CN113767933B - 一种皂角发酵物及其防治病虫害和促生长上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物防治技术领域，具体涉及皂角发酵物在防治病虫害和促生长上的应用。本发明公开了一种皂角发酵物，以皂角为原料，接种发酵菌进行发酵所得。皂角发酵物对蜗牛、福寿螺、田螺、线虫及小菜蛾等主要虫害具有较好的拒食和毒杀活性；同时表明，对青霉、木霉、曲霉及杆菌等主要病原菌具有较好的抑制活性；皂角发酵物还能促进竹荪对营养物质的吸收和菌体生长。使用皂角发酵物可减少化学农药的使用，保障食品安全，促进经济效益，在生产实践中具有广泛应用前景。

Description

一种皂角发酵物及其防治病虫害和促生长上的应用
技术领域
本发明属于生物防治技术领域。具体地，涉及一种皂角发酵物及其防治病虫害和促生长上的应用。
背景技术
皂角(Gleditsia sinensis)具有开窍通闭，祛痰止咳，杀虫、杀鼠、防治植物病害等功效，在民间常被用作土农药。目前有关皂角的生物活性集中在皂角刺的抗氧化、抗肿瘤、杀菌等中医药方面，有学者对皂角提取物的粘虫、菜粉蝶、朱砂叶螨的杀虫活性研究，比如《皂角提取物的杀虫活性及其对粘虫的作用方式研究，李玉奇，2012》，但是对皂角防治植物病虫害的农药活性研究甚少。生产中皂角米只占其中8％，其余副产物作为废弃物未得到充分利用。加工副产物综合利用程度低，功能性开发不足，成为制约皂角产业发展的瓶颈。
另外，化学农药的使用，使得我国病虫害抗药性日益严重，造成严重的经济损失，随之也带来农残超标、环境污染甚至人畜中毒等问题，严重影响食品质量安全和人类健康。比如竹荪等食用菌，我国是世界上最大的食用菌生产国，食用菌是我国出口创汇的优势农产品。其中，被称为“菌中皇后”的食用菌竹荪，现全世界有12种，而产于我国的就有7种，常见可食用4种。相较于普通蔬菜和水果，竹荪含有丰富的营养成分，碳水化合物、蛋白、粗脂肪、粗纤维、氨基酸、矿物元素等营养成分，且所含的氨基酸大多以不易流失的菌体蛋白的形态存在。但竹荪等食用菌，病害频发，化学农药仍是目前主要的防治措施，未有较好的生物防治方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术上的缺陷和不足，提供一种皂角发酵物及其防治病虫害和促生长上的应用，尤其在食用菌竹荪的病虫害防治以及促生长方面具有重要的应用价值。
本发明的目的是提供一种皂角发酵物；
本发明第二个目的是提供皂角发酵物在防治病虫害和促生长上的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种皂角(Gleditsia sinensis)发酵物，以皂角为原料，接种发酵菌进行发酵所得，其中起作用的成分包括发酵过程中产生的代谢物。
优选地，所述的发酵菌为解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、米曲霉、总状毛霉、嗜热链球菌、短双歧杆菌或酿酒酵母。
作为可选择的优选方案，采用发酵菌为解淀粉芽孢杆菌，具体可为解淀粉芽孢杆菌HN11菌株，该菌分离于华南农业大学杀虫植物标本园的土壤，由中国科学院微生物研究所菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No.8421，保藏日期为2013年10月31日。
更优选地，所述皂角发酵物中发酵菌的接种体积比为1～10％，菌液浓度为106～1011CFU/mL；
进一步优选地，所述的皂角发酵物原料为皂角的皂荚去除种子后的部分；
所述皂角包括皂角属各个品种；
进一步优选地，皂角发酵物的发酵条件如下：
(1)温度35～45℃保持1～10d；
(2)按照0.5～2℃/h速度升温到50～60℃，保持3～10d；
(3)按照0.5～2℃/h速度降温到35～45℃。
进一步优选地，发酵条件如下：
(1)温度40℃保持1～10d；
(2)按照1℃/h速度升温到55℃，保持3～10d；
(3)按照1℃/h速度降温到40℃。
