CN102643892A - 一种用于霜霉病菌抗药性频率监测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于植物霜霉病菌抗药性频率监测的方法，步骤为：A1、在待监测区域采集霜霉病病样，带回室，在19℃下黑暗培养诱导产生新的孢子囊；A2、将所有采集病叶上的新生孢子囊洗脱并混合制成孢子囊悬浮液；A3、分别将孢子囊悬浮液用液滴法接种健康离体植物叶片制成的叶碟背面，叶碟事先用无菌水浸泡30分钟和2×(待侧杀菌剂最小抑制浓度)药液浸泡30分钟；A4、将接种叶蝶置于吸水纸保湿的培养皿中，保湿培养；A5、测算抗药性菌株的频率。该方法简单易学，容易操作，对实验仪器要求不高，且能较准确地反映田间霜霉病菌群体的抗药性情况，具有较高的实际应用价值。

Description

一种用于霜霉病菌抗药性频率监测的方法

技术领域

本发明涉及，尤其涉及的是一种用于霜霉病菌抗药性频率监测的方法。

背景技术

霜霉菌是植物的重要病原菌，所致病害通称霜霉病。霜霉菌对寄主植物的破坏性强，危害性大，由霜霉菌引起的植物病害大多难以控制。尤其是果蔬及经济作物易受到霜霉菌侵染，其潜育期短，再侵染频繁，在植物的一个生长季节内病菌可迅速发展造成病害流行，导致农业生产的严重损失。

目前，化学农药防治仍是主要防控手段，在霜霉病的防治中发挥着重要的作用。20世纪70年代中期以前，用于霜霉病防治的药剂主要是一些保护性杀菌剂如取代苯基类的百菌清、双二硫代氨基甲酸酯类的代森锰锌及一些铜制剂等广谱型保护性杀菌剂。自70年代后期开始，甲霜灵、霜霉威、烯酰吗啉、氟吗啉等内吸性杀菌剂的使用对该病害的防治取得了划时代的进展。但由于这些内吸性杀菌剂具有较单一的作用位点，长期单一大面积使用后霜霉菌容易对这些杀菌剂产生抗药性，极大的降低了杀菌剂的防治效果，增加了生产成本和农药环境污染的风险。

近年来，人们逐渐意识到病原菌抗药性产生的危害，提出了基于抗药性监测的杀菌剂使用策略。对于一些能离体培养的病原菌通常先进行病原菌的采集、分离，然后测定病原菌群体对杀菌剂的敏感性，明确病原菌对某些杀菌剂的抗性频率，然后指导杀菌剂的合理选用。而霜霉病菌是专性寄生菌，在培养基上不能分离培养，限制了这种方法在霜霉病菌抗药性监测中的应用。我们也尝试从发病叶片上挑取单个孢子囊接种到离体植株叶片上进行病原菌的分离和纯化，但由于单个孢子的侵染效率极低，不能真实地反映病原菌群体对杀菌剂的抗药性情况。因此，迫切需要发明一种简单易行的抗药性监测方法用于专性寄生霜霉病菌的抗药性监测，以科学合理地指导霜霉病的化学防治。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于霜霉病菌抗药性监测的简单、易行的方法。

