CN103756930A - 一株花生根际生防菌及其制备方法和应用 - Google Patents

一株花生根际生防菌及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN103756930A
CN103756930A CN201310643869.3A CN201310643869A CN103756930A CN 103756930 A CN103756930 A CN 103756930A CN 201310643869 A CN201310643869 A CN 201310643869A CN 103756930 A CN103756930 A CN 103756930A
Authority
CN
China
Prior art keywords
peanut
strain
fungi
bacterium
bacterial strain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201310643869.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103756930B (zh
Inventor
迟玉成
赵显民
许曼琳
许婷婷
吴菊香
王磊
谢宏峰
焦坤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao Xiangrun Biotechnology Co., Ltd.
Original Assignee
QINGDAO RUNDIFENG TECHNOLOGY CO LTD
Shandong Peanut Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by QINGDAO RUNDIFENG TECHNOLOGY CO LTD, Shandong Peanut Research Institute filed Critical QINGDAO RUNDIFENG TECHNOLOGY CO LTD
Priority to CN201310643869.3A priority Critical patent/CN103756930B/zh
Publication of CN103756930A publication Critical patent/CN103756930A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103756930B publication Critical patent/CN103756930B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术领域,具体涉及一株花生根际生防菌及其制备方法和应用。本发明公开的花生根际生防菌为活性菌株LX12,通过16SrDNA鉴定菌株LX12为侧孢短芽孢杆菌,该菌株是从花生根际土壤中筛选出对真菌有拮抗性的细菌,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC 7420。该菌株对病原菌有明显的拮抗作用,对峙试验显示,本发明菌剂对花生根腐病、白绢病、疮痂病和叶斑病菌等花生病害有显著的抑制作用,盆栽和田间试验显示对花生根腐病、白绢病、疮痂病和叶斑病菌均有明显的防治效果。

