CN101333550A

CN101333550A - 一种环二肽类化合物制备方法及其应用

Info

Publication number: CN101333550A
Application number: CNA2007100152146A
Authority: CN
Inventors: 陈靠山; 田黎; 裴月湖; 华会明; 张久明
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University; Shandong University; Qingdao University of Science and Technology
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University; Shandong University; Qingdao University of Science and Technology
Priority date: 2007-06-27
Filing date: 2007-06-27
Publication date: 2008-12-31
Anticipated expiration: 2027-06-27
Also published as: CN101333550B

Abstract

本发明提供一种环二肽类化合物制备方法及其应用，该方法是以保藏编号为：CGMCC2094分离的内生真菌进行发酵、分离、提纯得到环二肽类化合物，该化合物能有效地诱导农作的系统抗性，对不同苗期的植物的根和茎叶生长具有明显的促进作用，并能增强幼苗的素质，促进壮苗的形成，其方法简便可行，对环境没有污染，其周期短，所用原料廉价，易于形成大规模批量生产，生产成本低。

Description

一种环二肽类化合物制备方法及其应用

技术领域

本发明属于海洋微生物领域，具体的说是从南海潮间带红树植物海莲分离的内生真菌的发酵、培养、提纯，还涉及到该化合物作为促进植物生长和诱导植物抗病的应用，该菌种保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址为北京海淀区中关村一条13号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2007年6月18日，保藏编号CGMCC2094，分类命名团青霉Penicillium commune。

背景技术

环二肽类化合物在人、动物、植物、真菌和细菌中均有发现，结构不同的环二肽，其生物功能不同，目前发现的功能有抑制杂草、抗菌、杀虫、动物钙离子通道调节、和微生物生理调控的信号分子等。因此，环二肽类化合物在农药和调节剂的应用等方面具有较大的开发潜力。

我国农业可持续发展的指导思想是在确保食物安全、发展高产优质高效产业、促进农业经济不断增长的同时，维护资源的合理利用，建设良好的生态环境，逐步形成一个协调的农业经济、技术、生态系统和健全繁荣的社会系统，以实现农业和农村的持续发展。随着我国加入WTO，国内市场进一步的开放，我国农产品将面临严峻的挑战。需要发展优质、无公害的农产品，参与国际市场的竞争。而我国部分产品达不到优质、无公害的主要原因是农药残留超标。近几年来，国际上对农药残留问题日益重视，禁用限用的农药越来越多、残留标准不断提高，控制农药已成为关系我国食品和农产品出口贸易重大关键性的问题。开发研制高效、低成本、无公害的生物农药，是当前植物病害防治研究的重要内容。

生物农药的种类较多，通过对植物预先施加调节剂或诱导剂，提高植物的生长和抗逆作用，诱发植物的防卫反应，激发植物整体抗性水平，提高抵抗病害的能力，这种方法对植物病害的控制具有抗病持久、抗病谱广、无污染等优点，是目前研究的热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种环二肽类化合物制备方法及其应用，该化合物是以海洋潮间带盐生植物的内生微生物更适合农用的原理为基础，从南海潮间带红树植物海莲茎内分离到一株内生团青霉NHS 35-04菌株，经发酵、分离、提纯得到该化合物；通过生物活性试验表明该类化合物对提高小麦、黄瓜、番茄生长和抗逆有较强的促进作用。

本发明的目的是由以下技术方案实现的，制备了一种环二肽类化合物，所述的环二肽类化合物环是从南海潮间带红树植物海莲(Bruguiera cylindrica)分离的NHS35-04菌株代谢产生，该菌株经传统分类鉴定和18S rRNA测序，Genbank比对(登陆号DQ810185)与团青霉Penicillium commune相似率100％，故鉴定为该种。从其发酵物中分离得到环二肽化合物环(L-亮-L-异亮)结构为3-另丁基-6-异丁基哌嗪-2，5-二酮，包括如下步骤：