本发明克服了目前常规抗药性监测方法不能用于专性寄生霜霉菌分离、纯化的缺点，提供了一种直接在离体叶片上测定霜霉病菌抗药性频率的方法。

本发明的技术方案是利用植株离体叶片生物测定法监测霜霉病菌的抗药性频率。该方法的步骤为(I)在待监测区域采集霜霉病病样，带回室内将病叶上的杂质和老熟的孢子囊用无菌水洗脱，在19℃下暗培养诱导产生新的孢子囊；(II)将所有采集病叶上的新生孢子囊洗脱并混合制成孢子囊悬浮液(1.0×10⁴个孢子囊/mL)；(iii)分别将混合孢子悬浮液用液滴法(20μl/滴)接种到(1)无菌水浸泡30分钟和(2)用2×待侧杀菌剂最小抑制浓度浸泡30分钟的健康离体植物叶片制成的叶碟(直径2cm)背面；(IV)将接种的叶蝶置于吸水纸保湿的培养皿(直径15cm)中，先于19℃黑暗条件下保湿培养12h，再于19℃、12h光暗交替条件下保湿培养5-7d，然后测量叶碟上的发病面积；(V)根据杀菌剂处理叶碟上霜霉病的发病面积与未用药剂处理叶碟上霜霉病的发病面积的比率来测算抗药性菌株的频率。

上述方法中，所述的霜霉病样的采集在每块田间采用5点法取样，每点取10个发病叶片，然后将5个点采集的病叶一并装入保鲜袋中带回室内进行进一步测定。

所述孢子囊悬浮液的制备方法为：室内将田间采集的病叶上的杂质和老熟的孢子囊用无菌水洗净后，在19℃下暗培养诱导产生新的孢子囊，再将各个叶片上新生孢子囊用4℃无菌水洗脱并混合成混合孢子悬浮液，并将孢子囊悬浮液的浓度用血球计数板调整为1.0×10⁴个孢子囊/mL；

所述无菌水和杀菌剂处理叶碟的制备：健康离体叶片优选为植株中部相同叶龄的叶片；叶碟的尺寸为ф2.5cm；将制取的叶碟混匀后分为两份，每份50个叶碟。一份叶碟用无菌水浸泡30min，另一份叶碟用2倍待侧杀菌剂对霜霉菌最小抑制浓度药液浸泡30min。两份处理浸泡过程中均含有0.02％的吐温20和0.1％的甲醇；浸泡过程中需经常搅动，以确保每个叶碟都被均匀的湿润。

所述霜霉病菌混合孢子悬浮液的接种方法为：取出晾干后叶背朝上整齐置于用吸水纸保湿的玻璃培养皿(ф15cm)中，在每个叶碟背面用量程50μL的移液器滴加20μL混合孢子囊悬浮液于叶蝶中央位置。

所述离体叶碟的培养方法为：装有接种叶碟的培养皿在19℃黑暗条件下保湿培养12h，使霜霉病菌孢子完成萌发和侵染过程，再于19℃、12h光暗交替条件下培养，待叶碟背面产生黑色霉层后，测定每个叶碟上的发病面积。

所述抗药性菌株抗性频率的计算方法为：抗药性菌株的频率(％)＝(药剂处理叶碟上的发病面积/未用药剂处理叶碟的发病面积)×100。

本发明利用了霜霉病菌的敏感菌株和抗性菌株在带药叶碟上的生长与否来估算抗药性菌株的频率。通常在无药剂处理的叶碟上敏感和抗性菌株均能侵染致病，能代表抗药性菌株和敏感菌株群体的侵染情况；而在2×杀菌剂最低抑制浓度处理的叶碟上仅抗药性菌株能侵染而敏感菌株不能侵染，仅代表抗性菌株群体的侵染情况。因此，抗药性菌株的频率可以用药剂处理叶碟上的发病面积与未用药剂处理叶碟上的发病面积的比值估算得到。这种方法有效地解决了专性寄生霜霉菌抗药性监测中不能分离培养的难点，提供了一种简单、易行的霜霉菌抗药性监测方法，为霜霉病的防治和抗药性治理提供了极大的便利。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例一、黄瓜霜霉病菌敏感菌株和抗性菌株混合培养多代后抗药性频率的变化监测。

1、材料和方法

(1)供试药剂：96％氟吗啉(flumorph)原药。

(2)供试植株：将感病黄瓜品种长春密刺栽培于ф15cm，高12cm的育苗钵内，置于温室中培养，植株长到5叶期后采集第3叶位的叶片，用于叶碟的制作。

(3)供试菌株：黄瓜霜霉病菌菌株K-1(可以采用其他常见菌株替代)为实验室从田间采集的对氟吗啉敏感的菌株，氟吗啉对该菌株的最小抑制浓度为0.70μg/mL；RK-1为利用紫外线诱导法从亲本菌株K-1中诱导获得的对氟吗啉产生抗药性的突变体，该突变体在1.0μg/mL氟吗啉处理过的叶碟上能正常生长。

