CN104480167A - 一种发酵法制备氨基寡糖素的方法 - Google Patents

Abstract

一种发酵法制备氨基寡糖素的方法，将产壳聚糖酶假单胞菌按0.1～10×10⁶个/mL接种于发酵培养基中，在发酵温度25～30℃的条件下，发酵培养2～4天，分离提纯，既得氨基寡糖素；其中，所述发酵培养基每升组分包括：壳聚糖10～20g、NaCl 0.1～1g、KH₂PO₄ 0.1～1g、微量金属离子化合物0.005～0.05g、表面活性剂0.1～1g，水定容至1L，pH5.5～7.0。本发明在大量实验的基础上，选择合适产壳聚糖酶假单胞菌，优化培养基和发酵条件，能够高产、高效地制备氨基寡糖素，反应条件温和，容易控制，并避免了寡聚体的破坏。

Description

一种发酵法制备氨基寡糖素的方法

技术领域

本发明涉及一种发酵法制备氨基寡糖素的方法。

背景技术

氨基寡糖素(壳寡糖)是指D-氨基葡萄糖以β-1,4糖苷键连接的低聚糖。壳寡糖可改变土壤微生物区系，促进有益微生物的生长而抑制一些植物病原菌；可刺激植物生长，使农作物和水果蔬菜增产丰收；可诱导植物的抗病性，对多种真菌、细菌和病毒产生免疫和杀灭作用，对小麦花叶病、棉花黄萎病、水稻稻瘟病、番茄疫病等病害具有良好的防治作用。同时，壳寡糖对多种植物病原菌具有一定程度的直接抑制作用。壳寡糖在应用上具有微量(PPM级)、高效、低成本、无公害等特点，对我国农业可持续性发展具有重要意义。目前，氨基寡糖素杀菌农药已经在我国进行了大面积的推广应用，对我国农业的可持续性发展具有重要意义。

现常用的氨基寡糖素的制备方法有采用酸降解壳聚糖和甲壳素等或者采用酶降解壳聚糖和甲壳素等。采用酸降解壳聚糖和甲壳素等，由于反应条件难控制，并且提纯困难，成本高。而采用酶降解壳聚糖和甲壳素等，需要先行制备酶，成分高。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高效、高产的制备氨基寡糖素的方法。

本发明是这样实现的：

一种发酵法制备氨基寡糖素的方法，将产壳聚糖酶假单胞菌按0.1～10×10⁶个/mL接种于发酵培养基中，在发酵温度25～30℃的条件下，发酵培养2～4天，分离提纯，既得氨基寡糖素；

其中，所述发酵培养基每升组分包括：壳聚糖10～20g、NaCl 0.1～1g、KH₂PO₄0.1～1g、微量金属离子化合物0.005～0.05g、表面活性剂0.1～1g，水定容至1L，pH5.5～7.0。

优选地，产壳聚糖酶假单胞菌的接种量为1～5×10⁶个/mL。

优选地，发酵温度为27～28℃。

优选地，发酵培养时间为3天。

优选地，所述发酵培养基每升组分中含壳聚糖10-15g。

优选地，所述微量金属离子化合物为能提供Fe²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Al³⁺、Ni2+或Co2+的化合物中的一种或多种。

优选地，所述发酵培养基每升组分中含表面活性剂0.2～0.5g。

其中，所述为表面活性剂用于改变培养基表面张力，可以为改变液体表面张力的常用表面活性剂，例如吐温、脂肪醇聚氧乙烯醚(AE)等。

优选地，所述表面活性剂为吐温20或吐温80。

优选地，所述产壳聚糖酶假单胞菌为假单胞菌H3。

本发明在大量实验的基础上，选择合适产壳聚糖酶假单胞菌，优化培养基和发酵条件，能够高产、高效地制备氨基寡糖素，反应条件温和，容易控制，并避免了寡聚体的破坏。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步地描述，以更好地理解本发明。

