CN100364412C - 一种微生物抗百合灰霉病剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微生物抗百合灰霉病剂及其制备方法和应用，属微生物农药技术领域。该制剂的制备工序包括微生物菌株试管种培养、菌株液体种子培养、菌株液体发酵培养。本发明的生产菌株为藤黄灰链霉菌(Streptomyces luteogriseus)ECO 00001，该菌株已于2006年4月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.1679。利用本发明生产的制剂对百合灰霉病具有较好的离体及活体防效，可用于百合花卉灰霉病的防治。本发明具有原料成本低，生产工艺简单，防治效果好的优点，具有较好的应用前景。
Description
技术领域 本发明涉及一种微生物抗百合灰霉病剂及其制备方法和应用，属微生物农药技术领域。
背景技术 百合灰霉病又称百合叶枯病，是百合的一种重要病害，病原菌为椭圆葡萄孢[Botrytis elliptica(Berk.)Cooke]，属半知菌亚门，葡萄孢属真菌。该病原菌主要为害叶片，也可侵染茎、花、芽及鳞茎，发病严重时造成茎叶枯死，花蕾腐烂，影响鳞茎产量。由于灰霉病的蔓延危害，田间百合叶片枯死，花器褐腐，茎杆发黑，病株地下鳞茎提早停止生长，导致产量下降，品质变劣，严重制约了百合生产的发展。对百合灰霉病的防治，目前在很大程度上主要依赖于化学农药(如速克灵、扑海因等)的使用，由于灰霉病病原菌有异常的遗传变异潜能而易发生抗药性突变，长期大量地使用化学农药可使田间病原菌对化学药剂产生抗药性。同时，大量施用化学药剂，使花卉中农药残留量增加，天敌被大量杀伤，农田生态平衡被破坏和环境被污染，随着我国加入WTO和人们对环境生态保护的日趋重视，我国农药业正面临着严峻的形势。
生物防治以其无污染，无残留，无生态毒性和安全性好等优点在植物病虫害的防治中起着主导作用。大力发展生物农药对我国具有非常重要的现实意义。微生物源农药是新农药创制的重要源头，具有研究周期短、投入低、易于工业化和商品化开发的优势，且对人畜安全，易于分解，与环境相容，自上个世纪90年代以来，微生物农药每年以20％的速度递增，已成为农业生物技术产业中的研究开发热点之一。我国微生物资源丰富，发展微生物农药具有充分的优势。近年来人们通过大量筛选和利用抗灰霉病病原菌的有益微生物及其代谢产物，使微生物防治正日益成为灰霉病控制中的一条重要而有效的途径。
发明内容 本发明的目的是通过对筛选到的一株具有防治百合灰霉病的链霉菌进行研究，开发微生物抗百合灰霉病剂。
本发明筛选到一株对百合灰霉病具有很好防治作用的藤黄灰链霉菌(Streptomycesluteogriseus) ECO 00001，ECO 00001菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国.北京；保藏日期：2006年4月17日；保藏登记入册编号为CGMCC No.1679。
本发明Streptomyces luteogriseus ECO 00001菌株形态特征为：菌落白色，圆形，表面毛绒状，边缘有稀疏菌丝生长；基内菌丝和气生菌丝为丝状，不规则分支，一般不断裂；气生菌丝上形成长孢链，直形或波形或螺旋，孢子圆形、椭圆形至杆状。
本发明是这样实现的：
制备微生物抗百合灰霉病剂：
1、试管种培养
将菌株ECO 00001接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为：酵母膏4g；葡萄糖4g；麦芽膏5g；复合维生素1ml；琼脂20g；水1000ml；pH 7.2，于28℃下培养6天，获得试管种。(复合维生素组成为：维生素B1 1.0mg/L，维生素B6 1.0mg/L，核黄素1.0mg/L，烟酸1.0mg/L，苯丙氨酸1.0mg/L，生物素1.0mg/L，丙氨酸0.3mg/L，下同)
2、液体种子培养
采用500ml三角瓶摇瓶培养，方法是先配制液体种子培养基，液体种子培养基配方为：酵母膏4g；葡萄糖4g；麦芽膏5g；复合维生素1ml；水1000ml；pH 7.2，在每个三角瓶中装入100ml液体培养基，120℃灭菌30分钟，冷却后接入1cm2大的试管种，28℃下于转速为220rpm的摇床上培养2天。