Description

一株花生根际生防菌及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一株花生根际生防菌及其制备方法和应用。 
背景技术
在对生防细菌的研究应用中,芽孢杆菌和假单胞菌是研究最为深入的两种生防细菌。芽孢杆菌(Bacillaceae)是细菌的一科,能形成芽孢(内生孢子)的杆菌或球菌。包括芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属、梭菌属、脱硫肠状菌属和芽孢八叠球菌属等。它们对外界有害因子抵抗力强,分布广,存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。芽孢是休眠体,绝大多数是一个菌体仅形成一个芽孢芽孢位于菌体内,由核心、皮层、芽孢壳和外壁组成,为革兰氏阳性菌。核心是芽孢的原生质体,内含DNA、RNA、可能与DNA相联系的特异芽孢蛋白质以及合成蛋白质和产生能量的系统。此外,还有大量的吡啶二羧酸钙布满整个芽孢。由于芽孢具有厚而含水量低的多层结构,所以折光性强、对染料不易着色,芽孢对热、干燥、辐射、化学消毒剂和其他理化因素有较强的抵抗力,这可能与芽孢独具的高含量吡啶二羧酸有关。 
芽孢杆菌作为微生物种群在自然界土壤中占有相对优势,许多性状优良的天然分离菌株已成功地应用于植物病害的生物防治。对于芽孢杆菌抑菌产物的探究,发现其拮抗物质主要包括主要为酶类的抗菌蛋白及次生代谢产生的抗菌素,另外还包含一部分挥发性的抗菌物质。 
芽孢具有耐热抗逆性是芽孢杆菌这一种群与其他种群进行区别的最明显的特征。这有利于芽孢杆菌作为生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中存活、定殖与繁殖。 
作为芽孢杆菌属的侧孢短芽孢杆菌,其主要有以下特点: 
第一,能改善土壤微生态环境,促进团粒结构形成,改良土壤质地,增大革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌比率。革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的比率增加是土壤质量提高的标志。有效菌的大量繁殖产生粘性分泌物,增加土壤有机质,促进土壤团粒结构的形成,改善土壤的通透性、保温性、保肥性。 
第二,能刺激作物根系发育、促进作物生长,改善作物品质。在土壤中施入侧孢短芽孢杆菌,通过其生命活动分泌各种胞外酶如几丁质酶、蛋白酶、淀粉酶、碳解酶、半纤维素酶、脂肪酶等以及天然植物激素(如玉米素、生长素、赤霉素和异戊烯基腺嘌呤等),促进作物对养分的吸收,把土壤中丰富的有机质分解为植物可以利用的营养物质,多种植物激素,刺激作物生长和根系发育,从而增产增收。促进叶片生长,增大光合作用的面积和强度,从而增加光合产物合成(即碳合成)促进根系生长,扩大根系吸收面积,增强根系活力,保证合成产物所需原料(N、P、K、Mg)。 
第三,减轻病虫害、降低农药残留。当大量的有益微生物被投放到土壤中,它们迅速增殖形成优势群体,并在植物根际占据一定的空间,消耗可被病原菌利用的营养物质,大大削弱了病原菌的生长、繁殖,使病原菌失去竞争力,这是有益菌对病原菌的“竞争抑制作用”。侧孢短芽孢杆菌在生命活动过程中,分 泌蚀几丁质酶、真菌,线虫卵壁中含有相当数量的几丁质,蚀几丁质酶分解了壁中的几丁质,使其原生质体流出失活,从而起到杀死病虫的作用。增强供应的Ca、Si、K,使植物有关组织细胞壁增厚,纤维化、木质化程度提高,并在表皮层外形成角质双硅层,形成一道阻止病菌侵袭的屏障。分泌的蚀几丁质酶能裂解线虫卵壳和真菌细胞壁,长期使用对线虫、真菌病害防治效果与化学农药基本相当,防病、抗病、抗重茬效果显著。 
第四,增强光合作用,提高化肥利用率,降低硝酸盐含量。施用侧孢短芽孢杆菌的作物叶绿素含量普遍高于对照,提高光合作用能力,可以充足供给作物蛋白质合成的碳架,促使吸收到植物体的氮素很快合成蛋白质,促进氮的转化,少施化肥,提高花费利用率。氮素的迅速转化导致植物体内硝酸盐含量减少。 
第五,固化若干重金属,降低植物体内重金属含量。有效菌的生命活动改变环境条件,其他元素状态、有机质等,活化、固化了若干元素。 
作为生防菌的主要生防机制,生防菌所分泌的抗生素起到了最为重要的作用,同时竞争作用和溶菌作用等也在发挥着各自的效果。然而生防菌在植物病害防治中也存在诸多问题,主要问题是在田间条件下生防菌达不到实验室实验效果,在田间具体施用时生防菌常常受到温度、湿度、PH及农药化肥的影响,具体表现在定殖力差、抗药性差、稳定性差。 
侧孢短芽孢杆菌属于芽孢杆菌属,革兰氏染色阳性,可变为阴性。彭清忠等在实验中测定此类细菌革兰氏染色结果随着生长发育周期的变化而变化:在延迟期和静止期时呈革兰氏阴性,对数生长期时呈阳性。实验中只取了对数生长期的菌种进行了测定,所以对革兰氏染色的实验结果不完全。芽孢杆菌具有繁殖快速、生命力强、安全无毒等特点;侧孢短芽孢杆菌能分泌合成多种有机酸、酶、生理活性物质等。 
关于侧孢短芽孢杆菌对植物真菌的抑制机制研究在我国报道较少。赵秋敏等在2006年研究了侧孢芽孢杆菌对小麦赤霉菌(Fusarium graminearum)、棉花立枯菌(Rhizoctonia solani)、苹果轮纹菌(Physalospora piricola)、黑曲霉(Aspergillium niger)、黑根霉(Rhizopus stolonifer)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)等病原真菌的抑制作用进行了研究,初步确定了抑菌物质为几丁质酶。 
近年来,生防细菌的应用日益受到研究人员的重视,其抑菌效果也随着研究的进展得到了提高,在自然界中筛选获得拮抗生防菌,进而通过生物技术的方法对其进行修饰或通过条件的改变使其抑菌效果增强,探究其使用方法,一般都是通过发酵的方法制成生物菌剂,发酵既可以生产生防菌,也可以通过发酵条件的改变生产抑菌物质,使科研成果运用到实际生产中。 
发明内容
本发明解决的问题是利用实验田花生根际土壤资源开发一种可用于植物病害防治的广谱、高效、可产业化生产的活性菌株LX12,提供活性菌株LX12以及该菌株的培养、分离、鉴定、抑制真菌能力的测定以及在防治花生根腐病、白绢病、疮痂病和褐斑病中的应用。 