1)以保藏编号为：CGMCC2094的盐生植物内生团青霉菌NHS35-04菌株，进行发酵，其发酵液的配方为：马铃薯浸汁150ml-200ml，酵母粉1g-2g，葡萄糖10g-15g，NaCl 15g-20g，MgCl₂·6H₂O1.1g-1.3g，KCl0.1g-0.2g，FePO₄0.005g-0.01g，水1000mL，琼脂15g-17g，pH值6～7，25℃培养5-7天；然后接入培养液，马铃薯浸汁150ml-200ml，酵母粉1g-2g，葡萄糖15g-20g，NaCl 10g-15g，MgCl₂6H₂O1.1g-1.3g，KCl 0.1g-0.2g，FePO₄0.005g-0.01g，水1000mL，pH 6-7，25℃装样量100mL/250mL培养12天获得；

上述列举的这些参数只是实现本发明的较佳方案。因此，本领域技术人员在上述范围以外选择合适的培养条件也能获得本发明的发酵液。

2)发酵液用纱布过滤，得到菌丝体和水层；

3)菌丝体置于容量瓶中，用丙酮超声提取，直至减压回收溶剂后无残留物为止干燥浸膏用甲醇反复溶解，得到甲醇可溶性浸膏10g。水层用等量的正丁醇萃取3次，得到浸膏15g。

4)经薄层检验后将两部分合并，以甲醇反复溶解除盐后，进行硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇梯度洗脱，收集各流份，利用各种色谱分离技术得到。根据权利要求1所述的环二肽类化合物环(L-亮-L-异亮)，其特征在于：所述的该环(L-亮-L-异亮)为无色针状结晶(甲醇)，10％硫酸不显色，无荧光，NMR有二肽类化合物的特征性信号，分析¹³C-NMR(75MHz，DMSO-d₆)数据δ_C：23.2、23.6、21.9、43.8、52.4是亮氨酸特征信号，δ_C：11.9、24.4、15.2、38.3、58.9是异亮氨酸特征信号。

环(L-亮-L-异亮)结构如下：

通过浸种、水培和喷施三种处理方式，环(L-亮-L-异亮)化合物对不同苗期的植物生长有促进作用，并能增强幼苗的素质，促进壮苗的形成。

环(L-亮-L-异亮)化合物用于提高植物的系统抗性，激活植物自身的防御反应，增强黄瓜抗白粉病、枯萎病和番茄抗灰霉病的能力。

环(L-亮-L-异亮)化合物处理后可提高植物体内的水杨酸含量，从而增强植物抗病性。

应用过程中环(L-亮-L-异亮)化合物的水溶液适宜浓度为3.0~8.0mg/L或者其100-300倍发酵液。

本发明的环二肽类化合物的应用效果在于：

1、菌株的活菌和代谢产生的环(L-亮-L-异亮)化合物都能有效地诱导农作的系统抗性，对不同苗期的植物的根和茎叶生长具有明显的促进作用，并能增强幼苗的素质，促进壮苗的形成，该产品通过诱导植物抗性对不同植物病害的有较强的防治效果，具有很好的开发价值，显示出良好的市场前景。

2、该菌株容易培养，用较简单的方法就可从发酵液中分离提纯得到环二肽类化合物，相对于化学合成，其方法简便可行，对环境没有污染，周期短，所用原料廉价，易于形成大规模批量生产，生产成本低。

