CN114231419B - 一种生产周期短的高羊肚菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于食用菌领域，具体公开了一种高羊肚菌(Morchella elata)菌株黔羊肚菌5号，其保藏编号为CCTCC NO:M20211211。本发明还公开了该菌株在食品、保健品或饮料等方面的用途。黔羊肚菌5号的子囊果深褐色，菇形好，商品价值高；其次，该菌株亩产量可达147.1kg，比高羊肚菌川羊肚菌2号的亩产量高17.1kg，经济效益高；此外，该菌株栽培周期短，比川羊肚菌2号栽培周期缩短10～15天。本发明还公开了该菌株的分子标记，该分子标记对黔羊肚菌5号特异性强，检测结果准确、可靠；检测方法简单，速度快，适于在黔羊肚菌5号的真实性或侵权鉴定中进行现场和实时检测。

Description

一种生产周期短的高羊肚菌及其应用

技术领域

本发明属于食用菌领域，具体涉及一种高羊肚菌菌株，还涉及该高羊肚菌菌株的用途。

背景技术

羊肚菌(Morchella)属于羊肚菌科羊肚菌属，因其菌盖酷似羊肚而得名，是一种珍贵的药食兼用菌。羊肚菌多生长在阔叶林或针阔混交林的腐殖质层上，在世界各地均有分布；我国28个省、市、自治区具有羊肚菌分布。羊肚菌营养价值丰富，蛋白质含量高，富含人体必需氨基酸和维生素、微量元素与碳水化合物，脂肪酸种类也十分丰富；其味道鲜美，口味独特。羊肚菌子实体还可以入药，据《中华本草》记载，羊肚菌性平，味甘寒，无毒；有益肠胃、助消化、化痰理气、补肾、补脑提神等功效；羊肚菌含抑制肿瘤的多糖，抗菌、抗病毒等活性成分，具有增强机体免疫力、抗疲劳、抗病毒、抑制肿瘤等作用，在欧美等国家一直作为人体营养的高级补品。

高羊肚菌(Morchella elata)为羊肚菌科羊肚菌属中的一个种。目前高羊肚菌栽培中主要存在菌种少、栽培周期长、产量低等问题，难以满足人们对高水平生活的需要。

我国从南到北的广大原始森林中具有丰富的野生食用菌资源，其中包括野生羊肚菌资源。对野生的羊肚菌资源进行开发驯化，不仅可以丰富人们的餐桌，满足人们高水平生活的需要；同时利用其药食兼用的特性，还可以开发出附加值更高的食品、饮料或保健品，在提高人们养生和健康水平的同时，增加菇农收入和出口创汇。

发明内容

本发明目的在于提供一种生产周期短的高羊肚菌菌株。

本发明另一目的在于提供上述高羊肚菌菌株的用途。

本发明通过如下技术方案实现：

本发明一种高羊肚菌(Morchella elata)菌株黔羊肚菌5号，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO:M20211211，保藏日期为2021年9月24日。

上述菌株黔羊肚菌5号在食品或保健品中的应用。

一种食品或保健品，所述的食品或保健品中含有上述菌株黔羊肚菌5号或黔羊肚菌5号的提取物。

上述菌株黔羊肚菌5号在饮料中的应用。

一种饮料，所述的饮料中含有上述菌株黔羊肚菌5号或黔羊肚菌5号的提取物。

上述菌株黔羊肚菌5号在制备提高人体免疫力药物上的应用。

一种高羊肚菌的基因工程菌，所述的基因工程菌的出发菌株为上述菌株黔羊肚菌5号。

用于鉴定上述高羊肚菌菌株黔羊肚菌5号的分子标记，所述的分子标记是指一个长度为743bp的DNA分子片段；所述的DNA分子片段的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

