CN104140938B - 一种防治果树腐烂病的拮抗细菌菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防治果树腐烂病的拮抗菌菌株及其应用。本发明拮抗菌为短小芽孢杆菌Bacillus pumilus XJAU-117，微生物保藏号为CGMCCNo.9370。本发明的短小芽孢杆菌Bacillus pumilus XJAU-117是从核桃树腐烂病带病枝条中分离获得，对果树的腐烂病的拮抗作用显著而且高效，可以有效的抑制腐烂病病原菌的生长，防治其引起的植物病害，是一株防效高，环境安全性好的生物防治潜力菌株，具有良好的开发应用前景。

Description

一种防治果树腐烂病的拮抗细菌菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种拮抗菌菌株，特别涉及一种拮抗果树腐烂病病害多种病原真菌的短小芽孢杆菌及其应用。

背景技术

果树腐烂病又称烂皮病、臭皮病等，世界各地均有发生。腐烂病主要危害结果树的枝干和树皮，严重时造成枝枯，结果能力下降，以致整株死亡。幼树和苗木也可被害，但发病较少。发病初期从外表不易识别，如果掀开枝干的表皮，可见到暗褐色致红褐色湿润的小斑或黄褐色的干斑，有时，内部病变面积已较大了，而从外部仍不好识别。受害较重时皮层腐烂坏死，用手指按下即下陷。病皮极易剥离，烂皮层红褐色，湿腐状时有酒糟味。发病后期，病部失水干缩，变黑褐色下陷，并在上产生黑褐色小点粒，即病菌的分生孢子器，成为再发病的传染源。

果树腐烂病是真菌引致的植物病害，通常在果树进入结果期后，开始发生，随着树龄的增加和产量的不断提高，腐烂病会逐年增多，持续低温、冻害，夏季高温、干燥，管理粗放等都能导致树势衰弱，致使腐烂病成为果树进入盛果期后发病面积最广、危害最严重的病害。

目前对果树腐烂病的防治主要以化学防治为主，防治成本高且不彻底，长期、反复和大量使用化学农药会引起土壤、水体和大气污染，农药残留增加，食品安全性问题日益严重；并且化学农药在杀灭病原菌的同时也破坏了生态环境。

发明内容

本发明目的之一是针对现有腐烂病防治存在的技术问题提供一株从核桃树腐烂病带病枝条中分离获得的拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117，利用其拮抗作用，对果树腐烂病病害进行安全、有效、环保的生物防治。

本发明的目的之二是提供上述拮抗菌菌株Bacillus pumilus XJAU-117在防治果树腐烂病方面的应用，尤其是拮抗菌菌株Bacillus pumilus XJAU-117在防治核桃腐烂病、杏树腐烂病、苹果腐烂病、杨树腐烂病等多方面的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明一方面提供一种拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117，其微生物保藏号是CGMCC No.9370；分类命名是：短小芽孢杆菌Bacillus pumilus；保藏时间：2014年6月23日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。

其中，所述拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117具有拮抗果树腐烂病病原菌的作用，能够高效防治果树腐烂病。

本发明所述拮抗菌菌株的形态特征：

拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117为革兰氏阳性杆菌，形状为杆状，鞭毛特征不明显，单菌落为圆形，乳白色、奶油状、不透明、中央隆起、光滑、边缘完整、易乳化。

本发明拮抗果树腐烂病菌的细菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117的是在分离核桃树腐烂病病菌的过程中，采用常规组织分离法，从病斑边缘病健交界处取样分离得到的，其分离筛选方法为：

1.选取3块5×5㎜的带病斑的植物组织块，用75％乙醇和3％NaClO进行表面消毒(将组织块置于75％乙醇后迅速取出，然后置于3％NaClO中消毒5min)，再用无菌水清洗3次，用灭菌滤纸将组织块表面的水吸干，将3块组织块均匀放在PDA平板培养基的表面，在28℃的培养箱内恒温培养，每24h观察一次；

2.在观察过程中，发现一个组织块周围出现明显的抑菌圈，将该细菌通过划线法纯化至含LB培养基的平板上28℃恒温培养，培养48h后观察菌落形态，挑取不同菌落形态的菌株通过划线法再次纯化培养，得到纯菌株，4℃保存菌种备用；

3.将核桃腐烂病病原菌接种于PDA平板上，在28℃下培养3天，用直径5mm的打孔器打取菌落生长一致的菌块，点接于PDA平板中央，病菌两侧2cm处划线接入步骤2纯化的菌株，以只接病原菌为对照，每个处理3个重复，28℃恒温培养；

4.待对照组的病原菌长满整个培养皿后，观察其抑菌带的有无，选取抑菌带最宽的菌株。

其中，PDA培养基的配方为:去皮土豆200g，葡萄糖17g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH自然；LB培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，调pH值至7.2，定容至1000mL(固体加1.5％的琼脂粉)。