本发明参据的生物材料为LX12菌株,分类命名为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus),已于2013年04月07日经检测存活,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所。 
具体地本发明的技术方案如下: 
一株花生根际生防菌,其特征在于,该菌株为活性菌株LX12,通过16SrDNA鉴定菌株LX12为侧孢短芽孢杆菌,该菌株是从花生根际土壤中筛选出对真菌有拮抗性的细菌,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC7420。 
本发明的活性菌株LX12经菌落和形态的显微观察、染色反应、常规生理生化特性实验以及16SrDNA序列分析,鉴定为侧孢短芽孢杆菌,具有以下特征: 
(1)形态观察显示:菌株LX12呈白色,边缘整齐,有凸起,表面光滑湿润,不透明。 
(2)生理生化特征测定:菌株LX12对数生长期时革兰氏染色为阳性,能以柠檬酸盐作为碳素的营养来源,具有过氧化氢酶活力,甲基红试验呈阳性,不能分解明胶、淀粉等大分子物质,葡萄糖发酵实验呈阳性,蔗糖、乳糖发酵呈阴性。 
(3)通过16SrDNA鉴定菌株LX12为侧孢短芽孢杆菌,为下一步对侧孢短芽孢杆菌的探究奠定了基础。 
一株花生根际生防菌的分离方法,其特征在于,所述的分离方法为:称取5g山东省花生研究所实验田花生根际土壤放入45ml蒸馏水的三角瓶中,摇动片刻,吸取上层液0.1ml加入到含有4.5ml无菌水试管中,制成1:100浓度的悬液,然后分别西区10-2和10-3土壤悬浊液各0.2ml滴加到含利福平的LB固体培养基平板上,用涂布棒均匀涂布,并将培养基倒置于28℃恒温培养箱培养1-2天。挑取平板上的一批单菌落于LB固体培养基平板上画线倒置于28℃恒温培养箱培养1-2天。 
一株花生根际生防菌抑制真菌能力的测定方法,其特征在于,所述的测定方法包括如下步骤: 
(1)真菌的培养:在无菌操作台中将花生根腐病菌、白绢病、疮痂病和花生褐斑病菌用镊子取约0.5cm*0.5cm的正方形小块接种至PDA培养基中,于28℃温室中倒置培养2-3天。 
(2)接种细菌:挑取对真菌抑制效果最好的单菌落LX12进行真菌对峙实验。待真菌长至约占培养皿1/3大小时在距离真菌1-2cm处接种细菌,继续放置28摄氏度温室培养2-3天,观察真菌生长状况。 
上述的一株花生根际生防菌在防治花生花生根腐病、白绢病、疮痂病和花生褐斑病菌中的应用。 
(1)菌株发酵液制备:将菌株活化后接入LB液体培养基,置于28度摇床中180r/min震荡培养3d。 
(2)花生病原菌的接种:将保存的花生根腐病、白绢病、疮痂病和花生褐斑病组织清洗干净后用粉碎机磨碎,纱布过滤后与无菌土混合使孢子数量为106 个/g土。钵体下层为无菌土,上层为菌土,厚度5cm左右。花生直接播种。 
(3)发病情况调查:播种前用LX12生防菌发酵液拌种,播种后15d、30d、45d利用LX12发酵液灌根,每个处理10盆,每盆3株,每盆每次浇稀释100倍发酵液100mL。设置50%多菌灵800倍液和清水两个对照。种植75天后调查花生根腐病、白绢病、疮痂病和花生褐斑病的发病情况。 
本发明的有益效果: 
1.本发明侧孢短芽孢杆菌对花生真菌病害和其它几种植物常见病害有良好的抑制作用。 
2.本发明侧孢短芽孢杆菌稳定性好培养方法简单; 
3.对峙试验显示,本发明侧孢短芽孢杆菌对花生根腐病、白绢病、疮痂病和褐斑病菌等花生病害有显著的抑制作用,盆栽和田间试验显示对花生根腐病、白绢病、疮痂病和褐斑病有明显的防治效果。 
附图说明
图1:LX12菌落形态特征图 
图2:菌株LX12的16srDNA的PCR产物 
图3:活性菌株LX12的16srDNA序列与GenBank基因库中短芽孢杆菌属的侧孢短芽孢杆菌的16srDNA序列同源性比对结果 
图4:菌株LX12与其在GenBank数据库中相关属种构建的以16SrDNA序列为基础的系统发育树 
具体实施方式
1、活性菌株LX12的分离 
称取5g山东省花生研究所实验田花生根际土壤放入45ml蒸馏水的三角瓶中,摇动片刻,吸取上层液0.1ml加入到含有4.5ml无菌水试管中,制成1:100浓度的悬液,然后分别西区10-2和10-3土壤悬浊液各0.2ml滴加到含利福平的LB固体培养基平板上,用涂布棒均匀涂布,并将培养基倒置于28℃恒温培养箱培养2天。挑取平板上的一批单菌落于LB固体培养基平板上画线倒置于28℃恒温培养箱培养2天。 
其中,在LB培养基画线培养一天后,菌落约0.3mm,呈白色,边缘整齐,有凸起,表面光滑湿润,不透明。如图1所示。 
2、LX12细菌的生理生化鉴定 
革兰氏染色、柠檬酸盐利用试验、过氧化氢酶试验、糖醇发酵试验、淀粉水解试验、明胶液化试验、甲基红试验等参照《常见细菌系统鉴定手册》进行生理生化鉴定。 
LX12菌株的生理生化鉴定结果见表1,结果显示LX12菌体表现为革兰氏阳性,能以柠檬酸盐作为碳素的营养来源,具有过氧化氢酶活力,甲基红试验呈阳性,不能分解明胶、淀粉等大分子物质。经比照文献(方中达,1998;布坎南等,1984),菌株LX12与侧孢短芽孢杆菌的生理生化特性基本一致,初步确定该菌株为侧孢短芽孢杆菌。 
表1活性菌株LX12的生理生化特征 
Figure DEST_PATH_GDA0000457453750000041
Figure DEST_PATH_GDA0000457453750000051
注:“+”表示反应结果为阳性;“-”表示反应结果为阴性。 
Reference:“+”present positive result;“-”present negative result. 
3、细菌的16SrRNA分子学鉴定 
3、1菌株DNA提取 
选取对真菌具有拮抗活性的细菌菌株,挑取10个相同的菌落做重复,进行基因组DNA的提取,其提取方法主要参照TIANGEN TIANamp BACTERia DNA Kit试剂盒说明书进行,并略加修改,步骤如下: 
(1)取细菌培养液1mL,10000rpm离心1min,尽量吸净上清; 
(2)向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA,震荡至菌体彻底悬浮; 