(4)抗药性频率测定方法：

(I)菌株产孢：分别将亲本菌株K-1及抗药性菌株RK-1在健康离体黄瓜叶片上培养产孢；

(II)混合孢子悬浮液配制：分别配制各供试菌株的孢子囊悬浮液(浓度为1.0×10⁴个孢子囊/mL)，然后将抗药性菌株和亲本敏感菌株(R∶S)按0∶10；2∶8；5∶5；8∶2；10∶0的比例混合形成抗感菌株孢子悬浮液混合液；

(III)离体叶碟制作：选择温室培养至5叶龄的黄瓜植株上第四叶位上的健康叶片，用打孔器制备直径15mm的黄瓜叶碟。随机混匀，分成2组，每组50个叶碟，分别于(1)无菌水浸泡30分钟和(2)用2×氟吗啉最小抑制浓度(1.5μg/mL)浸泡30分钟，然后将叶碟取出，用吸水纸洗干叶碟上的药液，叶背朝上置于培样皿内用相同药剂浓度润湿的吸水纸上。

(IV)孢子混合液的接种：将敏感菌株和抗性菌株制作的混合孢子悬浮液用40μl移液枪取接种到分别采用无菌水浸泡30分钟和用2×氟吗啉最小抑制浓度(1.5μg/mL)浸泡30分钟的健康离体植物叶片制成的叶碟(直径2cm)背面，每个叶碟接种20μl。

(V)将接种的叶蝶置于吸水纸保湿的培养皿(直径15cm)中，先于19℃黑暗条件下保湿培养12h，再于19℃、12h光暗交替条件下保湿培养5-7d，然后测量叶碟上的发病面积；

(VI)根据杀菌剂处理叶碟上霜霉病的发病面积与未用药剂处理叶碟上霜霉病的发病面积的比率来测算抗药性菌株的频率。抗药性菌株的频率(％)＝(药剂处理叶碟上的发病面积/未用药剂处理叶碟的发病面积)×100。

(5)试验结果

结果表明(表1)，亲本菌株K-1和抗药性菌株RK-1孢子囊悬浮液按照不同比例混合培养第1代后，抗药性菌株的抗药性频率和接菌前抗药性菌株与敏感菌株的混合比例基本一致，表明这种方法能正确反映霜霉病菌群体中抗性菌株的频率；混合培养第3代后抗药性菌株的频率略有降低。

表1氟吗啉抗药性菌株k-1和敏感菌株混合培养后的抗性频率变化

注：a：代表未用药剂处理过叶碟的发病率；b：代表用药剂处理叶碟的发病率；c：抗药性菌株的频率。

实施例二、黄瓜霜霉病菌对甲霜灵的抗药性频率监测

1、材料和方法

(1)供试药剂：95％甲霜灵原药；

(2)供试植株：将感病黄瓜品种长春密刺栽培于ф15cm，高12cm的育苗钵内，置于温室中培养，植株长到5叶期后采集第3叶位的叶片，用于叶碟的制作。

(3)抗性频率测定方法

(I)田间菌株采集：试验从云南省昆明市晋宁县郊区黄瓜大棚采集黄瓜霜霉病病样，采集按照5点法取样，每点取10个发病叶片，然后将5个点采集的病叶一并装入保鲜袋中带回室内。

(II)混合孢子悬浮液制备：室内将田间采集的病叶上的杂质和老熟的孢子囊用无菌水洗净后，在19℃下暗培养过夜诱导产生新的孢子囊，再将各个叶片上新生孢子囊用4℃无菌水洗脱并混合成混合孢子悬浮液，并将孢子囊悬浮液的浓度用血球计数板调整为1.0×10⁴个孢子囊/mL；

