CN104087653A - 一种快速人工接种离体鉴定百合灰霉病抗性的方法 - Google Patents

Abstract

一种快速人工接种离体鉴定百合灰霉病抗性的方法，其方法是：先通过培养容器采用马铃薯燕麦淀粉培养基培养百合灰霉病菌，经灭菌锅灭菌，静置放凉为培养基配制；待测百合的采集：取现蕾初期的健康且无百合灰霉病病原菌感染的百合株苗，其上须有6-9片健康叶片，分别从上中下三个部位取完整百合叶片；病原菌采集：取百合典型感病叶片，分离纯化病原菌，经鉴定是灰霉菌后，在马铃薯燕麦淀粉培养基上培养7d，接种健康的百合叶片；采用菌丝块接种法、孢子液喷雾接种法或摩擦接种法接种；接种好病原菌的百合叶片叶柄伤口处用湿润的棉花包裹，将接种好的百合叶片置于培养皿中，喷洒适量无菌水进行保湿培养；然后分别于3、5、7、9d调查叶片发病情况观察鉴定。本发明实现了在可控条件下准确高效地鉴定不同百合品种对百合灰霉病的抗性。

Description

一种快速人工接种离体鉴定百合灰霉病抗性的方法

技术领域

本发明属于花卉抗病性鉴定技术领域，具体涉及一种快速人工接种离体鉴定百合灰霉病抗性的方法。

背景技术

百合(Liliumspp.)是百合科百合属多年生草本球根植物，主要分布在亚洲东部、欧洲、北美洲等北半球温带地区，全球已发现有上百个品种，其中55种产于中国,中国是其最主要的起源地。百合除传统药用、食用和提取香精外，由于其花姿优美,气度不凡,已是目前世界上最受欢迎的鲜切花之一。百合灰霉病(Botrytis cinerea)是百合地上部的主要病害，是抑制百合生产的重要因素之一。

百合灰霉病病原菌为椭圆葡萄孢(Botrytis elliptica(Berk.) Cooke.)。每年6-8月，为灰霉病多发季节，田间百合叶片枯死，花器褐腐，茎杆发黑，后期似火烧一样。病株地下鳞茎提早停止生长，导致产量下降，品质变劣， 严重制约了百合生产和发展。一般产量损失20%~30%,严重流行时可造成失收。

不同百合品种对百合灰霉病的感、抗程度不同，目前鉴定百合抗病性的调查方法多以田间喷雾处理为主，此法易受温度、湿度、光照、空气传播等不定因素影响，造成鉴定结果不准确并且较难估计观察时间。由于灰霉病原菌可在土壤及各种植体上存活生长，在寄主被害部或以菌核遗留在土壤中越冬，故开放式活体接种易造成该病的扩散。因此采用一种可控的、科学有效的方法评价和鉴定不同百合品种的抗病性，对于抗源材料的筛选、抗病品种的选育和抗性品种的利用具有十分重要的意义。

长期以来，由于没有筛选到抗源材料，致使百合抗灰霉病的育种工作进展缓慢。综上可见，如果能找到离体条件下安全、快速的鉴定百合对百合灰霉病抗性的方法，可为筛选抗病百合资源提供科学、有效的评价方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速人工接种离体鉴定百合灰霉病抗性的方法，高效地鉴定不同百合品种对于百合灰霉病的抗性。

本发明提供的技术方案如下：

A.培养容器准备：采用平板培养皿作为离体培养容器，在培养皿中放置滤纸2-3张。

B.培养基配制：采用马铃薯燕麦淀粉培养基培养百合灰霉病菌，高压灭菌锅121℃灭菌25分钟，超净工作台上将灭菌后的培养基分装到平板培养皿中，静置放凉。

C.待测百合的采集：选取现蕾初期的健康且无百合灰霉病病原菌感染的百合株苗，其上须有6-9片健康叶片，分别从上、中、下3个部位剪取完整的百合叶片。

D.病原菌采集：取百合典型感病叶片，分离纯化病原菌，经鉴定是灰霉菌后，在马铃薯燕麦淀粉培养基上培养7d，用于接种健康的百合叶片。

E. 接种方法：采用以下的菌丝块接种法，孢子液喷雾接种法或摩擦接种法来接种百合灰霉病原菌；

所述菌丝块接种法：用直径为0.5cm的打孔器将在马铃薯燕麦淀粉培养基上生长7d的灰霉菌打成菌丝块，将其接种于待测百合叶片；

所述孢子液喷雾接种法：用无菌水将在马铃薯燕麦淀粉培养基上生长7d的灰霉菌孢子洗出，并调成浓度为1×10⁵~5×10⁵ cfu/mL的菌悬液，喷雾接种于待测百合叶片；