(3)加入4μLRNAase(100mg/mL)溶液,震荡15s,室温放置5min; 
(4)向管中加入20μL蛋白酶K溶液,混匀; 
(5)加入220μL缓冲液GB,震荡15s,70℃放置10min,简短离心以去除管盖内壁的水珠; 
(6)加入220μL无水乙醇,充分震荡混匀15s,此时可能出现絮状沉淀,简短离心以去除管盖内壁的水珠; 
(7)将上一步所得的溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱GB3中(吸附柱放入收集管中),12000rpm离心30s,倒掉废液将吸附柱CB3中放入收集管中; 
(8)向吸附柱CB3中放入500μL缓冲液GD(使用前检查是否加收入无水乙醇),12000rpm离心30s,倒掉废液将吸附柱CB3中放入收集管中; 
(9)向吸附柱CB3中放入700μL漂洗液PW(使用前检查是否加收入无水乙醇),12000rpm离心30s,倒掉废液将吸附柱CB3中放入收集管中; 
(10)向吸附柱CB3中放入500μL漂洗液PW,12000rpm离心30s,倒掉废液将吸附柱CB3中放入收集管中; 
(11)将吸附柱CB3放回收集管中,12000rpm离心2min,倒掉废液,将吸附柱CB3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液; 
(12)将吸附柱CB3转入干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE,室温放置5min,12000rpm离心2min,将溶液收集到离心管中,-20℃保存。 
3、2PCR与序列测定 
(1)提取的DNA参照TaKaRa公司的16srDNABacterial Identification PCR Kit试剂盒说明书进行PCR扩增,其中正向引物为:5’-AGAGTTTGATCATGG CTCAG-3’,反向引物为:3’-CGCTTACCTTGTTACGACTT-5’。PCR扩增条件如下:94℃预变性5min;94℃变性1min;53℃退火1min;72℃延伸90s;72℃后延伸5min,共30个循环。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳分离,EB染色后置于3UVTMTransilluminator(UVP,USA)下进行观察。 
(2)根据预先设计的引物与预期扩增片段大小,结合Marker,目的片段 在紫外灯下切割下来,用回收试剂盒SilicaBeadDNAGelExtractionKit进行DNA的回收。16srDNA序列测定由宝生物工程(大连)有限公司进行序列测定。通过BLAST程序将测定的序列与GenBank(NCBI,网站http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中的序列比较,然后从GenBank中获得和试验菌株序列相近种、属的16srDNA序列进行确定。 
菌株LX12的16srDNA序列: 
(16sF)GACGAACGGCGGGCGGGCGTGCTATACATGCAGTCGAGCGAGGGTCTTCGGACCCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCTGTGAGACTGGGATAACATAGGGAAACTTATGCTAATACCGGATAGGGTTTTGCTTCGCCTGAAGCGAAACGGAAAGATGGCGCAAGCTATCACTTACAGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAGTTCTGTTGTTAGGGAAGAAACAGTGCTATTTAAATAAGGTAGCACCTTGACGGTACCTAACGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGCTATGTAAGTCTGATGTTAAAGCCCGAGGCTCAACCTCGGTTCGCATTGGAAACTGTGTAGCTTGAGTGCAGGAGAGGAAAGTGGTATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGCCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTAGGGGTTTCAATACCCTTAGTGCCGCAGCTAACGCAATAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGACCTTACCAGGTCTTGACATCCCACTGACCGCTCTAGAGATAGAGCTTCCCTTCGGGGCAGTGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGAATGTTGGATTAGTCCGCACGAGCGGCAACCCTTAATCTTTAGGTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTTGAGAGACTGCCGTCGACAAGACGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTTGGTACAACGGGATGCTACTTCGCGAGAAGATGCTAATCTCTTAAAACCAATCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGGGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCGTAAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGGTAGATAACTGGGGTGAAGTCGTAACAA(16sR) 
4、LX12细菌的16srDNA序列分析 