(III)离体叶碟制作：选择温室培养的5叶期黄瓜的第3叶位的健康叶片，用打孔器制备直径15mm的叶碟。随机混匀，分成2组，每组50个叶碟，分别于(1)无菌水浸泡30分钟和(2)用2×甲霜灵最小抑制浓度(1.6μg/mL)浸泡30分钟，两份处理浸泡过程中均含有0.02％的吐温20和0.1％的甲醇；浸泡过程中需经常搅动，以确保每个叶碟都被均匀的湿润。浸泡结束后将叶碟取出，用吸水纸洗干叶碟上的药液，叶背朝上置于培样皿内用相同药剂浓度润湿的吸水纸上。

(IV)孢子混合液的接种：将混合孢子悬浮液用40μl移液枪取接种到(1)无菌水浸泡30分钟和(2)用2×甲霜灵最小抑制浓度(1.6μg/mL)浸泡30分钟的健康离体植物叶片制成的叶碟(直径2cm)背面，每个叶碟接种20μl。

(V)叶蝶培养：将接种的叶蝶置于吸水纸保湿的培养皿(直径15cm)中，先于19℃黑暗条件下保湿培养12h，再于19℃、12h光暗交替条件下保湿培养5-7d，然后测量叶碟上的发病面积；

(VI)抗性频率测定：根据杀菌剂处理叶碟上霜霉病的发病面积与未用药剂处理叶碟上霜霉病的发病面积的比率测算抗药性菌株的频率。抗药性菌株的频率(％)＝(药剂处理叶碟上的发病面积/未用药剂处理叶碟的发病面积)×100

2、试验结果

昆明市晋宁县郊区黄瓜大棚中黄瓜霜霉病菌抗性监测结果表明(表2)，所采集的病原菌群体中抗性菌株的比率约为8.11％，这表明该大棚中甲霜灵的使用较多，霜霉病菌已经对其产生了抗药性，在随后的防治中应限制甲霜灵的使用，利用氟吗啉、烯酰吗啉、苯酰菌胺等与甲霜灵无交互抗药性的杀菌剂进行防治。

表2黄瓜霜霉病菌对甲霜灵的抗药性频率监测结果

药剂浓度(mg/L)	平均发病面积(mm2)	抗性频率(％)
			0	19.48	-
3	1.58	8.11

实施例三、葡萄霜霉病菌对氟吗啉和甲霜灵的抗药性监测

1、材料和方法

(1)供试药剂：95％甲霜灵原药，96％氟吗啉原药。

(2)供试植株：供试植株为感霜霉病品种红地球(Vitis vinifera cv.Red Globe)。

(3)抗性频率测定方法：

(I)田间菌株采集：试验从云南省昆明市石林县和富民县城郊葡萄园、文山州砚山县葡萄园采集霜霉病病样，采集按照5点法取样，每点取10个发病叶片，然后将5个点采集的病叶一并装入保鲜袋中带回室内。

(II)混合孢子悬浮液制备：室内将田间采集的病叶上的杂质和老熟的孢子囊用无菌水洗净后，在19℃下暗培养过夜诱导产生新的孢子囊，再将各个叶片上新生孢子囊用4℃无菌水洗脱并混合成混合孢子悬浮液，并将孢子囊悬浮液的浓度用血球计数板调整为1.0×10⁴个孢子囊/mL；

(III)离体叶碟制作：选择温室培养的红地球葡萄新生第四片健康叶片，用打孔器制备直径15mm的叶碟。随机混匀，分成2组，每组50个叶碟，分别于(1)无菌水浸泡30分钟和(2)用2×最小抑制浓度(氟吗啉：3μg/mL；甲霜灵：1μg/mL)浸泡30分钟，两份处理浸泡过程中均含有0.02％的吐温20和0.1％的甲醇；浸泡过程中需经常搅动，以确保每个叶碟都被均匀的湿润。浸泡结束后将叶碟取出，用吸水纸洗干叶碟上的药液，叶背朝上置于培样皿内用相同药剂浓度润湿的吸水纸上。

