CN104928201B - 一种解淀粉芽孢杆菌hn-11及其菌剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其微生物菌剂的制备方法，属于生物农药和植物保护领域。本发明从印楝树根际土壤分离到一株解淀粉芽孢杆菌HN‑11，该菌株以印楝渣作为培养基原料及其菌剂的吸附载体，经二次固体发酵腐熟制备成菌剂，菌剂中该芽孢杆菌含量为任意、印楝渣含量0～30％、大豆粉含量4～12％、麦麸含量5～25％、泥炭土含量30～50％、KCl含量1～5％、尿素含量为0.5～2％、表面活性剂含量1～8％。试验表明，该菌剂既可克服印楝渣直接使用伤苗的难题，又可扩大防治谱，综合防治香蕉枯萎病和香蕉穿孔线虫效果明显，对香蕉枯萎病田间防效达到96.2％，也促进植物生长。本发明对综合防治病虫害和促进农副产品循环利用具有重要意义，在生产实践中具有广泛应用前景。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌HN-11及其菌剂

技术领域

本发明属于生物农药和植物保护领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)HN-11和它的微生物菌剂的制备方法，及其在植物病虫害防治中的应用。该菌株已于2013年10月31日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO：8421，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

背景技术

印楝渣是杀虫植物印楝种子经提取印楝素后的副产品，由于利用率低，通常作为废弃物丢弃，这极大浪费了能作为植物病虫害防治产品的原料。我们的研究发现印楝渣本身仍然含有少量具有杀虫、抗菌作用的活性成分，但是现有技术中，印楝渣如果直接使用，少量时防病效果不佳，大量(大于5％)使用会造成植物伤苗现象，因此通过合适方法使其完成腐熟过程是有必要的。

另一方面，鉴于印楝渣还含有大量的有机物质和植物蛋白等营养成分以及纤维，可用作生防菌的培养基原料和吸附载体，将生防菌添加到印楝渣中，不仅可以加快其腐熟进程，同时印楝渣的养分可以保证生防菌大量生长繁殖，并作为生防菌的载体，两者辅助作用既可克服印楝渣直接大量使用伤苗的难题，又可扩大防治谱，同时利用印楝渣提供的养分促进植物生长。鉴于印楝渣含有少量抗菌作用活性成分，筛选到与其兼容而又具有防病的菌株尤为重要。

基于以上思路和技术要求，本发明人从印楝树的根际土壤分离到一株解淀粉芽孢杆菌HN-11，将其与印楝渣固体培养基二次发酵，并以印楝渣作为菌剂的吸附载体，制备成了具有防治病虫害和促进植物生长的新型微生物菌剂。

发明内容

本发明的目的在于根据现有技术中的上述不足，提供了一种与印楝渣兼容的解淀粉芽孢杆菌HN-11及其新型微生物菌剂的制备方法，克服了印楝渣直接使用时少量效果不佳、大量伤苗难题，使生防菌与印楝渣有机结合，扩大防治谱。

本发明的另一目的是提供上述高效防治香蕉枯萎病的解淀粉芽孢杆菌HN-11及其菌剂的应用，其对香蕉枯萎病和香蕉穿孔线虫具有综合防治作用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

本发明所述解淀粉芽孢杆菌HN-11的微生物菌剂，该菌剂以印楝渣作为生防菌HN-11的培养基原料及其菌剂的吸附载体，经过二次固体发酵腐熟，并添加适量的保护剂和表面活性剂制备而成。

本发明中所述的印楝渣作为解淀粉芽孢杆菌HN-11的基质培养基，可以促进HN-11菌株产孢，也充当菌剂的吸附剂，均属于本发明的保护范围。

上述微生物菌剂的具体制备方法步骤如下：

(1)将解淀粉芽孢杆菌HN-11接种到营养肉汤液体培养基(牛肉膏0.5％，蛋白胨0.5％，NaCl0.5％，其余为蒸馏水，pH6.5～7.3)，以180～300rpm转速度28～35℃摇瓶培养24h，得种子液。