进一步优选地，所述发酵过程中每2h翻拌一次，所得发酵物pH值4.0～6.0。
本发明制备的皂角发酵物对福寿螺、田螺、线虫等主要虫害具有较好的拒食和毒杀活性。2mg/mL的皂角发酵物对以上虫害的致死率均能达70％以上，可用于制备生物杀虫剂。对青霉、木霉、曲霉、杆菌等主要病原菌具有较好的抑制活性，抑制率均能达70％以上，可用于制备生物杀菌剂。皂角发酵物还能促进竹荪对营养物质的吸收和菌体生长。
因此，本发明还提供一种皂角发酵物在防治病虫害中的应用。
优选地，所述皂角发酵物在防治竹荪病虫害中的应用。
更优选地，所述竹荪包括：红托竹荪、短裙竹荪、长裙竹荪、棘托竹荪等；
更优选地，在防治竹荪病虫害应用中，病虫害包括：福寿螺、田螺、蜗牛，木霉、青霉、曲霉、杆菌、小菜蛾及线虫等害虫中的一种或多种。
本发明还提供一种皂角发酵物在促进竹荪生长上的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种皂角(Gleditsia sinensis)发酵物，本发明研究表明，皂角发酵物对蜗牛、福寿螺(幼螺和成螺)、田螺(幼螺和成螺)、线虫和小菜蛾等主要虫害具有较好的毒杀活性，致死率均值分别为91.5％、89.25％和84.5％、89.38％和84.25％、74.7％和84％，而且施用所述皂角发酵物后可显著增强虫害对植物的拒食，因此可用于制备生物杀虫剂，为该虫害防治提供了新的方法。
同时表明，皂角发酵物对青霉、木霉、曲霉和杆菌等主要病原菌具有较好的抑制活性，抑菌率均能达到70％以上，可用于制备生物杀菌剂，为病虫害的防治提供了新的思路。
经过皂角发酵物处理的竹荪种植区域中，生长面积增加了10.2％，表明皂角发酵物具有一定的促进竹荪生长的效果，对提高竹荪的生长发育提供了一种新的方法思路和应用前景。本发明所涉及皂角发酵物可以进行规模发酵，具有原料天然，生产工艺简单、周期短等特点，且在环境中易于降解，对人畜安全无毒，能有效保障食品安全，提高食用菌经济效益。
附图说明
图1为皂角粉对菌株HN11的兼容性(A为配置的1mg/mL皂角粉干燥粗提物水溶液浓度；B为配置的2mg/mL皂角粉干燥粗提物水溶液浓度；C为配置的5mg/mL皂角粉干燥粗提物水溶液浓度)。
图2为皂角发酵物对皂角发酵物对曲霉的抑菌活性(a为皂角发酵物对黄曲霉抑菌活性；d为为皂角发酵物对红曲霉的抑菌活性)。
图3为皂角发酵物对皂角发酵物对肠杆菌的抑菌活性(b为肠杆菌ZSSZ1的活性；c为皂角发酵物对肠杆菌ZSSZ1的抑菌活性)。
图4为皂角发酵物对福寿螺成螺的杀虫活性饲喂图(A为空白对照；B为2mg/mL皂角发酵物的处理组)。
图5为皂角发酵物对小菜蛾的杀虫活性饲喂图。
图6为皂角发酵物促竹荪生长的试验(A为施用常规对照组生长的菌蛋大小；B为施用HN11菌液组生长的菌蛋大小；C为施用皂角组生长的菌蛋大小；D为施用皂角发酵物组生长的菌蛋大小)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1：皂角发酵物发酵菌的选择
兼容性测定：称取干燥后皂角果荚，粉碎成粗粉，取皂角粉末10g，加入无菌水分别配置成1mg/mL、2mg/mL、5mg/mL的溶液，用滤纸片法测定皂角对发酵菌是否具有抑制生长作用。
我们测试了多种发酵菌，结果显示，皂角对其中的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)HN11(保藏于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No.8421)、枯草芽孢杆菌HN09(为本实验室分离所得，保藏号为CGMCC No.7524)，以及嗜酸乳杆菌、米曲霉、总状毛霉、嗜热链球菌、短双歧杆菌、酿酒酵母(以上菌株均由华南农业大学资源与环境学院固废处理实验室提供)无生长抑制作用，表明皂角与这些常用发酵菌均具有良好兼容性(如图1所示的是解淀粉芽孢杆菌HN11的测试结果，表明皂角对菌株HN11无生长抑制作用，表明该菌株与皂角具有良好兼容性)。