所述摩擦接种法：挑取马铃薯燕麦淀粉培养基上生长7d的灰霉病原菌与适量石英砂及无菌水混合均匀，用无菌的小指形管沾取调制好的孢子叶，避开主叶脉涂抹于待测叶片上，摩擦数次至形成细小的伤口；

F.培养：接种好病原菌的百合叶片叶柄伤口处用湿润的棉花包裹，将接种好的百合叶片置于培养皿中，喷洒适量无菌水，于25℃条件下保湿培养。

G.观察鉴定：分别于3、5、7、9d调查叶片发病情况。

接种方法中，可根据所需选择不同的接种方法，其中，菌丝接种法接种的叶片感病症状最典型，易于观察，孢子液喷雾接种法操作最简便，摩擦接种法能使叶片最快感病。

本发明的积极效果是：建立了快速人工接种离体鉴定百合灰霉病抗性的方法，实现了在可控条件下准确高效地鉴定不同百合品种对百合灰霉病的抗性，对于抗源材料的筛选、抗病品种的选育和抗性品种的利用具有十分重要的意义。

下面将通过实例对发明作进一步详细说明，但下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。

具体实施方式

实例1：

成功离体快速接种鉴定了百合品种‘新铁炮’对百合灰霉病的抗性，认定了百合品种‘新铁炮’对百合灰霉病表现为感病。

具体实施方法如下：

A.培养容器准备。

用9cm平板培养皿作为离体培养容器。先用自来水洗净，再用蒸馏水润洗3遍，之后在培养皿中放置滤纸2-3张。

B.培养基配制。

1.培养基的基本组分：琼脂、马铃薯、燕麦、淀粉。

具体含量为：琼脂20g/L，马铃薯200g/L,燕麦20g/L，淀粉20g/L。

2.培养基的配制方法

称取燕麦20g用纱布包好，称取去皮的马铃薯200g切碎，一起加入1000mL的蒸馏水中煮沸20分钟，纱布过滤。补水至1000mL，加入琼脂20g充分熔化，再加入淀粉20g搅拌均匀，定容。

3.培养基分装方法

将定容后的培养基置于高压灭菌锅121℃灭菌25分钟，在超净工作台上将灭菌后的培养基分装到平板培养皿中，静置放凉。

C.待测百合叶片的采集。

选取现蕾初期的健康且无百合灰霉病病原菌感染的‘新铁炮’百合株苗，其上须有6-9片健康叶片，分别从上、中、下3个部位剪取完整的百合叶片。

D.病原菌采集。

病原菌取自发病初期带有典型百合灰霉病病斑的百合品种‘新铁炮’的叶片。

百合叶片受百合灰霉病病原菌侵染后，在发病初期为透明水渍状小斑点，尔后急剧扩大为褐色或红褐色圆形、椭圆形病斑，大小不一，边缘呈水渍状。采集感病叶片时，自叶柄基部摘取。

分离纯化病原菌的方法：将典型的单个病斑用解剖刀从病斑边缘切取小块，每边长约3-5mm。将病组织小块放入70%酒精中浸3-5s后，按无菌操作法将并组织移入0.1%升汞液中消毒1.5min，然后放入灭菌水中连续漂洗3次。用无菌操作法将病组织小块移至马铃薯燕麦淀粉培养基平面上，每培养皿内呈三角形放置3块，翻转培养皿，23℃黑暗培养7d。经鉴定为灰霉菌后，挑取灰霉病菌在马铃薯燕麦淀粉培养基上23℃纯化培养7d，用于接种健康的百合叶片。

E.病原菌接种。

1.菌丝块接种法：用直径为0.5cm的打孔器将在马铃薯燕麦淀粉培养基上生长7d的灰霉菌打成菌丝块，接种于待测‘新铁炮’百合叶片背面，每片叶接种2个菌丝块。

2.孢子液喷雾接种法：用无菌水将在马铃薯燕麦淀粉培养基上生长7d的灰霉菌孢子洗出，并调成浓度为1×10⁵~5×10⁵ cfu/mL的菌悬液，于待测‘新铁炮’百合叶片背面喷雾接种。

3.摩擦接种法：挑取马铃薯燕麦淀粉培养基上生长7d的灰霉病原菌与适量石英砂及无菌水混合均匀，用无菌的小指形管沾取调制好的孢子液，避开主叶脉涂抹于待测‘新铁炮’百合叶片背面，摩擦数次至形成细小的伤口。