上述分子标记，所述的分子标记的PCR扩增引物由ITS1和ITS4组成；所述的引物序列如下：

ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；

ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

上述分子标记在黔羊肚菌5号真实性或侵权鉴定上的应用。

上述高羊肚菌菌株黔羊肚菌5号的栽培方法，包括如下步骤：

(1)母种培养：用灭菌冷却后的接种钩将5mm×5mm的黔羊肚菌5号菌种块接种于母种培养基平板中央，在温度22℃、空气相对湿度为60～75％、避光条件下培养8天，菌丝长满平板，得黔羊肚菌5号母种；

(2)原种培养：按照1:30的质量比取步骤(1)中所得的黔羊肚菌5号母种，然后接种于原种培养基上培养，在温度为20℃、空气相对湿度为60～75％，避光条件下培养25～30天，菌丝长满菌瓶，得黔羊肚菌5号原种；

(3)栽培种培养：按照1:30的质量比挖取步骤(2)中所得黔羊肚菌5号原种，接种于栽培培养基上培养，在20℃、空气相对湿度60～75％，避光条件下培养25～30天，菌丝长满菌瓶，得黔羊肚菌5号栽培种；

(4)开畦播种与覆膜：选择pH6～6.5、且土质较细的耕地，清除杂草后翻耕土壤，播种前开畦，畦面宽80～100cm，畦之间留50cm的走道，土壤含水量40～45％，将步骤(3)得到的黔羊肚菌5号栽培种平均每袋兑入拌种剂30mL搅拌均匀，将菌种掰碎成小颗粒后均匀撒播到畦面，每亩耕地播种500袋栽培种，播种后立刻均匀覆盖一层薄土，覆土后盖上黑色聚丙烯塑料薄膜；

(5)菌丝培养与摆放营养袋：羊肚菌播种后，棚内气温控制在15～20℃，空气相对湿度60～70％，土壤含水量40～45％，光照强度50～100lux，8～10天菌丝长满畦面形成白色“菌霜”，掀开黑色聚丙烯膜，开始放置营养袋，每袋营养袋打40～60个小孔，打孔面紧贴畦面土壤，每亩地均匀摆放1800袋营养袋，营养袋摆放完成后重新覆上黑色聚丙烯膜；营养袋在大田摆放40～45天后撤除，并撤除黑色聚丙烯膜；

(6)原基分化：在步骤(5)撤除营养袋后，喷洒水使土壤含水量达到45～55％，子实体生长阶段控制棚内温度10～20℃，空气相对湿度75～85％，光照强度200～300lux，棚内自然通风，诱导原基形成，喷水后约7天形成大量原基，形成原基后约7～10天形成1～2cm的幼菇；

(7)出菇管理和采收：棚内气温控制在10～20℃，空气相对湿度70～80％，土壤含水量40～45％，光照强度500～1000lux，二氧化碳浓度500-700ppm，高温时利用喷雾、侧窗通风等措施降温；从原基发生到子实体成熟需25～30天；当子实体不再增大，菌盖脊与凹坑分明，子囊果部分已基本展开，即为成熟，应技术采收。

上述栽培方法步骤(1)中所述的母种培养基的组成成分及其比例为：去皮马铃薯200g取汁，葡萄糖20g，琼脂20g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，混匀后用RO水定容至1000mL。

所述的母种培养基的制备方法：将马铃薯200g去皮切成1.5cm左右方块，放入800mLRO水中煮沸20min，3层纱布过滤取浸提液，再加入葡萄糖20g，琼脂20g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，混匀后用纯净水定容至1000mL，121℃灭菌30min；倒入直径9cm平板，备用。

上述栽培方法步骤(2)中所述原种培养基和步骤(3)中所述栽培种培养基的组成成分及其重量百分比比例为：小麦80％，腐殖土13％，稻壳5％，石膏1％，碳酸钙1％，培养基含水量为60～65％。

