开启搅拌使壳聚糖完全溶解；
14)待壳聚糖完全溶解后，再向料液中加入20％碳酸钠溶液，调pH至7.9，使壳聚糖完全絮凝析出，静置1小时；
15)抽滤(或离心)，滤液抽入贮存罐中；
16)滤液经离子交换混床后，在滤液中加入15％的无水酒精，搅拌均匀，再经58℃减压(真空度应不小于-0.085MPa)浓缩至蒸至有晶体析出时，放置过夜，使其结晶充分；
17)将结晶出的物料移入过滤槽(或离心机)，抽滤(或离心)，得白色固体物料；
18)将物料移入漂洗槽中，加入浓度在95％以上的酒精进行漂洗，然后再离心；
19)将离心好的物料移入真空干燥箱中，67℃真空干燥(真空度应不小于-0.080MPa)，得白色结晶粉末，产品纯度达99.5％以上。
经过上述利用微生物发酵及纯化处理生产的高纯度N-乙酰-D-氨基葡萄糖的产品质量数据与甲壳素制得的N-乙酰-D-氨基葡萄糖的产品主要质量数据对比如下表3。
表3
例2：
1)取-20℃保藏有菌种的甘油管，常温融化，然后用接种环蘸取一些涂布于含有链霉素和安普霉素的平板或者斜面，37℃培养21小时；
2)挑取单菌落于装液量10mlLB(含链霉素50mg/L，安普霉素50mg/L)的100mL三角瓶中，37℃振荡培养8小时。
3)将10ml一级种子接种于装液量1L二级种子培养基(含链霉素50mg/L，安普霉素50mg/L)的5L摇瓶中，34℃振荡培养17小时，OD600＝4，并4瓶，接入3000L种子罐中，配方见表4。只加链霉素，不加安普霉素。搅拌转速220rpm,通风比1:0.8。
灭菌：121℃20min
表4
4)配制发酵培养基，初始体积按21000升的量加各种成分，先加入水并蒸汽灭菌，保证灭完菌后，加入葡萄糖(单独配制灭菌)后截止后体积为21000升；配方见表5。
发酵培养基 含量(g/L) 备注
KH2PO4 6.67
一水柠檬酸 3.55
CaCl2.H2O 0.025
消泡剂 0.25
MgSO4.7H2O 2.5 单独灭菌
葡萄糖 5 单独灭菌
1000倍微量元素 1ml 过滤灭菌
灭菌：121℃20min
表5
5)灭菌后将葡萄糖加入灭过菌的发酵培养基中，加氨水调pH至6.9，然后将二级种子接种于发酵罐中，37℃，搅拌速度10～100转/分钟，溶氧保持在20％以上，用氨水控制pH在6.9，通风比：1:0.5，罐压：0.05MPa。
6)葡萄糖耗完后，开始以2g/L.h的速度补加葡萄糖，保持比生长速率为0.4～0.5。
7)OD600＝10左右，补加650g/L葡萄糖母液的速度为6.5g/L.h。
8)OD600＝25左右时加入诱导剂开始诱导(IPTG终浓度为0.2mM)，37℃培养，培养
基中葡萄糖浓度保持在5～10g/L，此时，发酵罐溶氧迅速上升并一直维持，待溶氧开始下降后，减慢补料速度，使培养基中葡萄糖浓度至5g/L以下，直至发酵液中溶氧为0，等溶氧回升至35，加葡萄糖速度以发酵液中葡萄糖浓度保持在3～5g/L。
9)每隔4小时取样一次，检测N-乙酰-D-氨基葡萄糖的含量，至含量增加量小于0.5％，停止发酵。
10)发酵结束，将发酵液经65℃1小时灭菌后，再将发酵液经过陶瓷膜或板框过滤除去菌体，水洗至菌体浓缩液中N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量低于2％；
11)加入1％的305活性炭室温搅拌45分钟脱色后过滤；
12)加入0.5％的盐酸至滤液中，搅拌均匀；
13)向搅拌好的料液中加入0.6％的壳聚糖，开启搅拌使壳聚糖完全溶解；
14)待壳聚糖完全溶解后，再向料液中加入20％碳酸钠溶液，调pH至7.9，使壳聚糖完全絮凝析出，静置45分钟；
15)抽滤(或离心)，滤液抽入贮存罐中；
16)滤液经离子交换混床后，在滤液中加入20％的无水酒精，搅拌均匀，再经56℃减压(真空度应不小于-0.085MPa)浓缩至蒸至有晶体析出时，放置过夜，使其结晶充分；