(2)将步骤(1)获得的种子液按5～15％体积比接入YPD或Landy液体培养基，进行液体发酵生产，其发酵生产条件为：pH6.0～7.5，发酵温度范围为28～35℃，搅拌速度为180～300转/分钟，通气量1∶1，发酵时间为48～72小时，发酵液的芽孢数≥1×10¹⁰个/ml。培养期间进行质量和菌量检测。所述YPD培养基含有：葡萄糖12.5g、蛋白胨20g、酵母粉5g、牛肉膏3g，蒸馏水1L，pH自然。；Landy培养基含有：葡萄糖20g、L-谷氨酸5g、KH₂PO₄1g、MgSO₄·7H₂O0.5g、KCl0.5g、酵母粉1g、L-苯丙氨酸2mg、MnSO₄5mg、CuSO₄·5H₂O0.16mg、FeSO₄·7H₂O0.15mg，蒸馏水1L，pH7.2。

(3)将步骤(2)所得发酵液(必要时浓缩至原来体积30～60％)，然后添加8％NaCl、0.5％海藻酸钠和1％乙酸钠，混合均匀，即得HN-11菌株的水剂。或将步骤(2)所得发酵液按50～150ml/Kg的量接种到印楝渣固体培养基中，进行二次固体发酵腐熟，发酵过程中每天翻堆1次，发酵温度为25～45℃，发酵3～7天，发酵结束后添加重量1％保护剂和5％表面活性剂，在温度不高于60℃下通风干燥，使含水量控制在25％以下，包装封袋，即得固体菌剂。

所述的印楝渣固体培养基含有(质量比)：印楝渣0～30％、大豆粉4～12％、麦麸5～25％、泥炭土30～50％、KCl1～5％，pH6～7.5。特别的是，当培养基中不含有印楝渣时，以该培养基与HN-11制成的微生物菌剂也对香蕉枯萎病具有良好的防治效果，其田间防效达到了88.7％，均属于本发明的保护范围。

本发明所提供的微生物菌剂具体可用于防治香蕉枯萎病、番茄枯萎病、水稻纹枯病、稻瘟病、苜蓿黄萎病、十字花科蔬菜黑斑病以及香蕉穿孔线虫，优选香蕉枯萎病和番茄枯萎病；也可在促进植物生长中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公布了一种微生物菌剂的制备方法，该方法以印楝渣作为解淀粉芽孢杆菌HN-11的培养基，同时作为菌剂的吸附载体，经过二次发酵腐熟制备成菌剂。利用解淀粉芽孢杆菌加快印楝渣腐熟进程，同时保证生防菌大量生长繁殖，既克服了印楝渣直接使用时少量效果不佳、大量伤苗难题，又使生防菌与印楝渣有机结合，扩大防治谱。此外，具有节约资源、变废为宝和促进农业副产品的循环利用等优点，并且制备工艺简单，效果好，成本低，这也是本发明的特点之一。

经过实验证实，本发明的解淀粉芽孢杆菌HN-11及其菌剂对香蕉枯萎病和香蕉穿孔线虫具有良好的防治效果，对香蕉枯萎病田间防效达到96.2％以上。由此可见，该菌剂在防治香蕉枯萎病和香蕉穿孔线虫等植物病虫害方面具有巨大的应用前景，可以进行规模化推广应用，具有广阔的市场前景，将带来巨大的经济效益和生态效益。

本发明所采用的芽孢杆菌是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HN-11，筛选自广东省广州市华南农业大学杀虫植物标本园中印楝树的根际土壤，经实验证明，该菌株与印楝渣具有良好兼容性，能以印楝渣为唯一碳源的培养基生长，并且能高效抑制香蕉枯萎病菌、番茄枯萎病菌等植物病原菌的生长，这为维管束病害提供了一种新的防治措施。该菌株已于2013年10月31日保藏于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为CGMCC NO：8421，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

该菌株主要生物学特性为革兰氏染色阳性G+，细胞为杆状，产芽孢，厌氧条件不能生长，接触酶阳性、氧化酶阳性、VP反应阳性，VP<pH6、VP>pH7均呈阴性，甲基红试验阴性，氧化葡糖糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、乳糖、甘露醇产酸，可利用柠檬酸盐，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阳性，精氨酸双水解阴性，分解酪蛋白阳性，在50℃、pH5.7、7％NaCl条件下生长。

