CN108660088A - 棉花内生细菌yupp-10及其在棉花黄萎病防治中的应用 - Google Patents

棉花内生细菌yupp-10及其在棉花黄萎病防治中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物病理学领域，具体地涉及棉花内生细菌YUPP‑10及其在棉花黄萎病防治中的应用。该花内生细菌YUPP‑10的菌种保藏号为CCTCC No：M 2017141。实验结果表明该菌对黄萎病病原菌的生长有抑制作用，其玉米蛭石培养物对黄萎病有较高的防治效果，适合作为黄萎病防治的生物资源。本发明为丰富生物防治农业病害方面提供了新的资源，对无污染的绿色农业体系具有实际的应用指导。

Description

棉花内生细菌YUPP-10及其在棉花黄萎病防治中的应用
技术领域
本发明涉及植物病理学领域，具体地涉及棉花内生细菌YUPP-10及其在棉花黄萎病防治中的应用。
背景技术
黄萎病(Verticillium wilt)作为一种维管束真菌病害，是造成棉花减产的主要病害。然而，由于病原菌自身传播特点和致病机理复杂，目前，仍有较大的治理难度。
大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)所引起的棉花黄萎病是世界性防治难题。棉花黄萎病的发生与棉花连作导致的根区土壤微生物区系异常和病原菌数量增加有关。抗病育种因缺乏天然抗黄萎病种源，且转抗性基因品种易退化，因此缺少具有突破性的高抗品种。利用化学农药具有抑制有益微生物生长、导致药效下降、成本高、危害环境等缺点。
随着人们对绿色农业、有机农业的发展需求，生物防治成为病虫害防治的新措施，同样成为棉花黄萎病防治的新方向。目前，生物防治在预防棉花黄萎病的研究上已经取得了一定成果，但实际使用中遇到很多困难，例如，如何持久抗病性；生防菌剂如何正常定殖并发挥抗病效果；如何顺利将生防菌剂施到靶标位点。
发明内容
本发明为了丰富拮抗菌生物资源，促进现有植物病害防控技术的改善，从生物防治的绿色防控技术角度分离鉴定了花内生细菌YUPP-10，该菌是从健康棉花茎秆中定向分离的一株能够水解β-1,4糖苷键的菌株，对棉花黄萎病病原菌细胞壁具有水解作用，鉴定并验证了其对棉花黄萎病的防治作用，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC No：M 2017141，对棉花黄萎病病原菌有抑制作用，对棉花黄萎病具有防治效果，在盆栽试验中实现了对黄萎病的抑制作用，其用于防治棉花黄萎病的潜力巨大。
该菌形态学特征为：革兰氏阳性菌，菌体细胞杆状，末端方，在LB培养基上呈灰白色，不透明，表面较粗糙，似融蜡状，边缘呈锯齿状，微有光泽。但传统的形态学鉴定稳定性较差，会有一定的局限性，分子生物学成为新分类鉴定的重要途径，利用传统的形态学结合分子生物学的手段，对YUPP-10进行鉴定，确定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。
内生菌具有寄主选择性，因此，应优先选择能够定殖于目标植物的内生菌作为防治材料。YUPP-10为棉花内生细菌，能成功定殖于棉花组织内部，而且未造成寄主植物病变。在研究生防菌的同时评估新物种对原有微环境的危害十分重要，而植物内生细菌对植物本身而言并非新“物种”。此外，内生细菌在植物中的定殖类似于病原菌的生态位，适合作为生物防治资源。
本发明提供的蜡状芽孢杆菌，其于2017年3月24日保藏于中国典型培养物保 藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC No：M 2017141，命名为：蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)YUPP-10。
生防菌通过种间或种内的相互作用关系来实现对病害的控制，如：竞争、寄生、溶菌作用、通过次生代谢产物抗菌、诱导寄主产生系统抗病性、促进植物生长、提高植物防御力和调节寄主的微生态环境等途径。本发明获得的棉花内生细菌 YUPP-10，对大丽轮枝菌有直接抑制作用，其玉米蛭石培养物拌土栽培棉苗，使棉花产生对黄萎病的抗病性。细菌自身繁殖速度快，极易获取，且应用操作简便，在生产上适宜推广应用。
本发明的有益效果是：
(1)YUPP-10分离自棉花维管束，对人、畜、农作物无毒害作用，对环境无污染破坏。YUPP-10为蜡状芽孢杆菌，该菌分布广泛，在水体、空气、土壤、植物组织和动物肠道中均有存在。能够作为水体和土壤改良剂、工程菌和生防制剂等。