17)将结晶出的物料移入过滤槽(或离心机)，抽滤(或离心)，得白色固体物料；
18)将物料移入漂洗槽中，加入浓度在95％以上的酒精进行漂洗，然后再离心；
19)将离心好的物料移入真空干燥箱中，67℃真空干燥(真空度应不小于-0.080MPa)，得白色结晶粉末，产品纯度达99.5％以上。
经过上述利用微生物发酵及纯化处理生产的高纯度N-乙酰-D-氨基葡萄糖的产品质量数据与甲壳素制得的N-乙酰-D-氨基葡萄糖的产品主要质量数据对比如下表6。
表6
例3：
1)取-20℃保藏有菌种的甘油管，常温融化，然后用接种环蘸取一些涂布于含有链霉素和安普霉素的平板或者斜面，37℃培养20小时；
2)挑取单菌落于装液量10mlLB(含链霉素50mg/L，安普霉素50mg/L)的100mL三角瓶中，37℃振荡培养8小时。
3)将10ml一级种子接种于装液量1L二级种子培养基(含链霉素50mg/L，安普霉素50mg/L)的5L摇瓶中，34℃振荡培养16小时，OD600＝3，并5瓶，接入3000L种子罐中，配方见表7。只加链霉素，不加安普霉素。搅拌转速220rpm,通风比1:0.8。
灭菌：121℃20min
表7
4)配制发酵培养基，初始体积按21000升的量加各种成分，先加入水并蒸汽灭菌，保证灭完菌后，加入葡萄糖(单独配制灭菌)后截止后体积为21000升；配方见表8。
发酵培养基 含量(g/L) 备注
KH2PO4 6.67
一水柠檬酸 3.55
CaCl2.H2O 0.025
消泡剂 0.25
MgSO4.7H2O 2.5 单独灭菌
葡萄糖 5 单独灭菌
1000倍微量元素 1ml 过滤灭菌
灭菌：121℃20min
表8
5)灭菌后将葡萄糖加入灭过菌的发酵培养基中，加氨水调pH至6.9，然后将二级种子接种于发酵罐中，37℃，搅拌速度10～100转/分钟，溶氧保持在20％以上，用氨水控制pH在6.9，通风比：1:0.5，罐压：0.05MPa。
6)葡萄糖耗完后，开始以2g/L.h的速度补加葡萄糖，保持比生长速率为0.4～0.5。
7)OD600＝10左右，补加650g/L葡萄糖母液的速度为6.5g/L.h。
8)OD600＝25左右时加入诱导剂开始诱导(IPTG终浓度为0.2mM)，37℃培养，培养基中葡萄糖浓度保持在5～10g/L，此时，发酵罐溶氧迅速上升并一直维持，待溶氧开始下降后，减慢补料速度，使培养基中葡萄糖浓度至5g/L以下，直至发酵液中溶氧为0，等溶氧回升至45，加葡萄糖速度以发酵液中葡萄糖浓度保持在3～5g/L；
9)每隔4小时取样一次，检测N-乙酰-D-氨基葡萄糖的含量，至含量增加量小于0.5％，停止发酵。
10)发酵结束，将发酵液经65℃1小时灭菌后，再将发酵液经过陶瓷膜或板框过滤除去菌体，水洗至菌体浓缩液中N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量低于2％；
11)加入1％的305活性炭室温搅拌55分钟脱色后过滤；
12)加入1％的醋酸至滤液中，搅拌均匀，搅拌使其完全溶解；
13)向搅拌好的料液中加入1％的壳聚糖，开启搅拌使壳聚糖完全溶解；
14)待壳聚糖完全溶解后，再向料液中加入20％碳酸氢钾溶液，调pH至8.0，使壳聚糖完全絮凝析出，静置55分钟；
15)抽滤(或离心)，滤液抽入贮存罐中；
16)滤液经离子交换混床后，在滤液中加入18％的无水酒精，搅拌均匀，再经57℃减压(真空度应不小于-0.085MPa)浓缩至有晶体析出时，放置12小时，使其结晶充分；
17)将结晶出的物料移入过滤槽(或离心机)，抽滤(或离心)，得白色固体物料；
18)将物料移入漂洗槽中，加入浓度在95％以上的酒精进行漂洗，然后再离心；
19)将离心好的物料移入真空干燥箱中，67℃真空干燥(真空度应不小于-0.080MPa)，得白色结晶粉末，产品纯度达99.5％以上。
经过上述利用微生物发酵及纯化处理生产的高纯度N-乙酰-D-氨基葡萄糖的产品质量数据与甲壳素制得的N-乙酰-D-氨基葡萄糖的产品主要质量数据对比如下表9。