经过序列测定，该菌株HN-11的16SrDNA核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

菌种名称：解淀粉芽孢杆菌

拉丁名：Bacillus amyloliquefaciens

菌株编号：HN-11

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏中心登记入册编号：CGMCC NO：8421

附图说明

图1为解淀粉芽孢杆菌HN-11对香蕉枯萎病菌4号小种的拮抗作用。

具体实施方式

实施例1解淀粉芽孢杆菌HN-11的富集筛选和鉴定

1、解淀粉芽孢杆菌HN-11的富集筛选

以采自广东省广州市华南农业大学杀虫植物标本园中印楝树的根际土壤为土样。称取10g土壤加入印楝渣培养基(印楝渣30g，葡萄糖10g，蛋白胨5g，pH自然)28℃富集培养一周，然后称取10g土壤培养物放入装有90mL无菌水的三角瓶中，充分振荡后静置10min。取1mL上清液按10倍梯度浓度稀释至10-4、10-5、10-6浓度，分别取0.1mL稀释液，涂布于LB培养基(蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂粉15g，蒸馏水1L，pH自然)平板上，28℃倒置培养2～3d，根据菌落形态、颜色等特征挑取不同的单菌落进一步利用平板划线法纯化。

平板对峙培养法：以香蕉枯萎病菌4号小种等病原菌为指示菌，在PDA平板中央接入直径为5mm的病原菌菌饼后，在距菌饼2.5cm处接种纯化后的菌株，28℃继续培养，连续观察记录各菌株抑菌带。

含毒介质法：将在平板对峙培养法中筛选出的具有较好活性的菌株接入营养肉汤液体培养基(牛肉膏0.5％，蛋白胨0.5％，NaCl0.5％，琼脂1.5％，其余为蒸馏水，pH7.2)，摇床培养24h后待用。在培养皿(直径90mm)中加入1mL菌液，再加入19mL冷却至45℃左右的PDA培养基，混匀，待培养基凝固后，在PDA平板中央接入直径为5mm的病原菌菌饼，重复三次，以不含菌液的平板为对照，28℃培养待对照中病原菌长满平板后测定菌落直径，根据以下公式计算HN-11菌株对各病原菌的抑菌率。

抑菌率计算公式：抑菌率(％)＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-5)]×100

实验结果最终筛选获得一株对香蕉枯萎病4号小种和番茄枯萎病菌具有很强抑制作用的菌株HN-11，抑菌率分别达到98.4％和96.9％。

同时对水稻纹枯病菌、稻瘟病菌、苜蓿黄萎病菌和十字花科蔬菜黑斑病菌等作为指示菌进一步作了抑菌实验，抑菌效果见如表1。

表1菌株HN-11对各病原菌的抑菌效果

以上结果表明，由印楝树的根际土壤分离到的菌株HN-11对香蕉枯萎病菌4号小种、番茄枯萎病菌和水稻纹枯病菌具有显著的抑菌活性，而且其对稻瘟病菌、苜蓿黄萎病菌以及十字花科蔬菜黑斑病菌也有较好的抑菌活性。

2、解淀粉芽孢杆菌HN-11的鉴定

对实施例1中所分离的菌株HN-11按常规的方法进行生物学特性观察，细胞形态、生理生化特性和16SrDNA分析，鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，并命名为解淀粉芽孢杆菌HN-11。

该菌株HN-11的细胞形态和理化特性结果如表2，其16SrDNA全序列含有如序列SEQID NO：1所示核苷酸碱基，长度为1457bp。将该序列在GenBank数据库进行Blast比对，扩增的序列与解淀粉芽孢杆菌的16SrDNA序列的同源性达99％以上。

表2菌株HN-11的细胞形态和理化特性结果

注：+表示阳性反应，-表示阴性反应

实施例2解淀粉芽孢杆菌HN-11以印楝渣为唯一碳源的培养基中生长

从保存的解淀粉芽孢杆菌HN-11菌种表面挑取一环菌液，然后在营养肉汤液体培养基(牛肉膏0.5％，蛋白胨0.5％，NaCl0.5％，琼脂1.5％，其余为蒸馏水，pH7.2)平板上划线，置于30℃培养24h；挑取单菌落接种至营养肉汤液体培养基(牛肉膏0.5％，蛋白胨0.5％，NaCl0.5％，其余为蒸馏水，pH7.2)中，以200转/min于30℃摇瓶培养24h，得种子液。

