CN113652367A - 一种火龙果溃疡病杀菌剂及其应用 - Google Patents

一种火龙果溃疡病杀菌剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种火龙果溃疡病杀菌剂及其应用，该杀菌剂包括耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液、甘油和辅料；所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液、甘油和辅料的质量比为1:(0.1～0.5):(10～20)混合而成；耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液是由硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)于30～38℃下发酵培养，且菌液OD600值为2.5以下所得的发酵产物。本发明的火龙果溃疡病杀菌剂，对新暗色柱节孢菌具有明显的拮抗效作用，实现了耐硼赖氨酸芽孢杆菌在防治火龙果溃疡病中的应用，既有效降低火龙果溃疡病的发生和危害，且对生态环境没有影响。

Description

一种火龙果溃疡病杀菌剂及其应用
技术领域
本发明涉及生防菌改造及应用技术领域，特别涉及一种火龙果溃疡病杀菌剂及其应用。
背景技术
火龙果是一种低能量的水果，富含水溶性膳食纤维，具有减肥、降低胆固醇、预防便秘、大肠癌等功效，还有丰富的纤维，能够预防便秘。火龙果中含有一般蔬果中较少有的植物性白蛋白，这种白蛋白会与人体内的重金属离子结合而起到解毒的作用。其富含抗氧化剂维生素C，能美白皮肤防黑斑。除此之外，火龙果中铁的含量也非常丰富。火龙果果实中的花青素含量较高，尤其是红肉的品种。花青素是一种效用明显的抗氧化剂，对抗自由基，抗衰老，并能有效防止血管硬化，阻止心脏病发作和血凝块形成引起的脑中风，提高对脑细胞变性的预防，抑制痴呆症的发生等作用。
火龙果溃疡病是火龙果生长的重要病害，是由新暗色柱节孢菌引起的一种真菌性病害，该病主要危害到火龙果茎杆和果实，幼茎容易沾染，早期构成圆形白斑，渐渐转酿成褐斑或黑色的溃疡斑。火龙果溃疡病在高温高湿条件下容易产生，特别台风过后更容易大面积爆发，给农业生产造成了严重的经济损失。
现有常见的火龙果溃疡病菌防治措施包括：
(1)化学防治，主要以吡唑醚菌酯、腐霉利、咪鲜胺、春雷霉素或中生菌素等作为主要防治药物进行防治，但往往容易导致化学残留，给环境和食品带来了巨大的威胁，而且生产成本高，病原菌抗药性的产生等问题。
(2)定期对果园土壤进行检疫杀菌消毒，
通过定期使用保护性的杀菌剂对果园土壤杀菌消毒，以保护未被病菌感染的火龙果免受病菌侵染。但往往要在作物没有接触到病源或病害发生之前喷药才能见到效果。而且随着天气气候的影响，雨后容易滋生病害。因此，对于火龙果溃疡病害的防治局限性大，日常管理繁杂，极大增加了劳动成本，且防治效果不足。
因此，寻找一种环境友好型的生物防治方法，通过利用以微生物及其代谢产物组成的生物杀菌剂，即可实现火龙果溃疡菌病的高效快捷安全的防治效果，为重要农作物病原菌的防治带来新的方向。
发明内容
鉴于此，本发明提出一种火龙果溃疡病杀菌剂及其应用。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种火龙果溃疡病杀菌剂，包括耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液、甘油和辅料；所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液、甘油和辅料的质量比为 1:(0.1～0.5):(10～20)混合而成；所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液是由硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusboronitolerans)于30～38℃下发酵培养，且菌液OD600值为 2.5以下所得的发酵产物。
进一步说明，所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：取耐硼赖氨酸芽孢杆菌单菌落，按接菌量为3～5％接种于LB液体培养基中，于35～37℃，以100～120r/min转速恒温摇床过夜培养；
步骤2：将步骤1的菌液，按体积比1:10接种至液体发酵培养基中，于 30～34℃，以100～120r/min转速恒温摇床培养10～12h后，升温至36～38℃诱导培养，同时，每2～3小时补加葡萄糖至发酵培养基中的葡萄糖浓度为10～15g/L，并调节pH为6.8～7.2，待OD600值达到4.0以下；