(2)YUPP-10能够在人工培养基上大量培养，且在适宜条件下细菌以稳定的几何级数极快增长，用玉米蛭石培养的YUPP-10，在培养72h便可用作生物菌肥。
(3)YUPP-10对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌(Verticillium dahilae)具有明显的抑制效果，在7d时的抑制率达到76.96％。其挥发性代谢产物对大丽轮枝菌也有抑制效果，在10d时的抑制率达到77.03％。
(4)YUPP-10对棉花黄萎病具有防治作用。将YUPP-10玉米蛭石培养的菌肥以1％，2％和4％的接种与棉花培养基混合栽培棉花，对棉花黄萎病的防治效果分别为88.00％、77.65％和87.5％。
因此，本发明所提供的YUPP-10菌肥，对棉花黄萎病有显著的抑制效果，且其生产周期短，制作成本低，使用方便，在植物病害生物防治的应用方面具有十分广阔的前景。
附图说明
图1为YUPP-10在LB固体平板上的菌落形态；
图2为YUPP-10对大丽轮枝菌的拮抗作用；
图3为YUPP-10挥发性代谢产物对大丽轮枝菌的拮抗作用；
图4为YUPP-10对棉花黄萎病的防治效果。
蜡状芽孢杆菌YUPP-10(Bacillus cereus YUPP-10)，其于2017年3月24日保 藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(地址：中国武汉武汉大学邮编430072)， 保藏号为CCTCCNo：M 2017141。
具体实施方式
实施例1菌株的分离
(一)菌株的分离
在棉花田块采集表型无病症的棉花植株，将棉花植株表面进行清洗，去皮，剪成2-3cm长的小段。以下步骤在超净工作台中完成，将去皮后的棉花植株用70％乙醇消毒1min，无菌水洗涤3次，3％次氯酸钠消毒处理4min，无菌水洗涤3次，将消毒后的棉花秆剪碎研磨，用无菌水制成悬浮液，涂布于LB平板上，37℃下培养 24h，挑取单菌落，根据形态、大小、色泽等特点挑取有差异的单菌落转接到富集培养基平板上37℃下培养24h，挑选富集培养基上可生长的细菌进一步纯培养。将纯化后的菌株保种。
(二)YUPP-10的特征
1.形态特征：革兰氏阳性菌，菌体细胞杆状，末端方，在LB培养基上呈灰白色，不透明，表面较粗糙，似融蜡状，边缘呈锯齿状，微有光泽。
2.分子特征：分子辅助鉴定结果表明，YUPP-10为蜡状芽孢杆菌。
根据形态特征和分子鉴定结果，将YUPP-10归属为Bacillus cereus。
(三)培养基
1.LB液体培养基：5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g氯化钠，用去离子水定容到1000mL，调节pH为7.0-7.3，于121℃下高温高压灭菌20min。
2.LB固体培养基：5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g氯化钠，12g琼脂粉，用去离子水定容到1000mL，调节pH为7.0-7.3，于121℃下高温高压灭菌20min。
3.富集培养基：5g胰蛋白胨、100g魔芋精粉和3g琼脂粉，加去离子水定容到1000mL，调节pH为7.0-7.3，于121℃下高温高压灭菌20min。
实施例2 YUPP-10对大丽轮枝菌的抑制作用
(一)试验方法
1.YUPP-10整体代谢产物对大丽轮枝菌的抑制作用
将YUPP-10接入LB液体培养基中，在37℃、180rpm/min的恒温摇床中振荡培养24h。在不同PDA平板培养基中心接种大丽轮枝菌，呈三角状对称在PDA平板中打孔，每点距离中心20mm，在其中两点接入100μLYUPP-10培养液，剩余一点加入100μL的LB液体培养基作为对照，25℃恒温培养观察抑菌情况，7d后测量大丽轮枝菌菌落半径。采用以下公式计算YUPP-10对病原真菌生长的相对抑制率，每处理重复三次。
菌落半径(cm)＝测量菌落半径-0.25；
相对抑制率(％)＝(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径×100
2.YUPP-10挥发性代谢产物对大丽轮枝菌的抑制作用
将YUPP-10接入LB液体培养基中，在37℃、180rpm/min的恒温摇床中进行振荡培养24h。在PDA平板培养基中心接种已经活化的直径为5mm的大丽轮枝菌，在LB固体平板上接种20μL已经活化的内生细菌，将两个平板对扣密封，25℃恒温培养箱中培养10d。以病原菌与空白的LB平板对峙培养作为对照，每个处理重复 3次。利用“十”字交叉法测定病原真菌菌落的直径大小，计算抑制率。