所述步骤(2)中原种培养基和步骤(3)中栽培种培养基的制备方法：按重量百分比取：小麦80％，腐殖土13％，稻壳5％，石膏1％，碳酸钙1％，混合均匀，然后按照比例加水，搅拌均匀，装入聚丙烯塑料袋(16cm×35cm×0.005cm)后聚丙烯绳扎口，121℃灭菌2小时备用。

上述栽培方法步骤(4)中所述的拌种剂的组成成分及其重量比为：硫酸镁1g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾0.2g，硫酸锌0.01g，硫酸亚铁0.01g，葡萄糖1g,水1000ml。

所述的拌种剂的制备方法，包括按照比例向水中加入各组分，混合均匀即可。

上述栽培方法步骤(5)中所述的营养袋的组成成分及其重量百分比比例为：小麦90％，谷壳9％，生石灰1％，含水量60～65％。

上述栽培方法步骤(5)中所述营养袋的制备方法：按照重量百分比比例将小麦90％，谷壳9％，生石灰1％混合均匀，然后按照比例加水，搅拌均匀。栽培袋采用聚丙烯塑料袋(12cm×24cm×0.005cm)规格，将混匀的营养料装入袋中，聚丙烯绳扎口，121℃灭菌1小时，再冷却至常温；备用。

本发明具有的优点和有益技术效果：(1)本发明黔羊肚菌5号的子实体菌盖深褐色，菇形好，商品价值高，为消费者提供了一种新的羊肚菌。(2)本发明黔羊肚菌5号产量高。本发明黔羊肚菌5号农业式栽培亩均产量为147.1kg，而现国内唯一国家认定的高羊肚菌“川羊肚菌2号”(川审菌2013008)的每亩产量仅为130kg，黔羊肚菌5号比“川羊肚菌2号”每亩产量高17.1kg。(3)本发明黔羊肚菌5号栽培周期短，而“川羊肚菌2号”的生育期为120天，而本发明黔羊肚菌5号从播种到出菇采收的周期为105～110天，比“川羊肚菌2号”缩短10～15天。(4)因其药食兼用特性，本发明黔羊肚菌5号除了直接烹饪食用外，作为高级补品，还可开发出附加值更高的食品、饮料和保健品等，增加菇农收入和出口创汇，因而具有广泛的应用前景。(5)本发明分子标记对菌株黔羊肚菌5号特异性强，检测结果准确、可靠；检测方法简单，速度快，适于在黔羊肚菌5号的真实性或侵权鉴定中进行现场和实时检测。

生物保藏：本发明高羊肚菌(Morchella elata)菌株黔羊肚菌5号是本发明人在贵州省黔西市甘棠镇采集，并经筛选、培育而成；该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为：地址中国武汉武汉大学；保藏编号为CCTCC NO:M20211211，保藏日期为2021年9月24日。

附图说明:

图1.本发明菌株黔羊肚菌5号的子实体照片。

图2.本发明菌株黔羊肚菌5号的系统发育树图。

图3.采用RAPD引物S12扩增的不同高羊肚菌菌株的RAPD对比鉴定图谱；其中M为DNA分子量标准；1为黔羊肚菌5号；2为MeHL；3为MeBL。

具体实施方式

以下通过实例对本发明作进一步说明，但是对本发明不构成任何限制。

实施例1本发明菌株黔羊肚菌5号的采集、分离驯化过程

2018年4月，本发明人在贵州省黔西市甘棠镇地区发现并采集一株野生羊肚菌子实体。将所采集的野生羊肚菌子实体组织分离，得到菌丝(菌种)；将组织分离后的菌种进行栽培出菇试验，再对朵型良好的子实体进行组织分离，接种于PDA培养基上进行培养，筛选菌丝生长速度快，长势均匀的菌株，继续栽培驯化，经过数代培养，筛选出一个菌丝生长速度快、出菇整齐、产量高、出菇周期短的羊肚菌菌株，命名为：黔羊肚菌5号。