将获得的种子液按2％体积比接入以印楝渣为唯一碳源的液体培养基(印楝渣5g、蛋白胨10g、酵母粉5g，蒸馏水1L，pH自然)中，以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和玉米粉作为唯一碳源的培养基为对照，三个重复；分别置于摇瓶中，以200转/分，30℃培养48h。培养后，分别从印楝渣液体培养基和对照培养基中取出1ml菌液，测定OD_600nm。以OD_600nm表示发酵液的活菌数(OD_600nm＝1.0相当于10⁸个活芽孢)。

由于解淀粉芽孢杆菌HN-11是首次从印楝树根基土壤分离得到，我们首先验证该菌株是否可以印楝渣作为唯一碳源的培养基中生长。实验结果如表3，解淀粉芽孢杆菌HN-11可以印楝渣作为唯一碳源的培养基中生长，培养48h后，活菌数达到0.80×10⁸个，与葡萄糖相当(0.81×10⁸个)，比蔗糖、麦芽糖和玉米粉好。结果表明解淀粉芽孢杆菌HN-11具有以印楝渣作为唯一碳源的培养基中生长的特性。

表3 HN-11菌株在不同碳源培养基中的生长情况

实施例3解淀粉芽孢杆菌HN-11与印楝渣具有良好兼容性

各取印楝渣10g，分别加入甲醇、乙酸乙酯和无菌水10mL，混匀，黑暗中浸提2天，离心取上清液，经0.22μm无菌过滤器过滤除菌后，用牛津杯法测定提取液对解淀粉芽孢杆菌HN-11是否有抑菌活性，以提取溶剂作对照。结果表明，印楝渣的甲醇、乙酸乙酯和水提取液对解淀粉芽孢杆菌HN-11没有抑菌活性，说明该菌株HN-11与印楝渣具有很好的兼容性。

实施例4印楝渣促进解淀粉芽孢杆菌HN-11产芽孢

解淀粉芽孢杆菌HN-11种子液制备如实施例2。将获得的种子液按10％体积比接入印楝渣液体培养基(印楝渣20g、葡萄糖10g、酵母粉5g、牛肉膏3g，蒸馏水1L，pH自然)中，以不添加印楝渣的培养基为对照，分别置于摇瓶中，以200转/分，30℃培养72h。培养后，分别从印楝渣液体培养基和对照培养基中取出1ml菌液，用稀释平板菌落计数法测定培养基中的活菌数。以香蕉枯萎病菌为指示菌，用常规牛津杯法测定印楝渣培养基和对照无菌发酵液的抑菌效果。

从实验结果可见：解淀粉芽孢杆菌HN-11在印楝渣培养基和对照培养的无菌发酵液对香蕉枯萎病菌具有相同的抑菌效果，并且印楝渣培养基中活菌数高于对照培养基(2.4×10⁸个)，达到3.3×10⁸个。本实验首次发现，添加印楝渣(与对照相比)可以促进菌株HN-11产芽孢。

实施例5解淀粉芽孢杆菌HN-11水菌剂的制备

(1)从保存的解淀粉芽孢杆菌HN-11菌种表面挑取一环菌液，然后在营养肉汤液体培养基(牛肉膏0.5％，蛋白胨0.5％，NaCl0.5％，琼脂1.5％，其余为蒸馏水，pH7.2)平板上划线，30℃培养24h；挑取单菌落接种至营养肉汤液体培养基(牛肉膏0.5％，蛋白胨0.5％，NaCl0.5％，其余为蒸馏水，pH7.2)中，以200转/min于30℃摇瓶培养24h，得种子液。

(2)将步骤(1)获得的种子液按10％体积比接入YPD或Landy液体培养基，进行液体发酵生产，其发酵生产条件为：pH7.2，发酵温度范围为30℃，搅拌速度为200转/分钟，通气量1∶1，发酵时间为60小时，发酵液的芽孢数≥1×1010个/ml。培养期间进行质量和菌量检测。

所述YPD培养基含有：葡萄糖12.5g、蛋白胨20g、酵母粉5g、牛肉膏3g，蒸馏水1L，pH自然；Landy培养基含有：葡萄糖20g、L-谷氨酸5g、KH₂PO₄1g、MgSO₄·7H₂O0.5g、KCl0.5g、酵母粉1g、L-苯丙氨酸2mg、MnSO₄5mg、CuSO₄·5H₂O0.16mg、FeSO₄·7H₂O0.15mg，蒸馏水1L，pH7.2。