F.培养。

将接种好病原菌的百合叶片叶柄伤口处用湿润的棉花包裹，将接种好的百合叶片背面向上置于有滤纸的培养皿中，随即用无菌蒸馏水喷雾，盖好培养皿保湿培养，置于25℃黑暗条件下。

G.观察症状与鉴定。

分别于3、5、7、9d调查叶片发病情况。肉眼观察，用摩擦接种法接种的‘新铁炮’百合在第5天病斑已融合成大斑，病斑面积占整个面积的50%以上。而用菌丝块接种法和孢子液喷雾接种法在第7天达到病斑面积占整个面积的50%以上。

鉴定结果表明，百合品种‘新铁炮’为感病品种。且用摩擦接种法接种的叶片发病速度最快。

实施例2：

成功离体接种鉴定了百合品种‘岷江’对百合灰霉病抗性，认定了百合品种‘岷江’对百合灰霉病表现为抗病。

实施具体方法如下：

A.在实施中，培养容器准备、培养基配制、待测百合叶片采集、病原菌采集、病原菌接种、具体培养方法同实例1，所不同的是，在培养第5天时，用摩擦接种法接种的待测百合品种‘岷江’叶片上病斑较少，病斑面积占整个叶面积的5%以下。而且菌丝块接种法和孢子液喷雾接种法接种的叶片无病斑。

鉴定结果表明，百合品种‘岷江’为抗病品种。且用摩擦接种法接种的叶片发病速度最快。

B.抗病性鉴定的田间检验。

1.试验田设计：

选取田间健康的‘新铁炮’百合和‘岷江’百合，不同的百合品种之间隔离开。

2.接种与管理。

用上述的灰霉菌孢子菌悬液，采用孢子液喷雾法接种

3.观察与鉴定：

每个品种每小区调查10株，每株分上中下3个部位随机摘取6片叶，肉眼观察。

接种后9天，‘新铁炮’百合叶面病斑面积占整个面积的50%以上。而‘岷江’百合叶面无任和可见症状。

由此可以认定，此种人工离体接种鉴定方法是准确可靠的。

以上在两个百合品种上的实施应用结果表明，本发明方法是一种快速有效鉴定百合灰霉病抗性的人工接种离体鉴定方法，对于抗源材料的筛选、抗病品种的选育和抗性品种的利用具有十分重要的意义。

Claims (3)

1.一种快速人工接种离体鉴定百合灰霉病抗性的方法，其特征在于：

A.培养容器准备：采用平板培养皿作为离体培养容器，在培养皿中放置滤纸2-3张；

B.培养基配制：采用马铃薯燕麦淀粉培养基培养百合灰霉病菌，高压灭菌锅121-125℃灭菌25分钟，超净工作台上将灭菌后的培养基分装到平板培养皿中，静置放凉；

C.待测百合的采集：选取现蕾初期的健康且无百合灰霉病病原菌感染的百合株苗，其上须有6-9片健康叶片，分别从上、中、下3个部位剪取完整的百合叶片；

D.病原菌采集：取百合典型感病叶片，分离纯化病原菌，经鉴定是灰霉菌后，在马铃薯燕麦淀粉培养基上培养7d，用于接种健康的百合叶片；

E.接种方法：采用以下的菌丝块接种法，孢子液喷雾接种法或摩擦接种法来接种百合灰霉病原菌；

所述菌丝块接种法：用直径为0.5cm的打孔器将在马铃薯燕麦淀粉培养基上生长7d的灰霉菌打成菌丝块，将其接种于待测百合叶片；

所述孢子液喷雾接种法：用无菌水将在马铃薯燕麦淀粉培养基上生长7d的灰霉菌孢子洗出，并调成浓度为1×10⁵~5×10⁵ cfu/mL的菌悬液，喷雾接种于待测百合叶片；

所述摩擦接种法：挑取马铃薯燕麦淀粉培养基上生长7d的灰霉病原菌与适量石英砂及无菌水混合均匀，用无菌的小指形管沾取调制好的孢子叶，避开主叶脉涂抹于待测叶片上，摩擦数次至形成细小的伤口；

F.培养：接种好病原菌的百合叶片叶柄伤口处用湿润的棉花包裹，将接种好的百合叶片置于培养皿中，喷洒适量无菌水，于25℃（常温）条件下保湿培养；

G.观察鉴定：分别于3、5、7、9d调查叶片发病情况。

2.根据权利要求1所述的人工接种离体鉴定百合灰霉病抗性的方法，其特征在于：在E.接种方法中，选择菌丝接种法接种。

3.根据权利要求1所述的人工接种离体鉴定百合灰霉病抗性的方法，其特征在于：所述的平板培养皿为9cm平板培养皿。