(IV)孢子混合液的接种：将混合孢子悬浮液用40μl移液枪取接种到(1)无菌水浸泡30分钟和(2)用2×供试杀菌剂最小抑制浓度浸泡30分钟的健康离体植物叶片制成的叶碟(直径2cm)背面，每个叶碟接种20μl。

(V)叶蝶培养：将接种的叶蝶置于吸水纸保湿的培养皿(直径15cm)中，先于19℃黑暗条件下保湿培养12h，再于19℃、12h光暗交替条件下保湿培养5-7d，然后测量叶碟上的发病面积；

(VI)抗性频率测定：根据杀菌剂处理叶碟上霜霉病的发病面积与未用药剂处理叶碟上霜霉病的发病面积的比率测算抗药性菌株的频率。抗药性菌株的频率(％)＝(药剂处理叶碟上的发病面积/未用药剂处理叶碟的发病面积)×100

2、试验结果

试验对采集石林、富民和文山葡萄园的霜霉病菌群体对氟吗啉的抗药性监测结果表明(表2)，采自石林地区的葡萄霜霉病菌对氟吗啉的抗性频率总体较低，抗性频率为0.4％；采自文山地区的葡萄霜霉病菌对氟吗啉抗性频率为3.1％；采自富明地区的葡萄霜霉病菌对氟吗啉的抗性频率为3.2％。该结果表明，氟吗啉在石林地区的使用较少，葡萄霜霉对氟吗啉的抗药性频率较低，而文山和富民霜霉病菌群体中对氟吗啉的抗性菌株出现的频率较高，在防治过程中应注意氟吗啉与其他作用机制不同的杀菌剂交替或轮换使用，避免由于抗药性的产生导致的防治失效。

试验同时对采自石林、富民和文山地区的葡萄霜霉病菌对甲霜灵的抗药性情况也进行了监测。结果表明(表2)，石林、文山和富民三地采集的菌株群体对甲霜灵的抗性频率分别为14.8％、30.6％和9.6％。这表明三个地方葡萄霜霉病菌对甲霜灵产生了较严重的抗药性。尤其文山地区采集的霜霉病菌抗性频率达到30.6％，甲霜灵在这一地区霜霉病的防治中基本失去效果。生产中应及时限制甲霜灵的大量使用。

表3不同地区的葡萄霜霉病菌对氟吗啉和甲霜灵抗性监测结果

实施例四、大白菜霜霉病菌对苯醚菌酯、甲霜灵和苯酰菌胺的抗药性监测

1、材料和方法

(1)供试药剂：95％甲霜灵原药，96％氟吗啉原药。

(2)供试植株：供试植株为大白菜品种康根白菜-27。

(3)抗性频率测定方法：

(I)田间菌株采集：试验从云南省昆明市安宁县、晋宁县和富民县采集霜霉病病样，采集按照5点法取样，每点取10个发病叶片，然后将5个点采集的病叶一并装入保鲜袋中带回室内。

(II)混合孢子悬浮液制备：室内将田间采集的病叶上的杂质和老熟的孢子囊用无菌水洗净后，在19℃下暗培养过夜诱导产生新的孢子囊，再将各个叶片上新生孢子囊用4℃无菌水洗脱并混合成混合孢子悬浮液，并将孢子囊悬浮液的浓度用血球计数板调整为1.0×10⁴个孢子囊/mL；