表9
由以上3个实例的数据可以看出，本发明通过利用微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖，原料易得便宜，不受季节性因素的影响。且采用壳聚糖或壳聚糖衍生物作絮凝剂，有效去除小分子蛋白质和氨基酸，还可以吸附和螯合重金属，有效提高了产品的含量和降低了产品中的杂质。在浓缩结晶这一道工序中通过加入一定量的酒精，降低了待浓缩液体的沸点，从而降低了结晶时的温度，最大限度地保护了N-乙酰-D-氨基葡萄糖不被氧化变色，提高了产品的质量。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于微生物发酵的N-乙酰-D-氨基葡萄糖的制备方法,其特征在于，所述制备方法包括：
将保藏工程菌种的甘油管置于常温下融化形成混合液；所述工程菌种为产N-乙酰-D-氨基葡萄糖代谢短杆菌；
用接种环蘸取所述混合液涂布于含有链霉素和安普霉素的平板或斜面，37℃培养18～24小时，完成菌种活化；
挑取活化后得到的工程菌单菌落于装液量10mlLB的三角瓶中，37℃振荡培养8小时，得到一级种子；所述三角瓶为50ml或者100ml，所述三角瓶中还包括链霉素50mg/L和安普霉素50mg/L；
将10ml一级种子接种于装液量1L二级种子培养基的5L摇瓶中，34℃振荡培养16～20小时，OD600＝2～4，并4～5瓶，接入3000L种子罐中，得到二级种子；所述二级种子培养基包括：含量为14g/L的KH2PO4，0.02g/L的CaCl2,21g/L的KH2PO4·3H2O，1g/L的柠檬酸钠·2H2O，7.5g/L的硫酸铵，0.25g/L的MgSO4·7H2O，20g/L的葡萄糖和0.1ml/L的1000倍微量元素母液；所述摇瓶中还包括50mg/L的链霉素和50mg/L的安普霉素；
在种子罐中加入链霉素50mg/L，搅拌；其中，搅拌转速为220rpm,通风比1:0.8；
在30000L发酵罐中将发酵培养基进行灭菌，并加入灭菌后的葡萄糖，截止后体积为21000升，加氨水调pH至6.9，再将所述二级种子接种于所述30000L发酵罐中发酵；
37℃，搅拌速度0～150转/分钟，溶氧保持在20％以上，用氨水控制pH在6.9，通风比1:0.5，罐压：0.05MPa；
当葡萄糖耗完后，以2g/L.h的速度补加葡萄糖，保持比生长速率为0.3～0.6；
检测OD600，当OD600＝10±1，以6.5g/L.h的速度补加650g/L的葡萄糖母液；
当OD600＝25±1时，加入诱导剂开始诱导；所述诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷IPTG，终浓度为0.2mM；
37℃培养，其中，葡萄糖浓度保持在5g/L～10g/L；
监测发酵罐溶氧，待溶氧开始下降后，减慢补加葡萄糖的速度，使葡萄糖浓度至5g/L以下，直至溶氧为0；
待溶氧回升至30％～50％，控制添加葡萄糖速度以使发酵液中葡萄糖浓度保持在3g/L～5g/L；
每隔4小时取样一次，检测N-乙酰-D-氨基葡萄糖的含量，至含量增加量为小于0.5％时，停止发酵，得到所述N-乙酰-D-氨基葡萄糖的发酵液；
将所述发酵液进行经65℃1小时灭菌，经陶瓷膜或板框过滤去除菌体，并水洗滤出的菌体浓缩液，至所述菌体浓缩液中N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量低于2％；
加入1％的305活性炭室温搅拌30～60分钟脱色后过滤；
加入0.3％～2％的无机酸和/或有机酸至滤液中，搅拌均匀；
向搅拌均匀的滤液中加入壳聚糖或壳聚糖的溶液，使加入后料液中的壳聚糖所占比例为0.2％～2％；
再向料液中加入5％～30％无机碱液和/或有机碱，将料液的pH调至7.8～8.2，使壳聚糖完全絮凝析出，静置0.5～2小时；
经抽滤或离心，将滤液抽入贮存罐中；