附图说明

图1是环(L-亮-L-异亮)诱导后黄瓜局部叶游离水杨酸含量变化图；

图2是环(L-亮-L-异亮)诱导后黄瓜局部叶结合态水杨酸含量变化图。

具体实施例

本发明的保护范围不仅局限于以下实施例中，本发明的具体技术步骤如下：

实施例1：真菌Penicillium commune的发酵和环(L-亮-L-异亮)的制备

1)将NHS35-04菌株，放在固体培养基：马铃薯浸汁150ml-200ml，酵母粉1g-2g，葡萄糖10g-15g，NaCl 15g-20g，MgCl₂·6H₂O1.1g-1.3g，KCl0.1g-0.2g，FePO₄0.005g-0.01g，水1000mL，琼脂15g-17g，pH值6～7，25℃培养5-7天；然后接入培养液，马铃薯浸汁150ml-200ml，酵母粉1g-2g，葡萄糖15g-20g，NaCl10g-15g，MgCl₂6H₂O1.1g-1.3g，KCl 0.1g-0.2g，FePO₄0.005g-0.01g，水1000mL，pH6-7，25℃装样量100mL/250mL培养12天获得。

2)发酵液30L纱布过滤，得到菌丝体和水层，菌丝体晾干置于容量瓶中，用丙酮超声提取，直至减压回收溶剂后无残留物为止，干燥浸膏用甲醇反复溶解，得到甲醇可溶性浸膏10g；水层用等量的正丁醇萃取3次，得到浸膏15g；经薄层检验后将两部分合并，以甲醇反复溶解除盐后，进行硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇梯度洗脱，收集各流份，利用各种色谱分离技术得到环二肽化合物环(L-亮-L-异亮)。

实施例2：环(L亮-L-异亮)化合物促进小麦根和芽生长的活性试验

将干燥成熟的小麦种子浸入环(L-亮-L-异亮)的水溶液中，避光25℃培养，48h后取出小麦种子，测量种子芽长与根长，与空白组对照计算芽与根系增长率，环(L-亮-L-异亮)在几乎所有测试浓度下都表现出了促进小麦根系生长的活性，最高达30％左右，而对芽的作用很弱或没有作用(见表1)。

表1环(L-亮-L-异亮)对小麦根和芽生长的影响

实施例3：环(L-亮-L-异亮)化合物对黄瓜的促生长作用

供试黄瓜(Cucumis sativus L.)种子为“鲁3号”抗病品种，环(L-亮-L-异亮)，含量90％。用蒸馏水分别配制成1.0，3.0，5.0，8.0，10.0mg/L溶液备用，生长指标的测定，根长指植株根部最低点到土面之间的距离，株高指从土面到生长最高点之间的长度，茎粗指子叶下2cm处的粗度，幼苗地下部(包括根系和地下茎)、地上部的干重采用80℃烘干法测定；

(1)环(L-亮-L-异亮)处理对黄瓜种子发芽的影响

将黄瓜种子用不同浓度的环(L-亮-L-异亮)溶液浸泡24h，再用清水漂洗，用滤纸吸干水分，置于内垫有四层湿纱布的培养皿中，于27℃下催芽，待种子露白后，计算种子萌发率。同时设清水处理作对照。处理组和对照组均为3重复，每重复100粒，结果表明，黄瓜种子用不同浓度的环(L-亮-L-异亮)溶液浸泡处理后，种子的发芽率有所提高，5.0mg/L为最适处理浓度，种子发芽率相对未处理的对照提高8.89％。(2)环(L-亮-L-异亮)浸种处理对黄瓜生长的影响

取经过不同浓度的环(L-亮-L-异亮)溶液浸泡处理的发芽种子播于内装有无菌营养土的塑料盘(40×25×10cm)中，于日光温室(23±2℃，相对湿度70-80％)内育苗，进行常规管理，待黄瓜幼苗第1真叶完全展开时，测定生长指标，同时设清水处理作对照，处理组和对照组均重复3次，每处理30株。结果表明，经过环(L-亮-L-异亮)溶液浸种处理后，1叶期的黄瓜幼苗生长状态得到明显改善，根长、株高、单株幼苗鲜重和干重均高于未经处理的幼苗；环(L-亮-L-异亮)为5.0mg/L时为最适浓度，此时幼苗的根长增加49.23％，株高增加40.20％；单株幼苗鲜重增加36.80％，干重增加66.67％，较对照水平差异显著(P＜0.01)。