以菌株的基因组DNA为模板,利用TaKaRa公司的16srDNA Bacterial Identification PCR Kit试剂盒对LX12菌株的16srDNA序列进行PCR扩增,扩增结果见图2。通过电泳检测发现LX12菌株的16srDNA片段大小约为1400bp,片段大小与试剂盒预期设计相符。PCR产物纯化回收后直接进行序列测定。测定序列结果表明LX12菌株的16srDNA片段共有1467nt碱基对组成。利用NCBI网站上的BLAST程序对该序列进行序列比对,获得已定名的与之相似的属、种的相关信息,比对结果见图3,结果显示该活性菌株的16srDNA序列与GenBank基因库中短芽孢杆菌属的侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)的16srDNA序列高度同源,同源率达99%。构建发育树和同源性分析结果显示(图4),菌株LX12与短芽孢杆菌属的侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)(Accession No:NR037005.1)单独构成一个分支,进化上的距离最近,反映出它们之间亲缘关系最近,运用DANMAN软件分析得到二者同源 性为99%。结合传统的生理生化特性鉴定以及16SrDNA序列分析的结果,判定菌株LX12为侧孢短芽孢杆菌。 
5、活性菌株LX12抑制真菌能力的测定 
(1)真菌的培养:在无菌操作台中,用镊子取约0.5cm*0.5cm的小块的花生根腐病菌和花生褐斑病菌接种至PDA培养基中,于28℃温室中倒置培养3天。 
(2)接种细菌:挑取对真菌抑制效果最好的单菌落LX12,进行真菌对峙实验。待真菌长至约占培养皿1/3时在距离真菌2cm处接种细菌,继续放置28摄氏度温室培养3天,观察真菌生长状况。 
抑菌率=[(对照真菌生长半径-处理真菌生长半径)/对照真菌生长半径]×100%。 
LX12对花生根腐病的对峙试验共进行3次(表2),抑制作用明显,抑制率为最低为64.7%,最高为77.4%。X12对花生白绢病的对峙试验共进行3次(表3),抑制作用明显,抑制率为最低为66.2%,最高为70.8%。X12对花生疮痂病的对峙试验共进行3次(表4),抑制作用明显,抑制率为最低为64.3%,最高为77.5%。LX12对花生褐斑病的对峙试验共进行3次(表5),抑制作用明显,抑制率最低为63.3%,最高为79.8%。由此表明,LX12对病原菌有明显的拮抗作用,可以作为潜力生防菌株。 
表2LX12与花生根腐病的对峙实验结果(三批实验,每次三个重复) 
表3LX12与花生白绢病的对峙实验结果(三批实验,每次三个重复) 
Figure DEST_PATH_GDA0000457453750000072
表4LX12与花生疮痂病的对峙实验结果(三批实验,每次三个重复) 
Figure DEST_PATH_GDA0000457453750000073
表5LX12与花生褐斑病的对峙实验结果(三批实验,每次三个重复) 
Figure DEST_PATH_GDA0000457453750000074
Figure DEST_PATH_GDA0000457453750000081
6、菌株LX12盆栽和田间防治花生病害试验 
(1)菌株发酵液制备:将菌株活化后接入LB液体培养基,置于28度摇床中180r/min震荡培养3d。 
(2)盆栽试验:将保存的花生根腐病、白绢病、疮痂病和褐斑病组织清洗干净后用粉碎机磨碎,纱布过滤后与无菌土混合使孢子数量为106个/g土。钵体下层为无菌土,上层为菌土,厚度5cm左右。花生直接播种。 
(3)田间试验:试验地山东省花生研究所莱西试验农场进行,为花生连作田,花生根腐病、白绢病、疮痂病和褐斑病发生严重。采用随机区组设计,小区长4m,宽4.5m,行距45cm,株距16.7cm,重复3次,以50%多菌灵800倍液为药剂对照,清水为空白对照。分别在播种期、播种后15d、30d、45d利用LX12发酵液灌根,每株每次浇稀释100倍发酵液约30mL。其他田间管理同正常生产,75天后调查发病情况。 
根腐病分级标准: 
0级:茎基和主须根上均无病斑; 
1级:茎基和主根上有少量病斑; 
3级:茎基和主根上病斑较多,病斑面积占茎基和根总面积的1/4~1/2; 
5级:茎基和主根上病斑多且大,病斑面积占茎基和根总面积的1/2~3/4; 
7级:茎基和主根上病斑连片,形成绕茎现象,但根系并未死亡; 
9级:根系坏死,植株地上部萎蔫或死亡。 
白绢病分级标准: 
0级:植株无症状; 
1级:仅在茎基部产生病斑; 
2级:茎基部产生缢缩症状,整株的三分之一以下表现系统症状(枯萎、死亡、萎蔫等); 
3级:整株的三分之二以下表现系统症状; 
4级:整株的三分之二以上表现系统症状。 
疮痂病分级标准: 
0级:健康植株 
1级:在顶部嫩叶和果柄上出现小病斑 
2级:在嫩叶、果柄、茎上出现小病斑 
3级:嫩叶边缘向上卷曲,在花生茎和果柄上出现疮痂状 
4级:果柄、茎严重弯曲,植株现灼烧状 
褐斑病分级标准: 
0级:无病害症状; 
1级:受害叶片面积占调查叶片面积的1/10以下; 
2级:受害叶片面积占调查叶片面积的1/4以下; 
3级:受害叶片面积占调查叶片面积的1/2以下; 
4级:受害叶片面积占调查叶片面积的1/2以上,落叶。 
病株率=发病株数/总株数×100% 
病情指数=∑(发病级代表值×各级病株数)×100/(调查总株数×最高级发病代表值) 
防治效果=[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100% 
用生防菌LX12的发酵液处理花生菌株,室内盆栽和大田试验均表明对花生根腐病、白绢病、疮痂病和褐斑病均有明显防治效果,LX12对室内盆栽花生根腐病的防治效果为51.3%,田间防治效果为54.6%(表6);LX12对室内盆栽花生白绢病的防治效果为58.9%,田间防治效果为54.9%(表7);LX12对室内盆栽花生疮痂病的防治效果为51.4%,田间防治效果为57.4%(表8);LX12对室内盆栽花生褐斑病的防治效果为60.9%,田间防治效果为52.4%(表9),均高于对照药剂多菌灵处理。 
表6菌株LX12对花生根腐病的防治效果 
表7菌株LX12对花生白绢病的防治效果 
Figure DEST_PATH_GDA0000457453750000092
表8菌株LX12对花生疮痂病的防治效果 
Figure DEST_PATH_GDA0000457453750000093
表9菌株LX12对花生褐斑病的防治效果 
Figure DEST_PATH_GDA0000457453750000101
Figure IDA0000429309780000011