菌落直径(cm)＝测量菌落直径-0.5
相对抑制率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100
(二)培养基
1.LB液体培养基：5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g氯化钠，用去离子水定容到1000mL，调节pH为7.0-7.3，于121℃下高温高压灭菌20min。
2.LB固体培养基：5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g氯化钠，12g琼脂粉，用去离子水定容到1000mL，调节pH为7.0-7.3，于121℃下高温高压灭菌20min。
3.PDA培养基：200g马铃薯煮沸滤液，20g葡萄糖，12g琼脂粉，加去离子水定容到1000mL，调节pH为7.0，于121℃下高温高压灭菌20min。
(三)试验结果
如图2和图3所示，YUPP-10对棉花维管束病害病原菌大丽轮枝菌菌丝生长有明显的抑制作用，其整体代谢产物对大丽轮枝菌的抑制率在7d时为76.96％。 YUPP-10挥发性代谢产物对大丽轮枝菌菌丝生长也有明显的抑制作用，其抑制率在 10d时为77.03％。
实施例3 YUPP-10对棉花黄萎病的控制作用
(一)试验方法
1.YUPP-10菌肥的制备
将保藏的YUPP-10接种在LB固体培养基上，于37℃下培养18h进行活化；将活化的菌株接种在LB液体培养基中，在37℃、180rpm/min振荡培养18h，制成菌种液；将YUPP-10菌种液接种在灭菌的蛭石玉米培养基克氏瓶中，37℃下培养 72h，取出培养物，在阴凉处风干，制成YUPP-10菌肥，备用。
2.棉苗的栽培
用10％双氧水对棉花种子消毒10min，无菌水清洗3次后，在室温下无菌水浸种处理24h，以耐病品种鲁棉研21号为供试品种。棉苗培育方法参照朱荷琴等人使用的蛭石沙子无底纸钵定量蘸菌液法，其中将制备好的YUPP-10菌肥以1％，2％和 4％的质量比混到蛭石沙土基质中。
棉苗在日光温室中培养，环境温度控制在20-30℃，土壤相对湿度在60％以上，光照良好。待棉苗长一片真叶时，接种Vd080孢子悬浮液10ml，孢子浓度为1×107 cfu/ml。接种方法为，将10ml孢子悬浮液倒入直径10cm的培养皿中，将纸钵从塑料盘中取出放置在培养皿中40s，待孢子悬浮液被吸干后，将纸钵放回塑料盘中。棉苗置18-28℃的温室中，按5级分级标准进行病害的分级调查。计算病株率、病情指数和防治效果。
(二)培养基
1.LB液体培养基：5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g氯化钠，用去离子水定容到1000mL，调节pH为7.0-7.3，于121℃下高温高压灭菌20min。
2.LB固体培养基：5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g氯化钠，12g琼脂粉，用去离子水定容到1000mL，调节pH为7.0-7.3，于121℃下高温高压灭菌20min。
3.PDA培养基：200g马铃薯煮沸滤液，20g葡萄糖，12g琼脂粉，加去离子水定容到1000mL，调节pH为7.0，于121℃下高温高压灭菌20min。
4.Czapek培养基：2g NaNO3、0.5g KCl、0.02g FeSO4·7H2O、0.5g MgSO4、30 g蔗糖、1.31g K2HPO4，加去离子水定容到1000mL，调节pH为7.0，于121℃下高温高压灭菌20min。
5.玉米蛭石培养基：将等质量的玉米粉和蛭石加适量水(将培养基捏在手中不滴水)混匀，闷半小时后，放入克氏瓶中，121℃下高温高压灭菌20min。
(三)试验结果
按1％，2％和4％的菌肥量处理棉花，其病情指数及防治效果见表1，其中1％的菌肥处理时，防治效果最高，为88.00％。YUPP-10对棉花黄萎病的防治效果见附图4。
表1 YUPP-10菌肥对棉花黄萎病的室内盆栽防治效果
注：病情指数和防治效果后面的不同字母，表示不同处理之间差异达显著水平(LSD，P＜0.05) 。

Claims (3)

1.一种棉花内生细菌YUPP-10其特征在于：其菌种保藏号为：CCTCC No：M2017141。
2.权利要求1所述的棉花内生细菌YUPP-10在抑制棉花黄萎病病菌方面的应用。
3.权利要求1所述的棉花内生细菌YUPP-10在防治棉花黄萎病中的应用。
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