(3)环(L-亮-L-异亮)喷施处理对黄瓜生长的影响

将黄瓜种子播种在营养钵中，出苗后定苗于内装有无菌营养土的塑料盘中，待黄瓜幼苗长出第1片真叶时，分别以环(L-亮-L-异亮)溶液(含有少许的Tween-80)喷施叶面，待黄瓜2叶期时再喷施1次，至3叶期时，测量生长指标。同时设清水处理作对照，处理组和对照组均设3重复，每重复30株。结果表明，经过处理的黄瓜幼苗生长状况较未处理的对照有明显改善，对形成壮苗有积极的促进作用。环(L-亮-L-异亮)浓度为5.0gm/L时，是最适浓度。此时，黄瓜幼苗根长增加39.75％，株高增加14.29％；地下部干重增加40.74％，地上部干重增加46.53％，壮苗指数增加101.06％(P＜0.01)。

实施例4：盆栽试验环(L-亮-L-异亮)化合物对黄瓜抗白粉病的诱导效应

供试黄瓜(Cucumis sativus L.)种子为“鲁3号”抗病品种。黄瓜种子经5％NaCl0溶液表面消毒15mi n，再用清水漂洗，置于培养箱中27℃催芽，选取露白种子播于无菌营养土中，于日光温室内育苗，进行常规管理，待黄瓜幼苗3叶期时，备用。

环(L-亮-L-异亮)含量90％，用蒸馏水配制成5.0mg/L溶液备用。黄瓜白粉病菌(Sphaerotheca cucurbitca)，来源于大棚种植的发病黄瓜叶。病叶采回后，在23±2℃保湿24h，促使病斑上萌发更多的孢子；然后用毛笔在病叶的霉层上刷下孢子，用无菌水配制成孢子悬液，浓度为10⁶个孢子/ml。

用喷雾器将环(L-亮-L-异亮)溶液均匀地喷施于试验植株的叶片上，以叶面刚往下滴液为准，用塑料薄膜保湿(相对湿度90％)，诱导3d；然后采用涂抹法在叶片的背面接种白粉病菌孢子悬液，同时设对照组，先喷清水后接种病原菌。处理组和对照组均为3重复，每重复调查10株幼苗。接种后3d统计黄瓜植株的发病率和病情指数。

盆栽黄瓜白粉病分级标准，根据病斑占叶面积的比例将病情分为0、1、2、3、4级。0级：无病斑，叶片完全健康；1级：病斑面积占整个叶面积的10％及其以下；2级：病斑面积占整个叶面积的11％～25％；3级：病斑面积占整个叶面积的25％～50％；4级：病斑面积占整个叶面积的50％以上。

相对防效(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)×100/对照病情指数，调查结果表明：与对照组相比，环(L-亮-L-异亮)处理组在一定程度上能缩短黄瓜植株白粉病害的发病进程，显著降低白粉病菌侵染的程度，使病情指数明显降低，防病效果明显(见表2)。对照组在接菌3d后，病指为36.74±5.6％，此后叶片感染病菌的程度随发病时间进程逐渐增加；接种24d后，病指高达88.65±5.2％，此时对应植株已出现严重的过敏反应，叶片上大片的白粉病斑清楚可见；到30d时，黄瓜植株几乎全部染病，病指增加到91.62±6.9％，叶片上出现很厚的霉层，好像撒了一层白粉，白毛逐渐由白色变为灰白色，有些叶片卷曲，呈黄褐色干枯状。

环(L-亮-L-异亮)处理组的黄瓜植株，表现出较好的抗性，前期一直没有感染白粉病菌，生长良好，至接种病原菌12d后叶片上开始出现轻微病斑，此时病指为6.56±1.2％；此后叶片染病的程度随发病时间进程也在逐渐增加，但始终明显低于对照组(P＜0.01)；到30d时，所对应的黄瓜植株发病症状均较轻，依然有未被病原菌侵染的组织，没有霉层，病指仅为29.49±2.7％，相对防效达到68.90％，差异极显著(P＜0.01)。表明先用环(L-亮-L-异亮)处理黄瓜叶片后再接种病原菌，黄瓜植株能表现出良好的抗性。