(III)离体叶碟制作：选择温室培养的红地球(Vitis vinifera cv.Red Globe)葡萄新生第四片健康叶片，用打孔器制备直径15mm的叶碟。随机混匀，分成2组，每组50个叶碟，分别于(1)无菌水浸泡30分钟和(2)用2×最小抑制浓度(甲霜灵：1μg/mL；苯醚菌酯0.5μg/mL、苯酰菌胺1.5μg/mL)浸泡30分钟，两份处理浸泡过程中均含有0.02％的吐温20和0.1％的甲醇；浸泡过程中需经常搅动，以确保每个叶碟都被均匀的湿润。浸泡结束后将叶碟取出，用吸水纸洗干叶碟上的药液，叶背朝上置于培样皿内用相同药剂浓度润湿的吸水纸上。

(IV)孢子混合液的接种：将混合孢子悬浮液用40μl移液枪取接种到(1)无菌水浸泡30分钟和(2)用2×供试杀菌剂最小抑制浓度浸泡30分钟的健康离体植物叶片制成的叶碟(直径2cm)背面，每个叶碟接种20μl。

(V)叶蝶培养：将接种的叶蝶置于吸水纸保湿的培养皿(直径15cm)中，先于19℃黑暗条件下保湿培养12h，再于19℃、12h光暗交替条件下保湿培养5-7d，然后测量叶碟上的发病面积；

(VI)抗性频率测定：根据杀菌剂处理叶碟上霜霉病的发病面积与未用药剂处理叶碟上霜霉病的发病面积的比率测算抗药性菌株的频率。抗药性菌株的频率(％)＝(药剂处理叶碟上的发病面积/未用药剂处理叶碟的发病面积)×100

2、试验结果

试验对采集安宁、晋宁和富民葡萄园的霜霉病菌群体对氟吗啉的抗药性监测结果表明(表4)，三个地区采集的菌群对苯醚菌酯和苯酰菌胺的抗药性频率均为0。表明这些地区还未出现抗药性菌群。农民用药情况调查结果也表明，这些地区还未见这两类杀菌剂的使用。而安宁、晋宁和富明三个地区大白菜霜霉病菌对甲霜灵均产生了抗药性，其抗药性频率分别为9.64％、8.93％和25.06％。这与甲霜灵在这些地区长期大量使用有关，生产生也推荐暂停或减少甲霜灵的使用频率，推广使用一些与甲霜灵无交互抗药性的杀菌剂进行抗药性治理。

表4不同地区的大白菜霜霉病菌对苯醚菌酯、甲霜灵和苯酰菌胺抗性监测结果

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (3)

1.一种用于霜霉病菌抗药性频率监测的方法，其特征是，包括以下步骤：

A1、在待监测区域用五点法采集霜霉病病样，带回室内将病叶上的杂质和老熟的孢子囊用无菌水洗脱，在19℃下黑暗培养诱导产生新的孢子囊；

A2、将所有采集病叶上的新生孢子囊洗脱并混合制成孢子囊悬浮液，浓度为：1.0×10⁴-1.0×10⁵个孢子囊/mL；

A3、分别将孢子囊悬浮液用液滴法接种健康离体植物叶片制成的叶碟背面，叶碟事先用无菌水浸泡30分钟和2×(待侧杀菌剂最小抑制浓度)药液浸泡30分钟；

A4、将接种叶蝶置于吸水纸保湿的培养皿中，先于19℃黑暗条件下保湿培养12h，再于19℃、12h光暗交替条件下保湿培养5-7d，然后测量叶碟上的发病面积；

A5、根据杀菌剂处理叶碟上霜霉病的发病面积与未用药剂处理叶碟上霜霉病的发病面积的比率来测算抗药性菌株的频率。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：田间采用五点法采集霜霉病病样，室内将老熟孢子囊和杂质洗脱后在19℃下黑暗培养诱导产生新的孢子囊，再将所有采集的病样孢子囊洗脱混合形成混合孢子囊悬浮液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：将混合孢子囊悬浮液接种叶蝶背面，每个叶蝶背面接种20μl孢子悬浮液，叶碟浸泡过程中无菌水和药液均含有0.02％的吐温20和0.1％的甲醇；浸泡过程中需经常搅动，以确保每个叶碟都被均匀的湿润。