Claims (5)

1.一株花生根际生防菌,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其特征在于,该菌株为活性菌株LX12,保藏编号为CGMCC 7420。
2.一种由权利要求1所述保藏编号为CGMCC 7420的花生根际生防菌制备的微生物菌剂。
3.一种如权利要求1所述的花生根际生防菌的制备方法,其特征在于,包含如下步骤:
步骤1)称取5g花生根际土壤放入45ml蒸馏水的三角瓶中,摇动片刻,吸取上层液0.1ml加入到含有4.5ml无菌水试管中,制成1:100浓度的悬液;
步骤2)然分别吸取10-2和10-3土壤悬浊液各0.2ml滴加到含利福平的LB固体培养基平板上,用涂布棒均匀涂布,并将培养基倒置于28℃恒温培养箱培养1-2天;
步骤3)挑取平板上的一批单菌落于LB固体培养基平板上画线倒置于28℃恒温培养箱培养1-2天。
4.一种如权利要求1所述的花生根际生防菌抑制真菌能力的测定方法,其特征在于,包含如下步骤:
步骤1)真菌的培养:在无菌操作台中,分别取0.5cm*0.5cm小块的花生根腐病菌、白绢病、疮痂病和花生褐斑病菌接种至PDA培养基中,于28℃温室中倒置培养2-3天;
步骤2)接种细菌:挑取对真菌抑制效果最好的单菌落LX12进行真菌对峙实验;待真菌长至约占培养皿1/3时,在距离真菌1-2cm处接种细菌,继续放置28℃温室中培养2-3天。
5.一种如权利要求1所述的花生根际生防菌在防治花生根腐病、白绢病、疮痂病和花生褐斑病菌中的应用。
CN201310643869.3A 2013-12-03 2013-12-03 一株花生根际生防菌及其制备方法和应用 Expired - Fee Related CN103756930B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310643869.3A CN103756930B (zh) 2013-12-03 2013-12-03 一株花生根际生防菌及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310643869.3A CN103756930B (zh) 2013-12-03 2013-12-03 一株花生根际生防菌及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103756930A true CN103756930A (zh) 2014-04-30
CN103756930B CN103756930B (zh) 2015-06-10