步骤3：再将步骤2的菌液，按体积比2:5接种至LB液体培养基中，于 36～38℃，以140～150r/min转速恒温摇床培养，待OD600值达到2.5以下；
步骤4：收集发酵产物，以7500～8500r/min离心去除沉淀，获得发酵上清液，经0.20～0.24μm的滤膜过滤发酵上清液，即，分别得到耐硼赖氨酸芽孢杆菌的发酵滤液。
进一步说明，所述发酵培养基由每1000ml水中添加胰蛋白胨15g，酵母粉 3g，NaCl1g，葡萄糖6g，NH4Cl 0.5g，MgSO4 0.05g，CaCl2 0.01g和NaH2PO4·2H2O 1g混合而成，溶解后高压灭菌。
进一步说明，所述杀菌剂还包括巨大芽孢杆菌发酵液，所述巨大芽孢杆菌发酵液与耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液的质量比为(0.5～1):1。
进一步说明，所述巨大芽孢杆菌发酵液是由巨大芽孢杆菌发酵液(Bacillusmegatherium)按接菌量3～5％接种于LB液体培养基中，于37℃下，以120r/min 转速恒温摇床发酵培养，至菌液OD600值为2.0～2.5所得的发酵产物。
进一步说明，所述辅料为水、液体培养基或固体培养基。
一种火龙果溃疡病杀菌剂用于火龙果溃疡病菌的防治中。
一种火龙果溃疡病杀菌剂在抑制新暗色柱节孢菌中的应用。
该火龙果溃疡病杀菌剂对火龙果溃疡病的防治方法，将火龙果溃疡病杀菌剂与携带有火龙果溃疡病菌的介质载体混合；载体为种子、植物、植物生长的土壤、培养植物的培养基中任意一种或多种。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明提出的含有耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液的火龙果溃疡病杀菌剂，其不仅可以有效降低火龙果溃疡病的发生和危害，而且对生态环境没有影响，经实验结果表明，含有菌液OD600值为2.5以下的耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液，对新暗色柱节孢菌的拮抗效率达43％以上，从而有效实现了耐硼赖氨酸芽孢杆菌在防治火龙果溃疡病中的应用，提高火龙果溃疡病的防治效率。
(2)本发明通过利用分段恒温发酵工艺制备耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液，控制高浓度葡萄糖的发酵培养基质条件，不仅提高了耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液的制备效率，其OD600值达到2.5时的发酵总时长小于80h，而且有利用促进耐硼赖氨酸芽孢杆菌活性及其代谢产物的增加，进一步提高对火龙果溃疡病的防治效果。
(3)本发明还通过进一步采用巨大芽孢杆菌发酵液与耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液的组合，对新暗色柱节孢菌可形成更加显著的抑制作用，其抑制效率可达50％以上，实现火龙果溃疡菌病的高效快捷安全的防治效果。
附图说明
图1是本申请实施例的耐硼赖氨酸芽孢杆菌的发酵液对火龙果溃疡病菌的生长影响实验图；
其中，图1中，A为含火龙果溃疡病杀菌剂的培养基；B为未加入火龙果溃疡病杀菌剂的培养基：
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
火龙果溃疡病杀菌剂，由耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液、甘油和水按照质量比为1:0.1:20混合而成。
耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液的制备方法：
(1)取耐硼赖氨酸芽孢杆菌单菌落，按接菌量为3％接种于LB液体培养基中，于35℃，以100r/min转速恒温摇床过夜培养；
(2)制备发酵培养基：取1000ml水中添加胰蛋白胨15g，酵母粉3g，NaCl 1g，葡萄糖6g，NH4Cl 0.5g，MgSO4 0.05g，CaCl2 0.01g和NaH2PO4·2H2O 1g 混合而成，溶解后高压灭菌，备用。
将过夜培养的菌液按体积比1:10接种至液体发酵培养基中，于30℃，以 100r/min转速恒温摇床培养10h后，升温至36℃诱导培养，同时，每2小时补加葡萄糖至发酵培养基中的葡萄糖浓度为10g/L，并调节pH为7.0，待OD600 值达到4.0以下；
(3)再将步骤2的菌液，按体积比2:5接种至LB液体培养基中，于36℃，以140r/min转速恒温摇床培养，待OD600值达到2.4～2.5；
(4)收集发酵产物，以8000r/min离心去除沉淀，获得发酵上清液，经0.22μm 的滤膜过滤发酵上清液，即，得到耐硼赖氨酸芽孢杆菌的发酵滤液。
实施例2
火龙果溃疡病杀菌剂的生防特性鉴定。