实施例2本发明菌株黔羊肚菌5号的分类鉴定试验

(1)黔羊肚菌5号的形态学鉴定：

子囊果(子实体菌盖)深褐色，子实体高7～15cm，子囊果长3～8cm，粗2～4cm，阔圆锥形，顶部钝，下部边缘与菌柄链接，子囊果纵棱发达，横棱稀疏，棱上遍布短绒毛，横纵棱纹交叉形成坑，坑底色泽浅于棱纹。菌柄长2～6cm，粗2.5～4cm，象牙白色，圆柱形，中空。子囊呈柱状，每个子囊含八个孢子，单纵排列。根据《云南产羊肚菌的分类学与生态学研究》(李莹霞，云南农业大学，2015)中第39、45页有关高羊肚菌的相应形态特征特征描述及照片，黔羊肚菌5号与高羊肚菌的形态特征一致，说明本发明黔羊肚菌5号在分类上属于高羊肚菌(Morchella elata)。

(2)黔羊肚菌5号的分子生物学鉴定

采用新型植物基因组DNA提取试剂盒CW0531(北京康为世纪公司)提取黔羊肚菌5号菌株的基因组DNA；并以所提取的黔羊肚菌5号菌株的基因组DNA为底物，以通用引物ITS1和ITS4为引物进行PCR扩增。所述的通用引物序列如下：

ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；

ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

其中ITS-PCR反应体系为：总体积20μL：20-50ng/μL的DNA模板1μL，10×Buffer(with Mg²⁺)2μL，2.5mM dNTP 0.5μL，5U/μl DNA聚合酶0.2μL，0.2μM引物各0.5μL，加双蒸水至20μL。ITS-PCR反应条件为：预变性94℃5min；94℃1min，60℃1min，72℃75s，30个循环；72℃延伸10min。将PCR扩增产物进行凝胶电泳，结果获得长度为743bp的DNA分子片段。将该DNA分子片段送交上海进行测序，然后将所得序列(见SEQ ID No：1)在GeneBank中进行BLAST对比，并构建系统发育树图。结果本发明菌株黔羊肚菌5号的ITS序列与高羊肚菌(Morchella elata)的ITS序列相似性最高，其相似度高达99.86％，说明黔羊肚菌5号在分类上属于羊肚菌属高羊肚菌种(Morchella elata)(见图2)。此外，黔羊肚菌5号与所有其他羊肚菌菌株的ITS序列不同，说明黔羊肚菌5号是一种新的高羊肚菌菌株。

实施例3本发明菌株黔羊肚菌5号与其他高羊肚菌菌株的RAPD图谱对比鉴定试验

用新型植物基因组DNA提取试剂盒CW0531(北京康为世纪公司的)分别提取黔羊肚菌5号、高羊肚菌菌株MeHL(贵州省土壤肥料研究所选育)、高羊肚菌菌株MeBL(贵州省土壤肥料研究所选育)3个菌株的基因组DNA，选取20条RAPD引物(见表1)进行PCR扩增。

表1 RAPD随机引物序列

RAPD-PCR扩增反应体系为：总体积20μL：20-50ng/μL的DNA模板1μL，10×Buffer(with Mg2+)2μL，2.5mM dNTP 0.5μL，5U/μl EasyTaq酶0.2μL，0.2μM引物1μL，加双蒸水至20μL。RAPD-PCR反应条件为：预变性95℃5min；94℃45s，36℃1min，72℃2min，35个循环；72℃延伸10min。

结果(见图3)从以S12为引物扩增所得的RAPD电泳图谱可以看出，本发明菌株黔羊肚菌5号相对于高羊肚菌菌株MeHL、MeBL均存在具有明显差异的特异性条带，说明黔羊肚菌5号与其他高羊肚菌菌株MeHL和MeBL不同，黔羊肚菌5号为一种新的高羊肚菌(Morchellaelata)菌株。