表2环(L-亮-L-异亮)对黄瓜白粉病病情指数的影响

每一数值为平均值±SD(n＝30)；*表示t检验后，与对照组相比呈极显著性差异(P＜0.01)。

每一数值为平均值±SD(n＝30)；*表示t检验后，与对照组相比呈显著性差异(P＜0.05)。

实施例5：盆栽试验环(L-亮-L-异亮)对番茄抗灰霉病的诱导效应

供试番茄(Lycopersicon esculentum)种子为“青研1号”抗病品种。番茄种子经5％NaCl O溶液消毒、漂洗、催芽后，种植于灭菌营养土中。待番茄长至3叶期时，定苗，每盆10株；5～6叶期时，备用。

环(L-亮-L-异亮)，同实施例3。

灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea Bc.)，来源于大棚种植的发病番茄叶。菌株在上述培养基上以22℃培养7d后，以无菌水配制孢子悬液，浓度为10⁵个孢子/ml。

向试验植株的番茄叶片喷施环(L-亮-L-异亮)溶液，3天后，将灰葡萄孢霉孢子悬液接种在番茄叶片背面，然后放置在相对湿度为90％、温度为23℃的温室内，观察发病情况，统计病情指数。同时设对照组，先喷清水后接种病原菌。处理组和对照组均为3重复，每重复调查30株幼苗

盆栽番茄灰霉病分级标准：0级：无病斑；1级：病斑面积占整个叶面积5％以下；3级：病斑面积占整个叶面积6％～10％；5级：病斑面积占整个叶面积11％～20％；7级：病斑面积占整个叶面积21％～40％；9级：病斑面积占整个叶面积40％以上。

病情指数(％)＝(∑(病情级数×该级病株数)×100)/(病情最高级数×总株数)相对防效(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)×100/对照病情指数。

环(L-亮-L-异亮)诱导番茄抗灰霉病的结果如表3所示。经环(L-亮-L-异亮)诱导后，番茄的发病时间及发病进程均较对照组的延迟。病原接种96小时后，诱导组叶片的病斑面积和组织受损伤程度均小于对照组的，病情指数较对照组的降低42.5％。病原挑战接种168h后，对照组植株已出现严重的过敏反应，病斑清楚可见，而诱导组植株表现出较好的抗性，其病情指数为54.3±8.1％，较对照组的降低30.9％。接种336h后，对照组的叶片已经卷曲、腐烂，而诱导组植株仍可见健康组织，因此环(L-亮-L-异亮)可提高番茄的抗病能力。

表3环(L-亮-L-异亮)对番茄抗灰霉病的诱导效应

实施例6：NHS35-04菌株发酵液盆栽试验对番茄抗灰霉病的诱导效应

供试番茄(Lycopersicon esculentum)种子为“中蔬四号“(新改良型)。番茄种子经3％NaClO溶液消毒、漂洗、催芽后，种植于灭菌营养土中。待番茄长至3叶期时，定苗，每盆10株；5叶期时，备用。NHS35-04发酵液，稀释150倍，灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea.)，山东省农业科学院植物保护研究所提供，以无菌水配制孢子悬液，浓度为10⁷个孢子/ml。

向试验植株的番茄叶片喷施NHS35-04发酵液溶液，3天后，采用涂抹法接种，将灰葡萄孢霉孢子悬液涂抹在番茄叶片背面，然后放置在湿度为90％、温度为18℃的保湿桶中，观察发病情况，统计病情指数，同时设对照组，先喷清水后接种病原菌，处理组和对照组均为3重复，每重复调查10株幼苗，于发病后4d调查病情指数。