本发明采用生长速率法(含毒介质法)对上述实施例1制得的火龙果溃疡病杀菌剂的抑菌活性进行鉴定。具体操作如下：
1、按照常规方法配置PDA固体培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂 15g，蒸馏水1000ml)，并将其冷却至55℃；
2、取上述实施例1制得的火龙果溃疡病杀菌剂，与PDA培养基以1：9的体积比混合，即杀菌剂占10％，制成含杀菌剂的含药平板；
3、待混有杀菌液的培养基冷却后，在平板中央接种1个供试病原菌菌饼(直径为8mm)，得到含杀菌液的PDA培养基平板，作为处理组。
4、以不含杀菌液的PDA培养基平板作为对照组，同样接种1个供试病原菌菌饼(直径为8mm)。
5、上述培养基置于28℃恒温培养箱进行培养，待对照组菌落长至培养基平板直径时，采用十字交叉法量取菌落直径，根据以下公式评价生防菌的抑菌特性：
菌丝生长抑制率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-接种菌饼直径)×100％，其结果如下：
表1火龙果溃疡病杀菌剂对新暗色柱节孢菌菌丝生长的抑制效果
Figure RE-GDA0003308527820000051
由上表1结合图1可以明显看出，新暗色柱节孢菌的生长明显被火龙果溃疡病杀菌剂抑制，本发明制得的火龙果溃疡病杀菌剂对新暗色柱节孢菌菌丝生长的拮抗效率达43.04％。
实施例3
火龙果溃疡病杀菌剂，由耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液、甘油和水按照质量比为1:0.5:20混合而成。
耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液的制备方法：
(1)取耐硼赖氨酸芽孢杆菌单菌落，按接菌量为5％接种于LB液体培养基中，于37℃，以120r/min转速恒温摇床过夜培养；
(2)制备发酵培养基：取1000ml水中添加胰蛋白胨15g，酵母粉3g，NaCl 1g，葡萄糖6g，NH4Cl 0.5g，MgSO4 0.05g，CaCl2 0.01g和NaH2PO4·2H2O 1g 混合而成，溶解后高压灭菌，备用。
将过夜培养的菌液按体积比1:10接种至液体发酵培养基中，于34℃，以 120r/min转速恒温摇床培养12h后，升温至38℃诱导培养，同时，每3小时补加葡萄糖至发酵培养基中的葡萄糖浓度为15g/L，并调节pH为7.0，待OD600 值达到4.0以下；
(3)再将步骤2的菌液，按体积比2:5接种至LB液体培养基中，于38℃，以150r/min转速恒温摇床培养，待OD600值达到2.4～2.5；
(4)收集发酵产物，以8000r/min离心去除沉淀，获得发酵上清液，经0.22μm 的滤膜过滤发酵上清液，即，得到耐硼赖氨酸芽孢杆菌的发酵滤液。
实施例4
如实施例3的火龙果溃疡病杀菌剂，区别在于，耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液的制备方法不同。耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液是按接菌量5％接种于LB液体培养基中，于37℃下，以150r/min转速恒温摇床发酵培养，至菌液OD600值为 2.4～2.5所得的发酵产物。
实施例5
如实施例3的火龙果溃疡病杀菌剂，区别在于，还加入巨大芽孢杆菌发酵液。
耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆菌发酵液、甘油和水按照质量比为1:1:0.5:20混合。
其中，巨大芽孢杆菌发酵液是由巨大芽孢杆菌发酵液(Bacillus megatherium)按接菌量5％接种于LB液体培养基中，于37℃下，以120r/min转速恒温摇床发酵培养，至菌液OD600值为2.0～2.5所得的发酵产物。
实施例6
如实施例3的火龙果溃疡病杀菌剂，区别在于，未添加耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液。巨大芽孢杆菌发酵液、甘油和水按照质量比为1:0.5:20混合而成。
实施例7
如实施例3的火龙果溃疡病杀菌剂，区别在于，耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆菌发酵液、甘油和水按照质量比为1:0.5:0.5:20。
实施例8
不同火龙果溃疡病杀菌剂的生防特性的鉴定。
根据实施例2中的生长速率法，对由实施例3～7中制得的不同火龙果溃疡病杀菌剂的抑菌活性进行鉴定。
分别取上述实施例3～7中制得的火龙果溃疡病杀菌剂，分别与PDA培养基以1：9的体积比混合，并向含杀菌剂的含药平板中央接种1个供试病原菌菌饼(直径为8mm)，得到含杀菌液的PDA培养基平板，作为处理组1～5；以不含杀菌液的PDA培养基平板作为对照组，接种1个供试病原菌菌饼(直径为8mm)；于28℃恒温培养箱中培养，待对照组菌落长至培养基平板直径时，采用十字交叉法量取菌落直径，其抑菌结果如下表2：