本发明所述拮抗菌菌株的培养特性及生理生化特性如下：

拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117最适培养基为LB培养基，最适的生长温度为35℃和43℃，最适生长pH值为7；为好氧菌，厌氧条件下生长微弱；在含有7％和10％NaCl的液体培养基生长良好；可利用丙二酸盐及柠檬酸盐做碳源；菌株过氧化氢试验为阳性反应；可使明胶液化；有菌膜形成；甲基红试验呈阳性反应；V-P试验为红色，为阳性反应。

本发明还包括以上所述拮抗菌菌株的各种代谢产物。

还包括：通过培养所述拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117得到的菌株培养物、发酵培养液或发酵培养液的过滤液。

其中，所述拮抗菌菌株发酵培养过程中使用的培养基为NB培养基。

特别是，所述NB培养基的配方为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，pH7.0-7.2，定容至1000mL。

液体培养时,将拮抗菌菌株Bacillus pumilus XJAU-1172ml接种于盛有50mLNB培养基的150mL三角瓶中，于35℃、180r/min振荡培养48h，获得的发酵液、发酵液离心处理后的上清液、上清液采用无菌滤膜过滤后的无菌滤液、发酵混合物即可用于防治果树腐烂病。

还包括：以所述拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117为活性成分的生物菌剂。

特别是，所述菌剂中还可包含菌剂制备中常用的载体和辅料。

本发明另一方面提供所述拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117在防治果树腐烂病中的应用。

其中，所述的病原菌为核桃树腐烂病病原菌、杏树腐烂病病原菌、苹果腐烂病病原菌、杨树腐烂病病原菌。

特别是，拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117在防治果树腐烂病中的应用包括：将菌株接种液体培养基中，在180rpm/min、30℃条件下，进行恒温发酵培养，培养48h后，发酵液、发酵液离心处理后的上清液、上清液采用无菌滤膜过滤后的无菌滤液、发酵混合物用于拮抗果树腐烂病病原菌。

本发明还包括：所述的拮抗菌菌株的突变体、变异体或其衍生物在拮抗果树腐烂病病原菌中的应用，其中，所述的病原菌为核桃树腐烂病病原菌、杏树腐烂病病原菌、苹果腐烂病病原菌、杨树腐烂病病原菌。

本发明还包括：以所述拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117为活性成分的生物菌剂在拮抗果树腐烂病病原菌中的应用，其中，所述病原菌为核桃树腐烂病病原菌、杏树腐烂病病原菌、苹果腐烂病病原菌、杨树腐烂病病原菌。

本发明利用拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117防治果树腐烂病病害，对温度、pH等自然环境条件的适应范围广，能使腐烂病病原菌正常的菌丝隔膜发生断裂、解体，抑制果树腐烂病病菌菌丝的生长，其对几种腐烂病病原菌的抑制率均在80％以上，其发酵液的无菌滤液对几种腐烂病病原菌的抑制率也在50％以上，同时可以有效避免化学农药带来的一系列问题，具有安全、高效及无污染的特点。

附图说明

图1是本发明拮抗菌菌株Bacillus pumilus XJAU-117的革兰氏染色后菌体形态图；

图2是本发明拮抗菌菌株Bacillus pumilus XJAU-117的菌落形态图；

图3是本发明拮抗菌菌株Bacillus pumilus XJAU-117对核桃腐烂病病原菌的平板对峙拮抗结果图；其中，图左为仅接种核桃树腐烂病病原菌的平板生长情况；图右为接种拮抗菌株的核桃树腐烂病病原菌的平板生长情况。

图4是本发明拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117对杏树腐烂病病原菌的平板对峙拮抗结果图；其中，图左为接种拮抗菌株后杏树腐烂病病原菌的平板生长情况；图右为仅接种杏树腐烂病病原菌的平板生长情况。

图5是本发明拮抗菌菌株Bacillus pumilus XJAU-117对杨树腐烂病病原菌的平板对峙拮抗结果图；其中，图左为接种拮抗菌株后杨树腐烂病病原菌的平板生长情况；图右为仅接种杨树腐烂病病原菌的平板生长情况。

图6是本发明拮抗菌菌株Bacillus pumilus XJAU-117对苹果树腐烂病病原菌的平板对峙拮抗结果图；其中，图左为接种拮抗菌株后苹果树腐烂病病原菌的平板生长情况；图右为仅接种苹果树腐烂病病原菌的平板生长情况。

图7是本发明拮抗菌菌株Bacillus pumilus XJAU-117的发酵液的过滤液对核桃腐烂病病原菌的平板对峙拮抗结果图；其中，图左为仅接种核桃树腐烂病病原菌的平板生长情况；图右为添加拮抗菌株发酵液的过滤液后核桃树腐烂病病原菌的平板生长情况。

