CN103980060B - 一种中华鹅膏菌培养基及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

一种中华鹅膏菌培养基及其制备方法与应用，涉及食用菌。所述培养基为马铃薯100g/L、玉米粒20～30g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15～20g/L、马尾松松针汁液150～300mL/L。将新鲜马尾松松针加水，加热煮沸后继续煮沸，冷却，过滤弃马尾松松针，得马尾松松针汁液；将玉米粒加水，加热煮沸后继续煮沸，即加入去皮马铃薯小块，继续煮沸，过滤得玉米马铃薯汁液；将马尾松松针汁液与玉米马铃薯汁液混合加热，加入琼脂继续加热，待琼脂溶解后加入葡萄糖，溶解后冷却并补足水分，分装试管，灭菌后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后即得中华鹅膏菌培养基，可用于诱导中华鹅膏菌母种。

Description

一种中华鹅膏菌培养基及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及食用菌，尤其是涉及一种中华鹅膏菌培养基及其制备方法与应用。

背景技术

中华鹅膏菌也称中华鹅膏(AmanitasinensisZhuL.Yang)，隶属于担子菌门(Basidiomycota)，伞菌目(Agaricales)，鹅膏科(Amanitaceae)，鹅膏菌属(Amanita)。鹅膏菌属包含大约600个伞菌物种，包含一些世界有名的最毒菇类，也有很多可食用菇类。中华鹅膏菌是中国科学院昆明植物研究所杨祝良研究员于1997年首次在我国西南地方发现并命名的，为担子菌门伞菌目鹅膏科鹅膏属的大型真菌，它与壳斗科和松属植物形成外生菌根(Ectomycorrhizal，ECM)。分布于四川，湖南，广东，广西，贵州，云南，福建省分布于中部、西部和北部山区。该菌菌盖直径7～12cm，最大可达25cm，灰白色至浅灰色，中部深灰色，有菌幕；菌肉较厚，白色菌褶离生至近离生，白色，较密，不等长；菌柄10～15cm×1～2.5cm，污白色至浅灰色；菌环顶生至近顶生；孢子无色，宽椭圆至椭圆形。

中华鹅膏菌可食用，味道鲜美，营养丰富，产量高，是山区百姓十分喜爱的食用菌类，戴玉成等人在2010年第1期《菌物学报》发表的《中国食用菌名录》中，也明确将中华鹅膏菌列为食用菌。在福建省尤溪县的百姓食用历史就十分悠久，当地人称为灰乌菌。每年6、7月和9、10月是子实体采收季节，市场上每公斤鲜品的销售价格在40元以上，远远高于香菇等常规食用菌的价格，由于它的产量很高，单个鲜品的重量可以达到250g以上，又是天然健康森林食品，具有极高开发利用价值。

以前的研究结果表明，中华鹅膏菌作为食用菌已为人们长期食用，但目前该菌仅从野外采集，无法人工栽培。

发明内容

本发明的目的在于提供一种中华鹅膏菌培养基及其制备方法与应用。

所述中华鹅膏菌培养基的组成为：马铃薯100g/L、玉米粒20～30g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15～20g/L、马尾松松针汁液150～300mL/L，自然pH值。

所述中华鹅膏菌培养基的制备方法如下：

1)将新鲜马尾松松针25～75g加水250～500mL，加热煮沸后继续煮沸30min，冷却，过滤弃马尾松松针，得马尾松松针汁液；

2)将玉米粒20～30g加水1000mL，加热煮沸后继续煮沸30min，即加入去皮马铃薯小块100g，继续煮沸30min，过滤，得玉米马铃薯汁液；

3)将马尾松松针汁液与玉米马铃薯汁液混合，加热，再加入琼脂15～20g，继续加热，待琼脂溶解后，加入葡萄糖20g，溶解后冷却并补足水分至1L，均匀混合，分装试管，加塞，包扎，灭菌后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后即得中华鹅膏菌培养基。