Family

ID=50524257

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310643869.3A Expired - Fee Related CN103756930B (zh) 2013-12-03 2013-12-03 一株花生根际生防菌及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103756930B (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104480046A (zh) * 2014-12-18 2015-04-01 江苏省农业科学院 一株侧孢短芽孢杆菌及其应用
CN104673730A (zh) * 2015-03-23 2015-06-03 大连理工大学 一株具有快速降解亚硝态氮功能和抑菌功能的侧孢短芽孢杆菌及其应用
CN107135828A (zh) * 2017-04-30 2017-09-08 中国农业科学院油料作物研究所 一种花生白绢病温室苗期接种方法
CN108048354A (zh) * 2017-12-26 2018-05-18 山东省花生研究所 一株枯草芽孢杆菌及其应用
CN108102972A (zh) * 2018-01-31 2018-06-01 山东省花生研究所(山东省农业科学院花生工程技术研究中心) 一种防治花生病害的复合生防菌剂的制备方法及应用
CN111849815A (zh) * 2020-07-21 2020-10-30 广西民族大学 一种植物根际促生菌株Gxun-20及其在植物促生中的应用
CN111944728A (zh) * 2020-08-26 2020-11-17 河南大学 一株绿针假单孢菌及其应用
CN113248329A (zh) * 2021-07-02 2021-08-13 山东丰本生物科技股份有限公司 一种具有抗重茬作用的微生物肥料及其制备方法与应用
CN116162564A (zh) * 2022-08-18 2023-05-26 西南科技大学 一株乌头白绢病生防无色杆菌jy-2-3r及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1580242A (zh) * 2004-05-18 2005-02-16 北京生太平生物工程技术有限公司 一种侧孢短芽孢杆菌、其发酵过程及应用
CN1631166A (zh) * 2004-11-04 2005-06-29 云南大学 一种防治三七根腐病的生物菌剂的制备方法和应用
CN102838398A (zh) * 2011-09-05 2012-12-26 麻林涛 一种花生专用复合微生物肥料及其制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1580242A (zh) * 2004-05-18 2005-02-16 北京生太平生物工程技术有限公司 一种侧孢短芽孢杆菌、其发酵过程及应用
CN1631166A (zh) * 2004-11-04 2005-06-29 云南大学 一种防治三七根腐病的生物菌剂的制备方法和应用
CN102838398A (zh) * 2011-09-05 2012-12-26 麻林涛 一种花生专用复合微生物肥料及其制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHOJI J ET AL.: "Isolation of a new antibiotic, laterosporamine. Studies on antibiotics from the genus Bacillus.XIII", 《ANTIBIOT (TOKYO)》, 31 December 1976 (1976-12-31), pages 390 - 393 *
周峻沛等: "利用Brevibacillus laterosporusYMF3.00003菌株研制生物杀菌剂", 《云南大学学报(自然科学版)》, 31 December 2006 (2006-12-31), pages 456 - 460 *
柯崇榕等: "侧孢短芽胞杆菌产生线虫侵染性蛋白酶的优化", 《微生物学杂志》, 30 November 2010 (2010-11-30), pages 6 - 10 *