病情指数(％)＝(∑(病情级数×该级病株数)×100)/(病情最高级数×总株数)相对防效(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)×100/对照病情指数，调查结果表明：与对照组相比，NHS35-04菌株活菌处理组能显著降低番茄灰霉病菌侵染的程度，使病情指数明显降低，相对防效为49.90％，差异极显著(见表4)。

表4NHS35-04对番茄灰霉病病情指数的影响

每一数值为平均值±SD(n＝30)；*表示t检验后，与对照组相比呈显著性差异(P＜0.01)。

实施例7：环(L-亮-L-异亮)对植物抗病相关激素的诱导

以黄瓜为模式植物，通过离体诱导的方式，研究环(L-亮-L-异亮)对黄瓜抗病相关激素水杨酸的影响

供试黄瓜种子为“鲁3号”抗病品种，黄瓜种子经5％NaClO溶液表面消毒15min，再用清水漂洗、吸胀，置于培养箱中27℃催芽，选取露白种子播于无菌营养土中，于日光温室内育苗，进行常规管理，待黄瓜幼苗3叶期时，备用。环(L-亮-L-异亮)，诱导、接种及取样用5.0mg/mL的环(L-亮-L-异亮)对黄瓜幼苗第1真叶进行喷雾，至叶片上附着细密水珠但不流淌，喷清水作为对照，从零点开始，每隔24小时为一个取样点，分别收集第1、2真叶，处理和对照每次各取三个样，样品在液氮中冷冻后保存于-80℃冰箱中，用于水杨酸含量分析。

游离态水杨酸的提取

样品加入液氮研磨成粉末，取0.5g转入1.5mL离心管中，再加入1mL90％甲醇，漩涡混匀1min，超声处理5min，离心5min。上清液转入2mL离心管中，沉淀重悬于0.5mL100％甲醇中，再次超声、离心处理。合并两次上清液，离心5min；上清液(甲醇和水相)中加入10μL0.2mol/L的NaOH，在SpeedVac真空离心浓缩仪中浓缩，浓缩后的残留物加入250μL5％的三氯乙酸，漩涡混匀；再用800μL乙酸乙酯∶环己烷(1∶1)萃取两次；合并有机相，加入60μL0.2mol/L(pH5.5)醋酸钠缓冲液，在SpeedVac真空离心浓缩仪中浓缩，残留物溶于600μLHPLC洗脱液中。

结合态水杨酸的提取，于水相中加入约300μL8mol/LHCl，80℃水浴加热1h；再用800μL乙酸乙酯∶环己烷(1∶1)萃取两次，合并有机相，加入60μL0.2mol/L(pII5.5)醋酸钠缓冲液，在SpeedVac真空离心浓缩仪中浓缩，残留物溶于600μLHPLC洗脱液中。

水杨酸含量的测定，使用高效液相色谱法测定水杨酸含量。色谱柱为Thermo-C₁₈柱(Φ4.6mm×250mm，填料粒径为5μm)，流动相为0.2mol/L(pH5.5)醋酸钠缓冲液∶甲醇＝9∶1，流速为0.8mL/min，水杨酸保留时间为17.0min。

环(L-亮-L-异亮)诱导后黄瓜幼苗水杨酸含量的变化

黄瓜幼苗经5.0mg/L环(L-亮-L-异亮)诱导后，局部叶、系统叶中水杨酸含量的测定结果见图1，图2，可以看到，黄瓜幼苗经诱导后，局部叶(第1真叶)中游离态和结合态水杨酸的含量都上升。游离态水杨酸含量在诱导后第1天达到峰值，比同期对照高263.2％，第2天开始持续下降，在第5天恢复至对照水平，结合态水杨酸含量在诱导后第1天开始上升，第4天达峰值，比同期对照高833.9％，局部叶中游离态和结合态水杨酸的总含量在第4天达到峰值，比同期对照高479.4％。