表2生物菌剂对番茄根腐病菌菌丝生长的抑制效果
Figure RE-GDA0003308527820000071
Figure RE-GDA0003308527820000081
由上表可知，处理组1～5相比，处理组2中以单一连续发酵培养方法制备耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液，其制得的火龙果溃疡病杀菌剂对新暗色柱节孢菌生长的抑制率明显降低，表明本发明通过利用分段恒温发酵工艺制备耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液，有利于提高对火龙果溃疡病菌的拮抗作用，而且其发酵 OD600值达到2.5的时间缩短。处理组4中，单一采用巨大芽孢杆菌发酵液作为有效成分制成的火龙果溃疡病杀菌剂，对新暗色柱节孢菌抑制率极低，而处理组3和5中由耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液与巨大芽孢杆菌发酵液共同组合，其对火龙果溃疡病菌的拮抗作用增加，协同增效抑制新暗色柱节孢菌的生长，其抑制效率可达50％以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种火龙果溃疡病杀菌剂，其特征在于：包括耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液、甘油和辅料；所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液、甘油和辅料的质量比为1:(0.1～0.5):(10～20)混合而成；
所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液是由硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusboronitolerans)于30～38℃下发酵培养，且菌液OD600值为2.5以下所得的发酵产物。
2.如权利要求1所述的一种火龙果溃疡病杀菌剂，其特征在于：所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：取耐硼赖氨酸芽孢杆菌单菌落，按接菌量为3～5％接种于LB液体培养基中，于35～37℃，以100～120r/min转速恒温摇床过夜培养；
步骤2：将步骤1的菌液，按体积比1:10接种至液体发酵培养基中，于30～34℃，以100～120r/min转速恒温摇床培养10～12h后，升温至36～38℃诱导培养，同时，每2～3小时补加葡萄糖至发酵培养基中的葡萄糖浓度为10～15g/L，并调节pH为6.8～7.2，待OD600值达到4.0以下；
步骤3：再将步骤2的菌液，按体积比2:5接种至LB液体培养基中，于36～38℃，以140～150r/min转速恒温摇床培养，待OD600值达到2.5以下；
步骤4：收集发酵产物，以7500～8500r/min离心去除沉淀，获得发酵上清液，经0.20～0.24μm的滤膜过滤发酵上清液，即，分别得到耐硼赖氨酸芽孢杆菌的发酵滤液。
3.如权利要求1所述的一种火龙果溃疡病杀菌剂，其特征在于：所述发酵培养基由每1000ml水中添加胰蛋白胨15g，酵母粉3g，NaCl 1g，葡萄糖6g，NH 4Cl 0.5g，MgSO4 0.05g，CaCl2 0.01g和NaH2PO4·2H2O 1g混合而成，溶解后高压灭菌。
4.如权利要求1所述的一种火龙果溃疡病杀菌剂，其特征在于：所述杀菌剂还包括巨大芽孢杆菌发酵液，所述巨大芽孢杆菌发酵液与耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液的质量比为(0.5～1):1。
5.如权利要求1所述的一种火龙果溃疡病杀菌剂，其特征在于：所述巨大芽孢杆菌发酵液是由巨大芽孢杆菌发酵液(Bacillus megatherium)按接菌量3～5％接种于LB液体培养基中，于37℃下，以120r/min转速恒温摇床发酵培养，至菌液OD600值为2.0～2.5所得的发酵产物。
6.如权利要求1所述的一种火龙果溃疡病杀菌剂，其特征在于：所述辅料为水、液体培养基或固体培养基。
7.一种如权利要求1～6中任意一项所述的火龙果溃疡病杀菌剂的应用，其特征在于，所述杀菌剂用于火龙果溃疡病菌的防治中。
8.一种如权利要求7所述的火龙果溃疡病杀菌剂的应用，其特征在于，所述杀菌剂在抑制新暗色柱节孢菌中的应用。
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