(3)将步骤(2)所得发酵液浓缩至原来体积30％，然后添加8％NaCl、0.5％海藻酸钠和1％乙酸钠，搅拌混合均匀，包装得HN-11菌株的水菌剂产品。

经测定，该水菌剂中HN-11菌株活芽孢数为3×10⁸个/ml。

实施例6解淀粉芽孢杆菌HN-11固体菌剂的制备

将实施例3步骤(2)所得发酵液按50～150mL/Kg的量接种到印楝渣固体培养基(印楝渣12％、大豆粉8％、麦麸22％、泥炭土47％、KCl5％)中，进行二次固体发酵腐熟，发酵过程中每天翻堆1次，发酵温度为30℃，发酵5天；发酵结束后添加重量1％保护剂尿素和5％表面活性剂农乳100，混合均匀；在温度不高于60℃下通风干燥，使含水量控制在25％以下，包装封袋，即得固体菌剂。

经测定，该固体菌剂中HN-11菌株活芽孢数为2.2×10⁹个/mL。

实施例7菌株HN-11以印楝渣为吸附剂的菌剂特性

将1L实施例3步骤(2)所得发酵液和2Kg印楝渣吸附载体混合均匀，制备成固体菌剂，室温保存。分别于第7、15、30、45、60d称取10g菌剂，加入至装有90mL无菌水的三角瓶中(带无菌玻璃珠)，充分振荡，静置10min。用稀释平板菌落计数法测定HN-11以印楝渣为吸附剂制成的菌剂在不同时间的活菌数。

表4以印楝渣为吸附剂的菌剂中活菌数

表4结果表明，以印楝渣作为解淀粉芽孢杆菌菌剂的吸附载体，活菌数在第30d时为2.35 ×10¹⁰个，在第60d时为2.21×10¹⁰个；说明以印楝渣为菌剂吸附载体，芽孢杆菌HN-11的活菌数比较理想，贮存稳定性良好。

实施例8微生物菌剂对印楝渣减害盆栽试验

为了表明本发明制备的微生物菌剂过程中添加的解淀粉芽孢杆菌HN-11通过对印楝渣腐熟，避免印楝渣(未腐熟，直接量超过5％使用)对植物造成伤害，本试验设置3个处理：处理1：不作任何处理作为阳性对照；处理2：实施例6中制备的印楝渣-微生物固体菌剂；处理3：未经腐熟的印楝渣。

每盆装移栽土壤3Kg(经灭菌处理)，按上述设置处理与土壤混匀，为了更好证明本发明的菌剂优点，各处理使用量为8％，每个处理30盆。将长出5至6片真叶的经过炼苗的香蕉组培苗移栽至苗盆中，每盆种1株。常规肥水管理，观察记录香蕉生长情况。

实施例9菌株HN-11的微生物菌剂对香蕉枯萎病的盆栽防效试验

测定实施例5和6制备得到的菌剂对香蕉枯萎病的盆栽防效，试验均设置4个处理：处理1：不作任何处理作为阳性对照，不接种香蕉枯萎病菌4号小种；处理2：经过灭菌处理的微生物菌剂作为阴性对照，接种香蕉枯萎病菌4号小种；处理3：含印楝渣的微生物菌剂，接种香蕉枯萎病菌4号小种；处理4：不含印楝渣的微生物菌剂(即印楝渣含量为0％时)，接种香蕉枯萎病菌4号小种。

将香蕉枯萎病菌4号小种病原菌接种到PDA液体培养基中，28℃摇床振荡培养3～4天后，将培养液用四层无菌纱布过滤，得香蕉枯萎病菌孢子悬浮液，用无菌水稀释浓度至107cfu/mL。

每盆装移栽土壤3Kg(经灭菌处理)，将菌剂与土壤混匀，每个处理30盆。将长出5至6片真叶的经过炼苗的香蕉组培苗移栽至苗盆中，每盆种1株香蕉幼苗。然后将制备好的香蕉枯萎病菌孢子悬浮液浇灌在种有香蕉幼苗的土壤中，每盆浇灌量均为15mL。常规肥水管理，观察记录发病情况，45天后调查病情等级，计算病情指数和防治效果。