实施例2：皂角发酵物的制备
1、解淀粉芽孢杆菌HN11的培养：
(1)按照微生物的常规培养方法，挑取少量保存于LB固体培养基或甘油离心管的解淀粉芽孢杆菌HN11菌株，接种于LB固体平板表面，37℃培养1天，作为规模发酵培养的菌种，待用；
(2)取上述LB固体平板表面的菌种，接种至无菌LB液体培养基的锥形瓶中，37℃、200rpm摇床培养2天，备用。
其中所用LB固体培养基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，1％琼脂，蒸馏水，pH调至7.0。
(3)皂角发酵物的制备：
皂角的制备：取干燥后皂角果荚，粉碎成粗粉，得皂角渣，备用。
将解淀粉芽孢杆菌HN11菌液稀释至107CFU/mL，按照接种体积比2％接入皂角渣翻拌均匀，进行发酵。发酵条件如下：(1)温度40℃保持1d，(2)按照1℃/h的速度升温到55℃，保持3d，(3)按照1℃/h的速度降温到40℃，发酵完成。其中发酵过程中每2h翻拌一次，所得发酵产物pH值6.0。
实施例3：皂角发酵物的制备
解淀粉芽孢杆菌HN11菌液的制备以及皂角的制备同实施例1。
将HN11菌液稀释至108CFU/mL，按照接种体积比3％接入皂角渣翻拌均匀，进行发酵。发酵条件如下：(1)温度40℃保持2d，(2)按照1℃/h的速度升温到55℃，保持4d，(3)按照1℃/h的速度降温到40℃，发酵完成。其中发酵过程中每2h翻拌一次，所得发酵产物pH值4.0。
实施例4：皂角发酵物的制备
解淀粉芽孢杆菌HN11菌液的制备以及皂角的制备同实施例1。
将HN11菌液稀释至108CFU/mL，按照接种体积比5％接入皂角渣翻拌均匀，进行发酵。发酵条件如下：(1)温度40℃保持2d，(2)按照1℃/h的速度升温到55℃，保持6d，(3)按照1℃/h的速度降温到40℃，发酵完成。其中发酵过程中每2h翻拌一次，所得发酵产物pH值5.0。
实施例5：皂角发酵物的制备
制备方法同实施例4，不同之处在于将解淀粉芽孢杆菌HN11替换为枯草芽孢杆菌HN09(HN09菌株为本实验室分离所得，保藏号为CGMCC No.7524)。
实施例6：皂角发酵物的制备
制备方法同实施例4，不同之处在于将解淀粉芽孢杆菌HN11替换为嗜酸乳杆菌(由华南农业大学资源与环境学院固废处理实验室提供)。
实施例7：皂角发酵物的制备
制备方法同实施例4，不同之处在于将解淀粉芽孢杆菌HN11替换为米曲霉(由华南农业大学资源与环境学院固废处理实验室提供)。
实施例8：皂角发酵物的制备
制备方法同实施例4，不同之处在于将解淀粉芽孢杆菌HN11替换为总状毛霉(由华南农业大学资源与环境学院固废处理实验室提供)。
实施例9：皂角发酵物的制备
制备方法同实施例4，不同之处在于将解淀粉芽孢杆菌HN11替换为嗜热链球菌(由华南农业大学资源与环境学院固废处理实验室提供)。
实施例10：皂角发酵物的制备
制备方法同实施例4，不同之处在于将解淀粉芽孢杆菌HN11替换为短双歧杆菌(由华南农业大学资源与环境学院固废处理实验室提供)。
实施例11：皂角发酵物的制备
制备方法同实施例4，不同之处在于将解淀粉芽孢杆菌HN11替换为酿酒酵母(由华南农业大学资源与环境学院固废处理实验室提供)。
实施例12：皂角发酵物对竹荪青霉抑菌活性
采用平板对峙培养法，测定实施例2～11的皂角发酵物对青霉的抑菌活性。
从4种竹荪发病菌袋中分离纯化一株青霉，在PDA平板三等分点接入直径为5mm的青霉菌菌饼后，在另一三等分点处接入浓度为2mg/mL的皂角发酵物水提液滤纸片，放入30℃培养箱培养，连续观察记录各菌株抑菌圈大小。
结果表明皂角发酵物对青霉的抑菌率达70％以上，表明皂角发酵物可以有效抑制青霉生长，实验结果详见表1。
表1皂角发酵物对竹荪青霉的抑菌率(第7d时)
Figure BDA0003230181420000061
实施例13：皂角发酵物对竹荪木霉抑菌活性
根据实施例12实验方法，从竹荪发病菌袋中分离纯化一株木霉，测定皂角发酵物对木霉的抑菌活性。第7d时2mg/mL皂角发酵物水提液对木霉的抑菌率达71％以上，表明皂角发酵物可以有效抑制木霉生长，实验结果详见表2。