实施例1

取假单胞菌H3斜面培养菌，按5×10⁶个/mL接种于发酵培养基中，在发酵温度27℃的条件下，发酵培养3天，离心，取上清液，上清液即为含氨基寡糖素的溶液，进一步分离提纯，既得氨基寡糖素；

其中，所述发酵培养基每升组分包括：壳聚糖10g、NaCl 0.5g、KH₂PO₄0.5g、FeSO₄0.01g、吐温20 0.5g，水定容至1L，pH6.5。

将上清液在沸水浴保持5min，过滤，滤液用铁氰化钾测定还原糖，以还原糖计氨基寡糖素的含量(μmol/mI)，经检测，氨基寡糖素的含量为15.2μmol/mI。

实施例2～4

实施例2～4与实施例1的不同之处，在于假单胞菌H3的接种量不同，分别为0.1×10⁶个/mL、1×10⁶个/mL和10×10⁶个/mL。经检查，发酵培养后的上清液中氨基寡糖素的含量分别为3.8μmol/mI、10.3μmol/mI和8.1μmol/mI。

实施例5～7

实施例5～7与实施例1的不同之处，在于发酵温度不同，分别为25℃、28℃和30℃。经检查，发酵培养后的上清液中氨基寡糖素的含量分别为5.4μmol/mI、12.6μmol/mI和7.9μmol/mI。

实施例8～9

实施例8～9与实施例1的不同之处，在于发酵培养时间不同，分别为2天和4天。经检查，发酵培养后的上清液中氨基寡糖素的含量分别为11.4μmol/mI和13.2μmol/mI。

实施例10～12

实施例10～12与实施例1的不同之处，在于发酵培养基中壳聚糖的含量不同，每升发酵培养基分别含有12g、15g和20g。经检查，发酵培养后的上清液中氨基寡糖素的含量分别为14.8μmol/mI、13.5μmol/mI和10.2μmol/mI。从产率上看，壳聚糖浓度越大越不利于氨基寡糖素的生产，这可能是壳聚糖浓度大，培养液的粘度也大，从而影响了菌种的生长。

实施例13～20

实施例13～20与实施例1的不同之处，实施例1中的FeSO₄分别用能提供Mn²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Al³⁺、Ni²⁺或Co²⁺的化合物替换。经检查，发酵培养后的上清液中氨基寡糖素的含量分别为14.6μmol/mI、14.8μmol/mI、14.2μmol/mI、14.5μmol/mI、13.8μmol/mI、14.6μmol/mI、15.0μmol/mI和13.5μmol/mI。

实施例21～25

实施例21～25与实施例1的不同之处，在于发酵培养基中表面活性剂种类和含量不同，每升发酵培养基分别含有吐温20 0.1g、吐温20 1g、吐温80 0.1g、吐温80 1g和吐温80 0.5g。经检查，发酵培养后的上清液中氨基寡糖素的含量分别为10.5μmol/mI、6.7μmol/mI、9.8μmol/mI、5.9μmol/mI和15.0μmol/mI。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (9)

1.一种发酵法制备氨基寡糖素的方法，其特征在于，将产壳聚糖酶假单胞菌按0.1～10×10⁶个/mL接种于发酵培养基中，在发酵温度25～30℃的条件下，发酵培养2～4天，分离提纯，既得氨基寡糖素；

其中，所述发酵培养基每升组分包括：壳聚糖10～20g、NaCl 0.1～1g、KH₂PO₄0.1～1g、微量金属离子化合物0.005～0.05g、表面活性剂0.1～1g，水定容至1L，pH5.5～7.0。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，产壳聚糖酶假单胞菌的接种量为1～5×10⁶个/mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵温度为27～28℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养时间为3天。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基每升组分中含壳聚糖10-15g。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微量金属离子化合物为能提供Fe²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Al³⁺、Ni²⁺或Co²⁺的化合物中的一种或多种。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基每升组分中含表面活性剂0.1～0.5g。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂为吐温20或吐温80。

9.根据权利要求1～8中任意一项所述的方法，其特征在于，所述产壳聚糖酶假单胞菌为假单胞菌H3。