病情分级：0级为无发病症状；1级为1～25％叶片变黄；2级为26～50％叶片萎蔫；3级为51～75％叶片萎蔫；4级为全株叶片萎蔫或植株死亡。

病情指数＝∑(病情等级×发病植株数)/(调查总株数×4)

防治效果(％)＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100

表5结果显示，以菌株HN-11和印楝渣发酵制备的微生物水剂和固体菌剂对香蕉枯萎病防治效果显著，分别达到90.6％和97.5％。特别的是，当培养基中不含有印楝渣时，以该培养基与HN-11制成的微生物菌剂也对香蕉枯萎病也具有良好的防治效果，对香蕉枯萎病田间防效达到88.7％。

表5微生物菌剂对香蕉枯萎病盆栽防治效果

实施例10微生物-印楝渣菌剂对香蕉穿孔线虫的盆栽防效试验

为了说明本发明的制备的微生物-印楝渣菌剂具有扩大防治谱，本试验测定实施例6制备的微生物-印楝渣菌剂对香蕉穿孔线虫的盆栽防效。试验设置3个处理：处理1：不作任何处理作为对照；处理2：HN-11菌液；处理2：微生物-印楝渣菌剂。香蕉穿孔线虫有华南农业大学植物线虫研究室提供，用胡萝卜愈伤组织培养繁殖，制备成100条/ml线虫悬浮液。

每盆装移栽土壤3Kg(经灭菌处理)，将微生物-印楝渣菌剂150g、HN-11菌液(在土壤终浓度达到105个)分别与土壤混匀，每个处理15盆。将长出3至4片真叶的经过炼苗的香蕉组培 苗移栽至苗盆中，每盆种1株香蕉幼苗。栽种30天后，用玻璃棒在香蕉苗的周围均匀打5个小孔，每孔接种2ml香蕉穿孔线虫悬浮液，每株香蕉共接种1000条，用土覆盖小孔。接种5天内不浇水，5天后正常管理。100d后拔出各盘香蕉植株，调查各处理根部病情等级，计算防治效果。

病情分级：0级，无发病症状；1级，根发病面积为1～5％；3级，根发病面积为5～25％；5级，根发病面积为25～50％；7级，根发病面积为50～75％；9级，根发病面积大于75％。

病情指数＝∑(病情等级×各级发病植株数)/(调查总株数×9)

防治效果(％)＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100

表6微生物菌剂对香蕉穿孔线虫的盆栽防治效果

表6结果显示，解淀粉芽孢杆菌HN-11菌液对香蕉穿孔线虫室内防效为0.3％，表明HN-11菌株本身不具有杀香蕉穿孔线虫活性；和印楝渣发酵制备成的微生物菌剂对香蕉枯萎病防治效果显著，达到92.3％，表明解淀粉芽孢杆菌HN-11与印楝渣结合制备成菌剂可以扩大防治谱作用。

实施例11微生物菌剂促进植物生长的盆栽试验

试验设置4个处理：处理1：不加菌剂作为对照；处理2：2.5％微生物菌剂；处理3：5％微生物菌剂；处理4：10％微生物菌剂。

每盆装移栽土壤3Kg(经灭菌处理)，按土重质量比将菌剂与土壤混匀，每个处理30盆。将经过简单炼苗的大小一致的香蕉组培幼苗移栽至苗盆中，每盆种1株香蕉幼苗。60天后调查香蕉苗生长状况，测量株高。

结果表明，微生物菌剂可以促进香蕉苗的生长，对照组平均株高为20.7cm，印楝渣-微生物菌剂处理组的平均株高为27.2cm。

实施例12印楝渣微生物菌剂防治香蕉枯萎病和促进香蕉生长的田间效果试验

为了表明本发明菌株HN-11的微生物菌剂，对香蕉枯萎病的防治效果以及对香蕉促进生长效果，在室内盆栽试验的基础上，进行了田间药效试验。2013年初在广州番禺区香蕉地进行印楝渣微生物菌剂的田间试验，设置两组处理：处理1不施药作为对照；处理2施加印楝渣微生物菌剂。选择香蕉苗生长一致的香蕉地，采用香蕉苗基肥施药方式，使用量60Kg/亩，处理后连续观察至2013年10月，调查发病情况，按照实施例9方法计算田间防效，并测量株高，记录试验结果。