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104480046A (zh) * 2014-12-18 2015-04-01 江苏省农业科学院 一株侧孢短芽孢杆菌及其应用
CN104480046B (zh) * 2014-12-18 2017-04-05 江苏省农业科学院 一株侧孢短芽孢杆菌及其应用
CN104673730A (zh) * 2015-03-23 2015-06-03 大连理工大学 一株具有快速降解亚硝态氮功能和抑菌功能的侧孢短芽孢杆菌及其应用
CN107135828B (zh) * 2017-04-30 2019-10-29 中国农业科学院油料作物研究所 一种花生白绢病温室苗期接种方法
CN107135828A (zh) * 2017-04-30 2017-09-08 中国农业科学院油料作物研究所 一种花生白绢病温室苗期接种方法
CN108048354A (zh) * 2017-12-26 2018-05-18 山东省花生研究所 一株枯草芽孢杆菌及其应用
CN108048354B (zh) * 2017-12-26 2020-06-16 山东省花生研究所 一株枯草芽孢杆菌及其应用
CN108102972A (zh) * 2018-01-31 2018-06-01 山东省花生研究所(山东省农业科学院花生工程技术研究中心) 一种防治花生病害的复合生防菌剂的制备方法及应用
CN111849815A (zh) * 2020-07-21 2020-10-30 广西民族大学 一种植物根际促生菌株Gxun-20及其在植物促生中的应用
CN111849815B (zh) * 2020-07-21 2022-11-18 广西民族大学 一种植物根际促生菌株Gxun-20及其在植物促生中的应用
CN111944728A (zh) * 2020-08-26 2020-11-17 河南大学 一株绿针假单孢菌及其应用
CN111944728B (zh) * 2020-08-26 2022-02-22 河南大学 一株绿针假单孢菌及其应用
CN113248329A (zh) * 2021-07-02 2021-08-13 山东丰本生物科技股份有限公司 一种具有抗重茬作用的微生物肥料及其制备方法与应用
CN116162564A (zh) * 2022-08-18 2023-05-26 西南科技大学 一株乌头白绢病生防无色杆菌jy-2-3r及其应用
CN116162564B (zh) * 2022-08-18 2023-12-01 西南科技大学 一株乌头白绢病生防无色杆菌jy-2-3r及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN103756930B (zh) 2015-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103756930B (zh) 一株花生根际生防菌及其制备方法和应用
CN105296381B (zh) 一株枯草芽孢杆菌cyy-25及其应用
CN103146586B (zh) 一种防治植物真菌病害的哈茨木霉菌株及其应用
CN101974438B (zh) 一株桉树内生菌及其用途
CN105567615A (zh) 一种花生慢生根瘤菌及其应用
CN107646616A (zh) 一种花卉栽培基质的制备方法
CN102086444A (zh) 一株类芽孢杆菌菌株及其应用
CN105543132A (zh) 一种甲基营养型芽孢杆菌yb-f7及其在防治植物病害中的应用
CN112746024A (zh) 木霉复合菌剂以及利用其制备的生物有机肥
CN108048354A (zh) 一株枯草芽孢杆菌及其应用
CN101519644B (zh) 一株根瘤菌及其应用
CN109182219A (zh) 一株促梭罗草生长的莫海威芽孢杆菌及其应用
CN109971656B (zh) 一株生姜内生绿色木霉及其应用
CN105439657B (zh) 一种草莓专用抗重茬生物有机肥的制备方法
CN106222121B (zh) 一种巨大芽孢杆菌菌株、生防菌剂及其制备方法与应用
CN101748088B (zh) 一种根瘤固氮菌株系ry3菌株及其应用
CN108102972B (zh) 一种防治花生病害的复合生防菌剂的制备方法及应用
CN110343621A (zh) 一种棘孢木霉菌株及其应用
CN106035378A (zh) 一种用于防治烟草细菌病害的复合菌剂
CN100575476C (zh) 防治棉花黄萎病的菌株b221
CN105316258B (zh) 一种防治水稻纹枯病的菌株1ln2及其应用
CN102533564B (zh) 一种玉米苗期根腐病生防木霉菌的筛选方法
CN110205249B (zh) 一种促进植物生长的方法及其使用的链格孢真菌
CN103602622B (zh) 红假单胞菌菌株及其在抑制黄瓜霜霉病菌、促进黄瓜生长中的应用
CN104593266B (zh) 一种番茄内生真菌交织枝顶孢及其在番茄根结线虫病生防中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: SHANDONG PEANUT INST.

Free format text: FORMER OWNER: QINGDAO RUNDIFENG TECHNOLOGY CO., LTD.

Effective date: 20150511

Owner name: QINGDAO RUNDIFENG TECHNOLOGY CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: SHANDONG PEANUT INST.

Effective date: 20150511

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 266071 QINGDAO, SHANDONG PROVINCE TO: 266000 QINGDAO, SHANDONG PROVINCE

TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20150511

Address after: 266000 Shandong province Qingdao City, Lianyungang Road No. 20

Applicant after: Shandong Peanut Inst.

Applicant after: Qingdao Rundifeng Technology Co.,Ltd.

Address before: 266071 Nanning Road, Wangcheng Industrial Park, Qingdao, Shandong, Laixi

Applicant before: Qingdao Rundifeng Technology Co.,Ltd.

Applicant before: Shandong Peanut Inst.

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20170605

Address after: Wangcheng Street office Linquan village 266000 Shandong province Qingdao city of Laixi

Patentee after: Qingdao Xiangrun Biotechnology Co., Ltd.

Address before: 266000 Shandong province Qingdao City, Lianyungang Road No. 20

Co-patentee before: Qingdao Rundifeng Technology Co.,Ltd.

Patentee before: Shandong Peanut Inst.

TR01 Transfer of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20150610

Termination date: 20181203