图8是本发明拮抗菌菌株Bacillus pumilus XJAU-117对核桃树腐烂病原菌菌丝生长的抑制效果图；其中图左为核桃树腐烂病原菌菌丝发生断裂、解体的显微形态图；图右为正常的核桃树腐烂病原菌病原菌菌丝的显微形态图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明精神和范围下可对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明保护范围内。

下述实施例中的方法，无特别说明，均为微生物学常规操作方法。下述实施例中的百分含量，无特殊说明，均为质量百分含量。

实施例1 拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117的分离、筛选与鉴定

1)拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117的分离

本发明拮抗果树腐烂病菌的细菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117本发明的菌株采自新疆阿克苏地区，是在分离核桃树腐烂病病菌的过程中，采用常规组织分离法，从病斑边缘病健交界处取样分离得到的：

1A)选取3块5×5㎜的带病斑的植物组织块，用75％乙醇和3％NaClO进行表面消毒(将组织块置于75％乙醇后迅速取出，然后置于3％NaClO中消毒5min)，再用无菌水清洗3次，用灭菌滤纸将组织块表面的水吸干，将3块组织块均匀放在PDA平板培养基的表面，在28℃的培养箱内恒温培养，每24h观察一次；

1B)在观察过程中，发现一个组织块周围出现明显的抑菌圈，将该细菌通过划线法纯化至含LB培养基的平板上28℃恒温培养，培养48h后观察菌落形态，挑取不同菌落形态的菌株通过划线法再次纯化培养，得到纯菌株，4℃保存菌种备用。

其中，PDA培养基的配方为:去皮土豆200g，葡萄糖17g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH自然；LB培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，调pH值至7.2，定容至1000mL(固体加1.5％的琼脂粉)。

2)拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117的筛选：

2A)将核桃腐烂病病原菌接种于PDA平板上，在28℃下培养3天，用直径5mm的打孔器打取菌落生长一致的菌块，点接于PDA平板中央，病菌两侧2cm处划线接入步骤2纯化的菌株，以只接病原菌为对照，每个处理3个重复，28℃恒温培养；

2B)待对照组的病原菌长满整个培养皿后，观察其抑菌带的有无，选取抑菌带最宽的菌株，并计算器其抑制率。其中，抑制率＝(对照菌落直径－处理菌落直径)/对照平板菌落直径×100％。

结果表明：拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117对核桃腐烂病病原菌的抑制效果最好，抑菌带宽度最宽，抑制率可达85.88％，如图1。

3)拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117的鉴定

3A)形态学鉴定：

取培养24h的拮抗菌单菌落，涂于载玻片上进行负染，显微镜下观察菌体的形态特征，鉴定方法参阅东秀珠等人编著的《常见细菌系统鉴定手册》(北京:科学出版社,2001:349-398)。图1为拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117革兰氏染色后菌体形态图；图2是本发明拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117的菌落形态图，测定结果如下：

拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117为杆状细菌，鞭毛特征不明显，为革兰氏阳性菌，单菌落为圆形，乳白色、奶油状、不透明、中央隆起、光滑、边缘完整、易乳化。

3B)生理生化特征鉴定：

生理生化特征的测定方法参阅《植病研究法》(北京：农业出版社，1977:161-224)测定结果如下：

拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117最适培养基为LB培养基，最适的生长温度为35℃和43℃，适合生长pH值为5～9；为好氧菌，厌氧条件下生长微弱；在含有7％和10％NaCl的液体培养基生长良好；可利用丙二酸盐及柠檬酸盐做碳源；菌株过氧化氢试验为阳性反应；可使明胶液化；有菌膜形成；甲基红试验呈阳性反应；V-P试验为红色，为阳性反应。

其中，所述最适LB培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，调pH值至7.2，定容至1000mL。

进一步对Bacillus pumilusXJAU-117的其他生理生化反应进行检测，BacilluspumilusXJAU-117的生物学特性如表1所示。

表1 拮抗菌株Bacillus pumilusXJAU-117的形态及生理生化特征

注释：“+”代表阳性，“-”代表阴性，“Ⅰ”代表生长缓慢，“Ⅱ”代表生长一般，“Ⅲ”代表生长最适。

实施例2 拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117对腐烂病病原菌生长的影响

1、拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117对腐烂病病原菌的抑菌率测定

通过平板对峙法，检测拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117对核桃腐烂病原菌、杏树腐烂病原菌、苹果腐烂病原菌、杨树腐烂病原菌的抑制效果。测定方法与实施例1中步骤2的方法相同。