实施例4本发明菌株黔羊肚菌5号的栽培试验

按照如下步骤进行：

(1)母种培养：用灭菌冷却后的接种钩将5mm×5mm的黔羊肚菌5号菌种(本菌种已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M20211211)接种于母种培养基平板中央，在温度为22℃、空气相对湿度为60～75％、避光条件下培养8天，菌丝长满平板，此时平板形成大量菌核，得黔羊肚菌5号母种；所述的母种培养基按照如下方法制备：将马铃薯200g去皮切成1.5cm左右方块，放入800mLRO水中煮沸20min，3层纱布过滤取浸提液，再加入葡萄糖20g，琼脂20g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，混匀后用纯净水定容至1000mL，121℃灭菌30min；倒入直径9cm平板，备用。

(2)原种培养：用灭菌冷却后的菌种铲按照1:30的质量比挖取步骤(1)中所得的黔羊肚菌5号母种，然后接种于原种培养基上，在温度为20℃、空气相对湿度为60～75％，避光条件下培养25～30天，菌丝长满菌瓶，此时菌瓶形成大量菌核，得黔羊肚菌5号原种；所述原种培养基的组成成分及其重量百分比为：小麦80％，腐殖土13％，稻壳5％，石膏1％，碳酸钙1％，培养基含水量为60～65％。按照比例将各组分混合，搅拌均匀，并按照比例加入水，混合搅拌均匀，装入聚丙烯塑料袋(16cm×35cm×0.005cm)后聚丙烯绳扎口，121℃灭菌2小时备用。

(3)栽培种培养：用灭菌冷却后的菌种铲按照1:30的质量比挖取步骤(2)中所得黔羊肚菌5号原种接种于栽培种培养基上培养，在20℃、空气相对湿度60～75％，避光条件下培养25～30天，菌丝长满菌瓶，此时菌瓶形成大量菌核，得黔羊肚菌5号栽培种。所述栽培种培养基的组成成分及其重量百分比与步骤(2)的原种培养基相同，制备方法亦与步骤(2)相同。

(4)开畦播种与覆膜：选择pH6～6.5、且土质较细的棚内耕地，清除杂草后翻耕土壤，播种前开畦，畦面宽80～100cm，畦之间留50cm的走道，土壤含水量40～45％，将步骤(3)得到的黔羊肚菌5号栽培种平均每袋兑入拌种剂30mL搅拌均匀，将菌种掰碎成小颗粒后均匀撒播到畦面，每亩耕地播种500袋栽培种，播种后立刻均匀覆盖一层薄土，覆土后盖上黑色聚丙烯膜。所述的拌种剂的组成成分及其重量比为：硫酸镁1g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾0.2g，硫酸锌0.01g，硫酸亚铁0.01g，葡萄糖1g,水1000ml。所述的拌种剂的制备方法，包括按照比例向水中加入各组分，混合均匀即可。

(5)菌丝培养与摆放营养袋：羊肚菌播种后，棚内气温控制在15～20℃，空气相对湿度60～70％，土壤含水量40～45％，光照强度50～100lux，8～10天，菌丝长满畦面形成白色“菌霜”，掀开黑色聚丙烯膜；放置营养袋，每个营养袋打40～60个小孔，打孔面紧贴畦面土壤，每亩地均匀摆放营养袋1800个，营养袋摆放完成后重新覆上黑色聚丙烯膜。营养袋在大田摆放40～45天，然后撤除营养袋，并撤除黑色聚丙烯膜；所述营养袋的制备方法：按照重量百分比比例将小麦90％，谷壳9％，生石灰1％混合均匀，含水量60～65％，搅拌均匀，得营养料；将混匀的营养料装入聚丙烯塑料袋(规格12cm×24cm×0.005cm)中，聚丙烯绳扎口，得营养袋；121℃灭菌1小时，再冷却至常温；备用。