3、制备微生物抗百合灰霉病剂
采用500ml三角瓶摇瓶培养，方法是先配制液体发酵培养基，液体发酵培养基配方为：大豆粉20g；甘露醇20g；水1000ml；pH 7.8，在每个三角瓶中装入100ml液体发酵培养基，120℃灭菌30分钟，冷却后接入10ml上述方法2中得到的种子液，28℃下于转速为220rpm的摇床上培养6天得发酵液。在发酵液中加入等体积乙醇，经摇床振荡8小时后，用转速为3000rpm的离心机离心10分钟，取上清液并在旋转蒸发仪上50℃蒸去乙醇，用水稀释到原发酵液体积，即成为可供使用的微生物抗百合灰霉病剂。
将上述方法制备得到的微生物抗百合灰霉病剂，采用室内毒力测定(抑制孢子萌发法、平板抑菌试验法)及活体药效试验(温室盆栽活体试验)相结合的方法，试验该制剂对百合灰霉病的防治作用。
室内毒力测定结果表明：用上述方法制备得到的菌株ECO 00001抗百合灰霉病剂在抑制孢子萌发法试验中，对百合灰霉病病原菌孢子萌发的抑制率为100％；在平板抑菌试验法中，对百合灰霉病病原菌的抑菌圈直径平均为18.1mm(3次重复)，两项试验表明该制剂对百合灰霉病病原菌具有较强的抑制活性。
温室盆栽活体试验结果表明：菌株ECO 00001抗百合灰霉病剂在盆栽百合苗上表现出了较好的防治效果，其对百合灰霉病的防治效果经计算为91.92％。
利用本发明生产的制剂对百合灰霉病具有较好的离体及活体防治效果，可用于百合灰霉病的防治。本发明具有原料成本低，生产工艺简单，防治效果好的优点，具有较好的应用前景。
具体实施方式：
实施例一：抑制孢子萌发法试验
1、制备试验用抗百合灰霉病剂
本发明的微生物抗百合灰霉病剂，由生产菌株(Streptomyces luteogriseus)ECO 00001菌株，按液体发酵生产方法制备。具体制备过程及条件与发明内容描述部分相同。
2、制备灰霉病病原菌
将公知的百合灰霉病病原菌[Botrytis elliptica(Berk.)Cooke]接种到试管固体培养基斜面上25℃下培养6-8天，培养基配方为常用的PDA培养基，方法是取马铃薯200g去皮后切成小块，加水1000ml煮沸20分钟，过滤后得到1000ml滤液，然后加入葡萄糖20g，琼脂20g，pH自然，待菌丝长满培养基后用自来水洗去气生菌丝，在400nm日光灯照射下培养产孢，2-3天后用蒸馏水洗下孢子，并加入1％磷酸二氢钾和葡萄糖混合溶液配制成浓度为在10×10低倍显微镜下，每个视野30-40个孢子的灰霉病病原菌孢子悬浮液备用。
3、抑制孢子萌发试验方法：
将抗百合灰霉病剂供试样品与配制好的百合灰霉病病原菌孢子悬浮液等体积混合，取一滴滴加在凹玻片上，每处理3个重复，同时设清水为空白对照。在25℃下保湿培养24小时后察看空白对照孢子的萌发情况，以芽管长度超过分生孢子小端直径一半时为萌发。当空白对照孢子的萌发率达到95％后，察看抗百合灰霉病剂供试样品对百合灰霉病病原菌孢子萌发的抑制情况。
按以下公式计算孢子萌发抑制率：
孢子萌发抑制率(％)＝(对照孢子萌发率-处理孢子萌发率)/(对照孢子萌发率)×100
实验结果表明，菌株ECO 00001抗百合灰霉病剂供试样品对百合灰霉病病原菌孢子的萌发抑制率为100％。
实施例二：平板抑菌试验
本发明的微生物抗百合灰霉病剂，由生产菌株(Streptomyces luteogriseus)ECO 00001菌株，按液体发酵生产方法制备。具体制备过程及条件与发明内容描述部分相同，百合灰霉病病原菌的制备同抑制孢子萌发法中的方法。
平板抑菌试验：将培养好的百合灰霉病病原菌取0.5cm2大的试管种斜面与10ml PDA培养基(制法同抑制孢子萌发法中的方法)混合均匀，倒入内径为9cm的已灭菌培养皿中制成带菌平板，平板抑菌实验采用常规的杯碟法，即在每个带菌平板上放置牛津杯，在牛津杯内加入制备好的抗百合灰霉病剂0.2ml，以无菌清水为空白对照，每处理3个重复，置25℃恒温箱中培养48小时后，用十字交叉法测量抑菌圈直径。
表1.微生物抗百合灰霉病剂对百合灰霉病病原菌的抑菌结果
| 病原菌 | 抗灰霉病剂供试样品抑菌圈直径(mm) | 清水对照抑菌圈直径(mm) |