在步骤1)中，所述加热煮沸的时间可为20～40min；所述过滤可采用8层纱布过滤。

在步骤2)中，所述加热煮沸的时间可为20～40min；所述过滤可采用8层纱布过滤。

在步骤3)中，所述灭菌的条件可为121℃下灭菌20min。

所述中华鹅膏菌培养基可用于诱导中华鹅膏菌母种。

所述中华鹅膏菌母种的诱导方法如下：

切取野生采摘的子实体小组织块，再嵌入试管斜面中华鹅膏菌培养基表面，在温度为20～26℃下暗培养7～15天，组织培养块上长出白色绒毛状菌丝，即为中华鹅膏菌母种。

所述切取野生采摘的子实体小组织块的方法可为：野外采摘生长健壮、无虫害、未完全开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄部分，用解剖刀去除菌盖中部表皮，从菌盖中部取十字，将子实体一分为四，取菌柄与菌盖交接处的内部无菌组织块，切成0.25～0.5cm²的小块。

所述中华鹅膏菌母种提纯与转管培养的方法如下：

1)中华鹅膏菌母种提纯的方法：在菌丝萌发后，挑选色泽纯、健壮、长势正常和无间断的菌线，在无菌室超净工作台上连同中华鹅膏菌培养基钩取菌丝，接入另备的中华鹅膏菌培养基上，在20～26℃的恒温条件下，培养7～15天，待菌丝长满试管后，再从中择优取用，即为“母代”母种；

2)中华鹅膏菌母种转管培养的方法：将一支长满菌丝的试管在无菌操作下，分别转接到多只试管中培养，一般每支母种可扩接20～50支，也可以再次转管扩接，但转管次数不得超过4次，这些转管扩接后，即为供生产上使用的子代母种。

本发明的创新点在于利用马尾松松针的水煮液配备中华鹅膏菌培养基，中华鹅膏菌是与马尾松形成共生的外生菌根真菌，大量的组织培养试验都表明鹅膏菌真菌难以纯培养，本发明在常用的PDA培养基基础上增加马尾松松针水煮液，很好地解决了中华鹅膏菌的组织培养难题。

本发明以野生采摘的子实体上组织块为材料，在试管培养基上直接诱导分化菌丝体。

类似的研究结果有武觐文于1975年在《微生物学报》第1期发表的《氧化松针煮汁培养基——一种选择性真菌培养基》，该文指出氧化松针煮汁培养基可用于土壤真菌、植物病原真菌、昆虫寄生真菌的分离、计数和培养，常见的真菌有毛霉、根霉、酵母、青霉、曲霉、交链孢霉、芽枝霉、镰刀霉、木霉、轮枝霉、葡萄霉、茎点霉以及束梗霉等。本发明与武觐文研究的不同之处在于：一是本发明解决中华鹅膏菌的菌丝体培养问题，而氧化松针煮汁培养基无法解决这一问题；二是氧化松针煮汁培养基与本发明的中华鹅膏菌培养基组成成分不同；三是本发明的马尾松松针水煮液无需氧化，过程更简洁。

本发明在菌丝诱导培养过程中，经多次的试验，筛选出最优的组织培养基和组织培养条件，解决了中华鹅膏菌的母种培养技术难题，这为今后中华鹅膏菌的人工培养奠定了重要基础。

本发明的有益效果是：

1)高效性：本发明可获得中华鹅膏菌的大量可繁殖菌丝体，能满足大量生产的需要，而现有其它技术均无法获得可繁殖菌丝体；

2)易实现：本发明的特点在于，应用野生的中华鹅膏菌小组织块通过适宜的培养基质就可萌发出菌丝，操作容易；

3)生产成本低：本发明的试验培养基成分取自天然的马尾松松针、马铃薯、玉米粒等，培养基质容易获取，设备简单，成本低廉。

具体实施方式

以下实施例将对本发明作进一步的说明，并以实施例2、3、4为对照说明本发明的效果。

实施例1：

野外采摘野外采摘生长健壮、无虫害、未完全开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄部分，用解剖刀轻轻去除菌盖中部表皮，从菌盖中部取十字，将子实体一分为四，取菌柄与菌盖交接处的内部无菌组织块，切成0.25～0.5cm²大小不等的小块；