滤液经离子交换混床后，在滤液中加入5％～30％的无水酒精，搅拌均匀，经50℃～60℃减压浓缩至有晶体析出时，静置12小时；
将析出的结晶物料移入过滤槽进行抽滤或移入离心机进行离心，得白色固体物料；
将白色固体物料移入漂洗槽中，加入浓度在95％以上的酒精进行漂洗，然后再进行离心；
将再次离心后的物料移入真空干燥箱中，60℃～70℃真空干燥，得白色结晶粉末，即为制备得到的N-乙酰-D-氨基葡萄糖。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述将保藏工程菌种的甘油管置于常温下融化形成混合液之前还包括：
挑取抗性平板上生长的工程菌单菌落，加入抗性LB培养基中形成菌液，于37℃培养8～12小时；
向培养好的菌液中加入1/2体积的50％灭菌甘油混匀，分装至无菌的保菌管里，每管1ml，置于-80℃保藏；其中，加入后的甘油终浓度为16.7％。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述将保藏工程菌种的甘油管置于常温下融化形成混合液之前还包括：挑取抗性平板上生长的工程菌单菌落，加入抗性LB培养基中形成菌液，于37℃培养8～12小时；
向培养好的菌液中加入1/2体积的50％灭菌甘油混匀，分装至无菌的保菌管里，每管1ml，置于-20℃保藏，并每半年至少活化一次；其中，加入后的甘油终浓度为16.7％。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述工程菌单菌落为产N-乙酰-D-氨基葡萄糖代谢短杆菌；
所述加入抗性LB培养基中形成菌液的培养时间为9～10小时。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述滤液经离子交换混床后，在滤液中加入无水酒精，加入的量所占总比例为10％～25％。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述34℃振荡培养的时间为16～19小时。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述将发酵培养基移入30000L发酵罐中进行灭菌之前，所述方法还包括：
按照初始体积21000升的量加入含量为6.67g/L的KH2PO4，3.55g/L的一水柠檬酸，0.025g/L的CaCl2·H2O，0.25g/L的消泡剂，2.5g/L的MgSO4·7H2O，5g/L的葡萄糖和1ml/L的1000倍微量元素，配制发酵培养基。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将所述二级种子接种于所述发酵罐中，37℃进行搅拌的搅拌速度具体为10～100转/分钟。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述无机酸包括：盐酸、硝酸、磷酸或硫酸中的任意一种或多种的组合；所述有机酸包括：甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、酒石酸或琥珀酸中的任意一种或多种的组合。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述无机碱液包括：氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液或氨水中的任意一种或多种的组合；所述有机碱包括：乙醇钠、甲胺、乙胺、乙醇胺、乙二胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、丙胺、异丙胺、三乙醇胺、1,3-丙二胺、1,2-丙二胺或三丙胺中的任意一种或多种的组合。
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