| 灰霉病原菌1 | 18.2 | 0 |
| 灰霉病原菌2 | 17.9 | 0 |
| 灰霉病原菌3 | 18.3 | 0 |
| 平均 | 18.1 | 0 |
实验结果表明：菌株ECO 00001抗百合灰霉病剂供试样品对百合灰霉病病原菌的抑菌圈直径平均为18.1mm。
实施例三：温室盆栽活体试验
本发明的微生物抗百合灰霉病剂，由生产菌株(Streptomyces luteogriseus)ECO 00001菌株，按液体发酵生产方法制备。具体制备过程及条件与发明内容描述部分相同，百合灰霉病病原菌的制备同抑制孢子萌发法中的方法。具体试验步骤为：
将菌株ECO 00001抗百合灰霉病剂供试样品喷施在盆栽百合嫩叶上。并设清水为空白对照。待3-4小时叶片上的药剂干后，将叶片取下，用经水充分润湿的棉花包于叶柄上。将培养了7天左右的百合灰霉病指示菌，用打孔器打成直径为5mm的菌饼，菌面向下，于叶片正面近叶尖及近叶柄处各放置1块，每处理设3个重复，每重复3片叶，在20℃的光照培养箱中保湿培养72小时(12小时光照，12小时黑暗，光照与黑暗交替进行)后，观察发病情况，待空白对照叶片充分发病时，采用十字测量法测量每个病斑直径，以病斑大小作为病害分级标准。病斑分级标准：0级：无病斑；1级：病斑直径0.1-5mm；3级：病斑直径5.1-7.0mm；5级：病斑直径7.1-9.0mm；7级：病斑直径9.1-11.0mm；9级：病斑直径11.1mm以上。
抗百合灰霉病防效的计算采用下列两公式：
病情指数＝[〔∑(各级病叶数×相对级数值)〕/(调查总叶数×最高级值)]×100
防治效果(％)＝[(空白对照施药后病情指数-药剂处理施药后病情指数)/空白对照施药后病情指数]×100％
实验结果表明：菌株ECO 00001抗百合灰霉病剂在盆栽百合苗上表现出了较好的防治效果，其对百合灰霉病的防效经计算为91.92％。
Claims (3)
1.一种微生物抗百合灰霉病剂，其特征在于该制剂的生产菌株为藤黄灰链霉菌(Streptomyces luteogriseus)ECO 00001，ECO 00001菌株已于2006年4月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1679。
2.权利要求1所述微生物抗百合灰霉病剂的制备方法，其特征在于：
(1)试管种培养为：将菌株ECO 00001接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为：酵母膏4g；葡萄糖4g；麦芽膏5g；复合维生素1ml；琼脂20g；水1000ml；pH7.2，于28℃下培养6天，获得试管种；
(2)液体种子培养为采用500ml三角瓶摇瓶培养，方法是先配制液体种子培养基，液体种子培养基配方为：酵母膏4g；葡萄糖4g；麦芽膏5g；复合维生素1ml；水1000ml；pH7.2，在每个三角瓶中装入100ml液体培养基，120℃灭菌30分钟，冷却后接入1cm2大的试管种，28℃下于转速为220rpm的摇床上培养2天；
(3)制备微生物抗百合灰霉病剂采用500ml三角瓶摇瓶培养，方法是先配制液体发酵培养基，液体发酵培养基配方为：大豆粉20g；甘露醇20g；水1000ml；pH7.8，在每个三角瓶中装入100ml液体发酵培养基，120℃灭菌30分钟，冷却后接入10ml上述方法(2)中得到的种子液，28℃下于转速为220rpm的摇床上培养6天得发酵液，在发酵液中加入等体积乙醇，经摇床振荡8小时后，用转速为3000rpm的离心机离心10分钟，取上清液并在旋转蒸发仪上50℃蒸去乙醇，用水稀释到原发酵液体积，即成为可供使用的微生物抗百合灰霉病剂。
3.权利要求1所述的微生物抗百合灰霉病剂应用于防治百合花卉灰霉病的用途。
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| 新型抗生素AGPM产生菌藤黄灰链霉菌的诱变育种. 张建勇等.微生物学通报，第30卷第2期. 2003 * |
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