将切取的小组织块，轻轻嵌入18mm×180mm的试管斜面诱导培养基表面，所述培养基成分为：马铃薯100g/L、玉米粒25g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15～20g/L、自来水和马尾松松针汁液1L、自然pH值；所述培养基制备方法为：采集马尾松新鲜松针50g加水约500mL加热沸水后煮30min，过滤弃马尾松松针，得松针汁液约250mL，冷却，备用；洗净玉米粒25g加水1000mL，加热煮沸后继续煮沸30min，即可加入新鲜洗净去皮马铃薯小块100g，继续煮沸30min，过滤，得玉米马铃薯水煮液，约450mL；马尾松松针汁液与玉米马铃薯汁液混合，加热，再加入琼脂15～20g，继续加热，待琼脂溶解后，加入葡萄糖20g，溶解后冷却并补足水分至1L，分装试管，加塞、包扎，121℃灭菌20min左右后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用；

将接种小组织块的试管共100支，放置在温度为20～26℃下暗培养7天，100支试管组织培养块上均长出白色绒毛状菌丝，长度为2～10mm，即为母种；

母种进一步提纯与转管培养的方法：在菌丝萌发后，挑选色泽纯、健壮、长势正常和无间断的菌线，在无菌室超净工作台上连同培养基钩取菌丝，接入另备的试管培养基上。在20～25℃的恒温条件下，培养7～10天，待菌丝长满试管后，再从中择优取用，即为“母代”母种；母种的转管培养将一支长满菌丝的试管在无菌操作下，分别转接到多只试管中培养，一般每支母种可扩接20～50支，也可以再次转管扩接，但转管次数不得超过4次，这些转管扩接后，即为供生产上使用的子代母种。

实施例2：

野外采摘野外采摘生长健壮、无虫害、未完全开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄部分，用解剖刀轻轻去除菌盖中部表皮，从菌盖中部取十字，将子实体一分为四，取菌柄与菌盖交接处的内部无菌组织块，切成0.25～0.5cm²大小不等的小块；

将切取的小组织块，轻轻嵌入18mm×180mm的试管斜面诱导培养基表面，所述培养基成分为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15～20g/L、自来水1L、自然pH值；所述培养基制备方法为：新鲜马铃薯洗净去皮，称取200g切成小块，加水煮烂(煮沸20～30min，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，加热，再据实际需要加15～20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖20g，搅拌均匀，冷却；后补足水分至1L，分装试管，加塞、包扎，121℃灭菌20min左右后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用；

将接种小组织块的试管100支，放置在温度为20～25℃下暗培养100天，组织培养块上无长出白色绒毛状菌丝，全部转变为黑褐色。

实施例3：

野外采摘野外采摘生长健壮、无虫害、未完全开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄部分，用解剖刀轻轻去除菌盖中部表皮，从菌盖中部取十字，将子实体一分为四，取菌柄与菌盖交接处的内部无菌组织块，切成0.25～0.5cm²大小不等的小块；

将切取的小组织块，轻轻嵌入18mm×180mm的试管斜面诱导培养基表面，所述培养基成分为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、麦芽汁(12波美度)120mL/L、琼脂15～20g/L、自来水1L、pH5.0左右；所述培养基制备方法为：新鲜马铃薯洗净去皮，称取200g切成小块，加水煮烂(煮沸20～30min，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，加热，再据实际需要加15～20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖20g和麦芽汁(12波美度)120mL，搅拌均匀，冷却；后补足水分至1L，pH为5.0左右，分装试管，加塞、包扎，121℃灭菌20min左右后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用；

将接种小组织块的试管100支，放置在温度为20～26℃下暗培养100天，组织培养块上无长出白色绒毛状菌丝，全部转变为黑褐色。

实施例4：

野外采摘野外采摘生长健壮、无虫害、未完全开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄部分，用解剖刀轻轻去除菌盖中部表皮，从菌盖中部取十字，将子实体一分为四，取菌柄与菌盖交接处的内部无菌组织块，切成0.25～0.5cm²大小不等的小块；