表2皂角发酵物对竹荪木霉的抑菌率
Figure BDA0003230181420000071
实施例14：皂角发酵物对竹荪曲霉抑菌活性
根据实施例12实验方法，从发病的竹荪菌袋中分离出黄曲霉、红曲霉、黑曲霉。经测定皂角发酵物对黄曲霉、红曲霉、黑曲霉的抑菌活性，第7d时2mg/mL皂角发酵物水提液对黄曲霉、红曲霉、黑曲霉的抑菌率均能达到70％以上，实验结果详见表3～5，表明皂角发酵物可以有效抑制曲霉生长图2为皂角发酵物对皂角发酵物对黄曲霉和红曲霉的抑菌活性。
表3皂角发酵物对竹荪黄曲霉的抑菌率
Figure BDA0003230181420000072
Figure BDA0003230181420000081
表4皂角发酵物对竹荪红曲霉的抑菌率
Figure BDA0003230181420000082
表5皂角发酵物对竹荪黑曲霉的抑菌率
Figure BDA0003230181420000083
Figure BDA0003230181420000091
实施例15：皂角发酵物对肠杆菌抑菌活性
根据实施例12实验方法，测定皂角发酵物对肠杆菌的抑菌活性。从竹荪覆土松枝发病部位中分别分离出一株肠杆菌ZSSZ1，经过测序和NCBI比对后采用。第7d时2mg/mL皂角发酵物水提液对肠杆菌ZSSZ1的抑菌率达70％以上，结果见图3，表明皂角发酵物可以有效抑制曲霉生长，实验结果详见表6。
表6皂角发酵物对竹荪肠杆菌的抑菌率
Figure BDA0003230181420000092
实施例16：皂角发酵物杀蜗牛活性
采用叶碟法，测定皂角发酵物对蜗牛的杀虫活性。配置不同浓度皂角发酵物水提液于离心管中，在烧杯中分别加入10只蜗牛，加入直径为10cm的浸药生菜叶碟5片，室温条件下湿纱布保湿培养，重复四次，每隔6h检查蜗牛生命体征，把腹足深陷到体螺层内，并分泌大量粘液的蜗牛取出，放入另一容器中，喷清水1次/2h，并保持湿度在60％～80％之间，如在6h后仍无生命活动特征，即可判断其死亡，能活动或能爬壁、吸附于壁的皆为活虫。连续观察记录死亡数，计算死亡率，实验结果详见表7。48h时2mg/mL皂角发酵物对蜗牛的死亡率平均值在91.5％，表明皂角发酵物可以有效防治蜗牛。
表7皂角发酵物对蜗牛的致死率
Figure BDA0003230181420000101
实施例17：皂角发酵物杀福寿螺活性
采用浸液法，测定皂角发酵物对福寿螺的杀虫活性。配置不同浓度皂角发酵物水提液于烧杯中，每杯分别接入孵化10天的福寿螺幼螺20只，另取烧杯接入成螺10只，重复四次，实验见图4所示，室温条件下保湿培养，浮于水面或悬浮于水对外界刺激无反应的为死螺，沉于水底且能活动或能爬壁、吸附于壁的皆为活螺。连续观察记录死亡数，计算死亡率，实验结果详见表8～9。48h时2mg/mL皂角发酵物对福寿螺幼螺和成螺死亡率平均值在89.25％和84.5％，表明皂角发酵物可以有效防治福寿螺。
表8皂角发酵物对福寿螺幼螺的致死率
Figure BDA0003230181420000102
Figure BDA0003230181420000111
表9皂角发酵物对福寿螺成螺的致死率
Figure BDA0003230181420000112
实施例18：皂角发酵物杀田螺活性
根据实施例17实验方法，测定皂角发酵物对田螺的杀虫活性，实验结果详见表10～11。48h时2mg/mL皂角发酵物对田螺幼螺和成螺死死亡率平均值在89.38％和84.25％，表明皂角发酵物可以有效防治田螺。
表10皂角发酵物对田螺幼螺的致死率
Figure BDA0003230181420000113
Figure BDA0003230181420000121
表11皂角发酵物对田螺成螺的致死率
Figure BDA0003230181420000122
实施例19：皂角发酵物杀线虫活性