(6)原基分化：在步骤(5)撤除营养袋后，喷洒水使土壤含水量达到45～55％，在子实体生长阶段，控制棚内温度10～20℃，空气相对湿度75～85％，光照强度200～300lux，棚内自然通风，诱导原基形成，喷水后7天形成大量原基，形成原基后7～10天形成1～2cm的幼菇。

(7)出菇管理和采收：控制棚内气温在10～20℃，空气相对湿度70～80％，土壤含水量40～45％，光照强度500～1000lux，二氧化碳浓度500-700ppm，高温时利用喷雾、侧窗通风等措施降温。从原基发生到子实体成熟需25～30天。当子实体不再增大，菌盖脊与凹坑分明，子囊果部分已基本展开，即为成熟，及时采收，使用干净的刀片从子实体基部切割，完成采收。

结果本发明黔羊肚菌5号的子实体(见图1)菌盖深褐色，菇形好，商品价值高；其次，本发明黔羊肚菌5号农业式栽培亩均产量为147.1kg，而现有唯一国家认定的高羊肚菌“川羊肚菌2号”(川审菌2013008)亩产仅为130kg，本发明菌株黔羊肚菌5号比川羊肚菌2号每亩增产17.1kg，即产量显著高于川羊肚菌2号，其经济效益显著高于川羊肚菌2号。此外，本发明黔羊肚菌5号栽培周期短，黔羊肚菌5号从播种到出菇采收的周期为105～110天，而川羊肚菌2号从播种到出菇采收的周期为120天，黔羊肚菌5号的栽培周期比“川羊肚菌2号”缩短了10～15天。

序列表

<110> 贵州省土壤肥料研究所（贵州省生态农业工程技术研究中心）（贵州省农业资源与环境研究所）

<120> 一种生产周期短的高羊肚菌及其应用

<141> 2021-11-11

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 743

<212> DNA

<213> Morchella elata

<400> 1

gtaatgatcc ttctttctgt agggtgaact gcggaaggat cattaccaag aaccatacag 60

aaaagggagg catgagggga ccgacagggc tagtagctta tacgttgttg aacgtcctgt 120

atggacccgg agcctccccc atctaaaccc tctgcgtacc tgtcccttct tgcttccccc 180

ggcgtctcgt cggggggagg taacaaccaa aactctctgt gaatcaaaca gccgtcagaa 240

ctataaaaca aacaaaaagt taaaactttc aacaacggat ctcttggttc ccacatcgat 300

gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat 360

ctttgaacgc acattgcgcc ccctggtatt ccggggggca tgcctgttcg agcgtcataa 420

aaacctcctc ccccttcggg ttttgttact atcgttgggg ggttttggcc taatgggata 480

gcgattggcg attcgtttcc caatgtccta aatagacgta gacccgcctc cagatgcgac 540

agcaccgagg ccatcaaccg tggagttatg ggatataata ggcttgcagt aaaatgctca 600

cctctctcca cacgccgatg gcacgacagt tgcagttgcg ggcgtaaatt ggagcccttt 660

tcaggaccct cgtggcctag catccaccat acataatttg agctcggatc aggtagggat 720

acccgctgaa cttaagcata tca 743

Claims (6)

1.一种高羊肚菌（Morchella elata）菌株黔羊肚菌5号，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M20211211。

2.权利要求1所述的菌株黔羊肚菌5号在食品或保健品中的应用。

3.一种食品或保健品，其特征在于，所述的食品或保健品中含有权利要求1所述的菌株黔羊肚菌5号或黔羊肚菌5号的提取物。

4.权利要求1所述的菌株黔羊肚菌5号在饮料中的应用。

5.一种饮料，其特征在于，所述的饮料中含有权利要求1所述的菌株黔羊肚菌5号或黔羊肚菌5号的提取物。

6.权利要求1所述的菌株黔羊肚菌5号在制备提高人体免疫力药物上的应用。

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