核桃腐烂病原菌菌株、杏树腐烂病原菌菌株、苹果腐烂病原菌菌株、杨树腐烂病原菌菌株由新疆农业大学林学与园艺学院植物病理实验室提供。测定结果如如图3-6和表2所示。

如表2所示，将菌株XJAU-117对核桃树腐烂病的抑制率最高，为85.88％，对其他病菌的抑制率也均高于80％，抑制效果较好。

表2 拮抗菌对几种不同的腐烂病病菌的抑制率

2、拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117的无菌滤液对腐烂病病原菌的抑菌率测定

2A)制备发酵液的无菌滤液

将拮抗菌菌株Bacillus pumilus XJAU-117接种于盛有50mL NB培养基的150mL三角瓶中，于30℃、180r/min振荡培养48h，获得的发酵液经10000r/m离心20min后，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，即得无菌滤液。

其中NB培养基的配方为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl5g，水1000ml，pH7.0-7.2。

2B)无菌滤液对腐烂病病原菌的抑菌率测定

取拮抗菌菌株Bacillus pumilus XJAU-117的无菌滤液5ml与20mL冷却到50℃的PDA培养基混合倒入平板，制成带毒平板，以无菌水代替无菌滤液与PDA培养基混合，作为空白对照CK；

用直径5mm的打孔器将病原菌的PDA平板培养物打取菌块，将菌块点接于2A)制备的带毒平板中央，于28℃温度条件下培养4天，观察滤液抑菌效果，测量菌落直径计算抑菌率，设置三组平行对照，计算公式如下：

生长抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照平板菌落直径-菌块直径)×100％。

结果表明，拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117的无菌发酵滤液对核桃树腐烂病病原菌、杏树腐烂病病原菌、苹果树腐烂病病原菌、杨树腐烂病病原菌均具有明显的抑制作用，图7为拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117的无菌发酵滤液对核桃树腐烂病病原菌平板的对峙拮抗结果图，无菌发酵液对4种腐烂病病原菌的抑制率如表3所示。

表3 拮抗菌XJAU-117发酵液对4种腐烂病病原菌的抑制率

由表3可知，拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117的无菌发酵液对4种腐烂病病原菌的抑制率均高于50％，其中对杨树腐烂病病原菌的抑制率最高，为62.06％。

3、拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117对核桃腐烂病病原菌菌丝的影响

3A)将核桃树腐烂病病原菌接种于PDA平板上，在28℃条件下，于恒温箱中培养3天，得到病原菌的PDA平板培养物，用5mm打孔器打取菌饼，点接于另一PDA平板中央；

3B)将在LB培养基平板上纯化后的XJAU-117菌株等距离划线接种于病原菌两侧，并在拮抗菌株与病原菌间平铺一层灭菌的玻璃纸，在28℃的温度条件下培养；

3C)以只接种病原菌的PDA平板作为对照，观察出现抑制效果时将玻璃纸转至载破片上显微镜下观察菌丝的生长状况。

如图8所示，作为对照的核桃腐烂病病原菌的菌丝生长良好，细胞形态长而均匀；接种拮抗菌菌株Bacillus pumilusXJAU-117后，核桃腐烂病病原菌正常的菌丝发生消解，不再呈透明状，菌丝的生长受到了抑制。

Claims (7)

1.一种拮抗菌菌株Bacillus pumilus XJAU-117，所述拮抗菌菌株从核桃树腐烂病带病枝条分离得到，用于拮抗核桃树腐烂病病原菌、杏树腐烂病病原菌、杨树腐烂病病原菌，分类命名是：短小芽孢杆菌Bacillus pumilus；保藏编号为CGMCC No.9370；保藏时间：2014年6月23日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.如权利要求1所述的拮抗菌菌株得到的菌株培养物、发酵培养液或发酵培养液的过滤液。

3.权利要求1所述的细菌菌株为活性成分的生物菌剂。

4.权利要求1所述的拮抗菌菌株在防治核桃树腐烂病、杏树腐烂病、杨树腐烂病中的应用。

5.权利要求1所述的拮抗菌菌株在拮抗核桃树腐烂病病原菌、杏树腐烂病病原菌、杨树腐烂病病原菌的应用。

6.权利要求5所述的用于拮抗核桃树腐烂病病原菌、杏树腐烂病病原菌、杨树腐烂病病原菌的应用，其特征在于，包括将菌株接种液体培养基中，在180-200rpm/min、30℃条件下，进行恒温发酵培养，培养2天后，发酵液、发酵液离心处理后的上清液、上清液采用无菌滤膜过滤后的无菌滤液、发酵混合物用于拮抗核桃树腐烂病病原菌、杏树腐烂病病原菌、杨树腐烂病病原菌。

7.如权利要求3所述的生物菌剂在拮抗核桃树腐烂病病原菌、杏树腐烂病病原菌、杨树腐烂病病原菌中的应用，其中，所述病原菌为核桃树腐烂病病原菌、杏树腐烂病病原菌、杨树腐烂病病原菌。