试验结果表明，印楝渣微生物菌剂处理组的发病指数明显低于空白对照，能有效降低香蕉枯萎病发病率，田间防效达到96.2％；同时，印楝渣微生物菌剂可以促进香蕉苗的生长，处理组平均株高达到1.67m，比对照组高0.26m。

Claims (8)

1.一种拮抗菌，其特征在于：该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HN-11，已于2013年10月31日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO：8421，其16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，主要生物学特性为革兰氏染色阳性G+，细胞为杆状，产芽孢，厌氧条件不能生长，接触酶阳性、氧化酶阳性、VP反应阳性，VP<pH6、VP>pH7均呈阴性，甲基红试验阴性，氧化葡糖糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、乳糖、甘露醇产酸，可利用柠檬酸盐，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阳性，精氨酸双水解阴性，分解酪蛋白阳性，在50℃、pH5.7、7％NaCl条件下生长。

2.根据权利要求1所述的拮抗菌在植物病害防治中的应用，其特征在于：所述植物病害为香蕉枯萎病、番茄枯萎病、水稻纹枯病、稻瘟病、苜蓿黄萎病、十字花科蔬菜黑斑病。

3.一种微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将权利要求1所述的拮抗菌接种到营养肉汤液体培养基，以180～300rpm转速度28～35℃摇瓶培养24h，得种子液；

(2)将步骤(1)获得的种子液按5～15％体积比接入YPD或Landy液体培养基，进行液体发酵生产，其发酵生产条件为：pH6.0～7.5，发酵温度范围为28～35℃，搅拌速度为180～300转/分钟，通气量1∶1，发酵时间为48～72小时，发酵液的芽孢数≥1×10¹⁰个/ml，所述YPD培养基含有：葡萄糖 12.5g、蛋白胨20g、酵母粉5g、牛肉膏3g，蒸馏水1L，pH自然；Landy培养基含有：葡萄糖20g、L-谷氨酸5g、KH₂PO₄ 1g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、KCl 0.5g、酵母粉1g、L-苯丙氨酸2mg、MnSO₄ 5mg、CuSO₄·5H₂O 0.16mg、FeSO₄·7H₂O 0.15mg，蒸馏水1L，pH7.2；

(3)将步骤(2)所得发酵液添加8％NaCl、0.5％海藻酸钠和1％乙酸钠，混合均匀，即得HN-11菌株的水剂；或将步骤(2)所得发酵液按50～150ml/Kg的量接种到印楝渣固体培养基中，进行二次固体发酵腐熟，发酵过程中每天翻堆1次，发酵温度为25～45℃，发酵3～7天，发酵结束后添加重量1％保护剂和5％表面活性剂，在温度不高于60℃下通风干燥，使含水量控制在25％以下，包装封袋，即得固体菌剂。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：将步骤(2)所得发酵液浓缩至原来体积30～60％，然后添加8％NaCl、0.5％海藻酸钠和1％乙酸钠，混合均匀，即得HN-11菌株的水剂。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述印楝渣固体培养基以质量比计含有：印楝渣0～30％、大豆粉4～12％、麦麸5～25％、泥炭土30～50％、KCl 1～5％，pH6～7.5，其中印楝渣的含量不为0。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：固体菌剂中解淀粉芽孢杆菌HN-11含量达到10亿个/克以上、以质量比计含有：印楝渣12％、大豆粉8％、麦麸22％、泥炭土47％、KCl 5％、尿素1％、农乳100号5％；水剂中解淀粉芽孢杆菌HN-11含量达到3亿个/克以上、以质量比计含有：NaCl 8％、海藻酸钠0.5％、乙酸钠1％、其余为菌株HN-11发酵液，HN-11原发酵液中含有葡萄糖12.5g、蛋白胨20g、酵母粉5g、牛肉膏3g，蒸馏水1L，pH自然。

7.权利要求3~6任一项所述的制备方法制得的微生物菌剂在植物病害防治中的应用，其特征在于：所述植物病害为香蕉枯萎病、番茄枯萎病、水稻纹枯病、稻瘟病、苜蓿黄萎病、十字花科蔬菜黑斑病。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：固体菌剂还可用于防治香蕉穿孔线虫。