将切取的小组织块，轻轻嵌入18mm×180mm的试管斜面诱导培养基表面，所述培养基成分为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、MgSO₄1g/L、CaCl₂1g/L、KH₂PO₄0.5g/L、(NH₄)₂HPO₄0.5g/L、KNO₃0.5g/L、麦芽汁(12波美度)120mL/L、维生素B₁100ug/L、琼脂15～20g/L、自来水1L、pH5.0左右；所述培养基制备方法为：新鲜马铃薯洗净去皮，称取200g切成小块，加水煮烂(煮沸20～30min，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，加热，再据实际需要加15～20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖20g和麦芽汁(12波美度)120mL，搅拌均匀，冷却；加入MgSO₄1g、CaCl₂1g、KH₂PO₄0.5g、(NH₄)₂HPO₄0.5g、KNO₃0.5g、维生素B₁100ug，搅拌均匀，后补足水分至1L，pH为5.0左右，分装试管，加塞、包扎，121℃灭菌20min左右后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用；

将接种小组织块的试管共100支，放置在温度为20～26℃下暗培养12～15天，其中2支试管组织培养块上长出短白色绒毛状菌丝，长约0.5mm，继续培养至100天，这2支试管组织培养块上长出的短白色绒毛状菌丝不生长；其它试管组织培养块不长出短白色绒毛状菌丝，组织培养块转变为黑褐色。

Claims (8)

1.一种中华鹅膏菌培养基，其特征在于其组成为：马铃薯100g/L、玉米粒20～30g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15～20g/L、马尾松松针汁液150～300mL/L，自然pH值

所述一种中华鹅膏菌培养基由以下方法制备：

1)将新鲜马尾松松针25～75g加水250～500mL，加热煮沸20～40min后，冷却，过滤弃马尾松松针，得马尾松松针汁液；

2)将玉米粒20～30g加水1000mL，加热煮沸20～40min后，即加入去皮马铃薯小块100g，继续煮沸30min，过滤，得玉米马铃薯汁液；

3)将马尾松松针汁液与玉米马铃薯汁液混合，加热，再加入琼脂15～20g，继续加热，待琼脂溶解后，加入葡萄糖20g，溶解后冷却并补足水分至1L，均匀混合，分装试管，加塞，包扎，灭菌后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后即得中华鹅膏菌培养基。

2.如权利要求1所述一种中华鹅膏菌培养基，其特征在于在步骤1)和2)中，所述过滤采用8层纱布过滤。

3.如权利要求1所述一种中华鹅膏菌培养基，其特征在于在步骤3)中，所述灭菌的条件为121℃下灭菌20min。

4.如权利要求1所述一种中华鹅膏菌培养基在诱导中华鹅膏菌母种中应用。

5.如权利要求4所述应用，其特征在于诱导中华鹅膏菌母种的方法如下：

切取野生采摘的子实体小组织块，再嵌入试管斜面中华鹅膏菌培养基表面，在温度为20～26℃下暗培养7～15天，组织培养块上长出白色绒毛状菌丝，即为中华鹅膏菌母种。

6.如权利要求5所述应用，其特征在于所述切取野生采摘的子实体小组织块的方法为：野外采摘生长健壮、无虫害、未完全开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄部分，用解剖刀去除菌盖中部表皮，从菌盖中部取十字，将子实体一分为四，取菌柄与菌盖交接处的内部无菌组织块，切成0.25～0.5cm²的小块。

7.如权利要求5所述应用，其特征在于所述中华鹅膏菌母种的提纯方法如下：

在菌丝萌发后，挑选色泽纯、健壮、长势正常和无间断的菌线，在无菌室超净工作台上连同中华鹅膏菌培养基钩取菌丝，接入另备的中华鹅膏菌培养基上，在20～26℃的恒温条件下，培养7～15天，待菌丝长满试管后，再从中择优取用，即为“母代”母种。

8.如权利要求5所述应用，其特征在于所述中华鹅膏菌母种的转管培养的方法如下：

将一支长满菌丝的试管在无菌操作下，分别转接到多只试管中培养，一般每支母种扩接20～50支；或再次转管扩接，所述转管扩接的次数不超过4次，转管扩接后，即为供生产上使用的子代母种。