许多研究都证明内源水杨酸是植物抗性诱导过程中的一个重要的信号分子，植物经非亲和病原物侵染浸染或诱导子诱导后，体内水杨酸含量的增加，诱发了抗病基因的活化和PR蛋白的合成，从而增强植物抗病性。

尽管上面已经描述了本发明的具体例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换，其都没有超出本发明的保护范围。

Claims

1、一种环二肽类化合物环(L-亮-L-异亮)制备方法，所述的环二肽类化合物环是从南海潮间带红树植物海莲(Bruguiera cylindrica)分离的NHS35-04菌株经18S rRNA测序和Genbank比对(登陆号DQ810185)与团青霉Penicillium commune相似率100％，从其发酵物中分离得到环二肽化合物环(L-亮-L-异亮)结构为3-另丁基-6-异丁基哌嗪-2，5-二酮，其特征包括如下步骤：

1)以保藏编号为：CGMCC No.2094的盐生植物内生团青霉菌NHS35-04菌株，进行发酵，其发酵液的配方为：马铃薯浸汁150ml-200ml，酵母粉1g-2g，葡萄糖10g -15g，NaCl 15g -20g，MgCl₂ 6H₂O1.1g-1.3g，KCl0.1g-0.2g，FePO₄0.005g-0.01g，水1000mL，琼脂15g-17g，pH值6～7，25℃培养5-7天；然后接入培养液，马铃薯浸汁150ml-200ml，酵母粉1g-2g，葡萄糖15g-20g，NaCl 10g-15g，MgCl₂ 6H₂O1.1g-1.3g，KCl0.1g-0.2g，FePO₄0.005g-0.01g，水1000mL，pH 6-7，25℃装样量100mL/250mL培养12天获得；

2)发酵液用纱布过滤，得到菌丝体和水层；

3)菌丝体置于容量瓶中，用丙酮超声提取，直至减压回收溶剂后无残留物为止，干燥浸膏用甲醇溶解，得到甲醇可溶性浸膏10g，水层用正丁醇萃取3次，得到浸膏15g；

4)经薄层检验后将两部分合并，以甲醇溶解除盐后，进行硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇梯度洗脱，收集流份，利用色谱分离技术得到。

2、根据权利要求1所述的环二肽类化合物环(L-亮-L-异亮)，其特征在于：所述的该环二肽类化合物环(L-亮-L-异亮)为无色针状结晶(甲醇)，10％硫酸不显色，无荧光，NMR有二肽类化合物的特征性信号，分析¹³C-NMR(75MHz，DMSO-d₆)数据δ_c：23.2、23.6、21.9、43.8、52.4是亮氨酸特征信号，δ_c：11.9、24.4、15.2、38.3、58.9是异亮氨酸特征信号。

3、根据权利要求1所述的环二肽化合物环(L-亮-L-异亮)的应用，其特征在于：通过浸种、水培和喷施三种处理方式，环二肽化合物环(L-亮-L-异亮)对不同苗期的植物生长有促进作用，并能增强幼苗的素质，促进壮苗的形成。

4、根据权利要求1所述的环二肽化合物环(L-亮-L-异亮)的应用，其特征在于：环二肽化合物环(L-亮-L-异亮)用于提高植物的系统抗性，激活植物自身的防御反应，增强黄瓜抗白粉病、枯萎病和番茄抗灰霉病的能力。

5、根据权利要求1所述的环二肽化合物环(L-亮-L-异亮)的应用，其特征在于：环二肽化合物环(L-亮-L-异亮)处理后可提高植物体内的水杨酸含量，增强植物抗病性。

6、根据权利要求3、4、5所述的环二肽化合物环(L-亮-L-异亮)的应用，其特征在于：应用过程中环二肽化合物环(L-亮-L-异亮)的水溶液适宜浓度为3.0~8.0mg/L或者其100-300倍发酵液。