盆栽番茄上形成根结后挑取成熟的卵块置于培养皿中，在25℃室温下孵化培养，每24h收集1次根结线虫2龄幼虫，并配制成至少含有120条/mL的悬浮液备用。配置不同浓度皂角发酵物水提液于96孔细胞培养板中，分别接入加入等体积的线虫悬浮液，重复四次，室温条件下保湿培养，线虫呈僵直不动为死虫，线虫呈弯曲蠕动状态为活虫。连续观察记录死亡数，计算死亡率，实验结果详见表12。48h时2mg/mL皂角发酵物对线虫死亡率平均值达到74.7％，表明皂角发酵物可以有效防治线虫。
表12皂角发酵物对线虫的致死率
Figure BDA0003230181420000131
实施例20：皂角发酵物杀小菜蛾活性
采用叶碟法，测定皂角发酵物对小菜蛾的杀虫活性。配置不同浓度皂角发酵物水提液，每管分别接入10头2龄末小菜蛾，放入浸药后直径为9mm的晾干菜心叶碟，重复四次，实验见图5所示，室温条件下保湿培养，线虫为南方根结线虫。毛笔触之不动的为死虫，触之有反应的皆为活虫。连续观察记录死亡数，计算死亡率，实验结果详见表13。48h时2mg/mL皂角发酵物对小菜蛾的死亡率达平均值到84％，表明皂角发酵物可以有效防治小菜蛾。
表13皂角发酵物对小菜蛾的致死率
Figure BDA0003230181420000132
Figure BDA0003230181420000141
实施例21：皂角发酵物促生长试验
在贵州竹荪种植基地中开辟四个试验小区，分别为试验小区A、B、C和D，每个试验小区的长度大约为10m，重复三次。整地并施入菌液、皂角粉和皂角发酵物，充分均匀。放置2天后，每排两袋放入生长状况良好且无病害竹荪菌袋，上层覆土根据体积同样施入药剂拌匀覆盖在菌袋表面及侧面，覆膜保湿，后续按竹荪基地正常温度、湿度管理。菌液的用量为2L/亩，固体药渣的用量为150kg/亩，试验设计如下表14。
表14竹荪种植基地试验小区的实验设置
Figure BDA0003230181420000142
调查与统计方法：于生产季节前20天进行调查。根据5点采样法，每小区随机定点调查10株，即每个处理调查30株(菇粒或菌团直径≥1cm)，查看生长情况和促生长效果。实验结果如图6所示，表明皂角发酵物处理组相较于常规对照组菌蛋大小和生长面积均有增加，其中生长面积增加了10.2％，表明皂角发酵物具有一定的促进竹荪生长的效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种能够防治病虫害的皂角（Gleditsia sinensis）发酵物，其特征在于，以皂角为原料，接种发酵菌进行发酵所得；所述皂角为皂荚去除种子后的部分，所述发酵菌为解淀粉芽孢杆菌；
所述皂角发酵物的发酵条件如下：
（1）温度35～45℃保持1~10 d；
（2）按照0.5～2℃/h速度升温到50～60℃，保持3～10 d；
（3）按照0.5～2℃/h速度降温到35～45℃；
所得发酵物pH值4.0～6.0。
2.根据权利要求1所述的皂角发酵物，其特征在于，所述发酵菌的接种体积比为1～10%，菌液浓度为106～1011CFU/mL。
3.根据权利要求1所述的皂角发酵物，其特征在于，发酵条件如下：
（1）温度40℃保持1～10 d；
（2）按照1℃/h速度升温到55℃，保持3～10 d；
（3）按照1℃/h速度降温到40℃。
4.根据权利要求3所述的皂角发酵物，其特征在于，所述发酵过程中每2 h翻拌一次。
5.权利要求1～4任一所述的皂角发酵物在防治病虫害中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述病虫害包括：福寿螺、田螺、蜗牛、小菜蛾、线虫、木霉、青霉、曲霉、杆菌中的一种或多种。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述病虫害为竹荪病虫害。
8.权利要求1～4任一所述的皂角发酵物在促进竹荪生长上的应用。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述竹荪包括：红托竹荪、短裙竹荪、长裙竹荪、棘托竹荪。
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