CN113755345A - 一种利用内生菌防治腐烂病的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及梨树腐烂病治疗技术领域，公开了一种利用内生菌防治腐烂病的方法，S1：产紫青霉的制备；S2：制备无菌滤液；S3：制备带毒平板；S4：梨树枝条的选取；S5：用打孔器在枝条打孔，孔深至木质部；S6：处理后将枝条置于培养箱中保湿处理。本发明从梨树腐烂病发病枝条中分离获得一株真菌JK2，经形态学和分子生物学鉴定为青霉属产紫青霉，平板对峙试验显示，该菌株对梨树腐烂病菌具有强烈的抑制活性，抑制率达到95％以上，离体梨树枝条鉴定结果显示，JK2对梨树腐烂病具有良好的防治效果，产紫青霉是一种内生真菌，对环境和人类身体无害，有助于开发生物农药。
Description
技术领域
本发明涉及梨树腐烂病治疗技术领域，具体为一种利用内生菌防治腐烂病的方法。
背景技术
梨是我国最重要的水果之一，在各地区均有栽培。但近年来，我国梨在生产过程中受到多种病害的威胁，其中腐烂病是为害最严重的病害之一。梨树腐烂病是由病原菌Valsapyri引起的一种真菌病害，该病在我国梨主产区发生较为普遍，发病植株通常表现为树皮皮层腐烂，发病严重时引起梨树主干皮层坏死，甚至整株枯死。目前，化学防治仍是防治果树腐烂病最有效的手段之一。但是长期使用化学农药，不仅增加环境对病原菌的选择压力，还会造成环境污染以及食品安全问题。因此，在生产上亟需寻求替代化学防治病害的新方法或新手段。其中，生物防治手段具有安全、低毒、高效等特点，是当前病害防治研究的方向和热点。
利用植物内生菌及其代谢产物防治病害是生物防治的重要举措之一，在生产中已经表现出很好的应用前景。目前，关于梨树腐烂病生物防治有少量研究报道。例如，HASF(heat stable antifungal factor)是从产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)中分离鉴定的一种小分子物质，能导致梨树腐烂病菌菌丝体扭曲、顶端肿胀等畸形现象，从而抑制腐烂病菌的生长。但总体而言，当前梨树腐烂病防治的研究大部分集中在化学药剂的筛选和利用，而生物防治有关的研究还很少，可利用的梨树腐烂病菌拮抗菌资源还很有限，仍需进一步的挖掘和研究。
本研究从梨树腐烂病发病枝条中分离获得一株真菌JK2，对梨树腐烂病菌具有强烈的抑制活性，抑制率达到95％以上。将JK2接种梨树枝条或叶片，不会导致病害症状出现，表明JK2不是致病菌株，只是一株内生真菌。结合形态学和分子生物学鉴定结果显示，菌株JK2为青霉属产紫青霉。离体梨树枝条鉴定结果显示，JK2对梨树腐烂病具有良好的防治效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用内生菌防治腐烂病的方法，解决了背景技术中所提出目前生产上防治果树腐烂病主要采用化学防治，如甲基硫菌灵、嘧菌酯和丁丙环唑等农药。但长期、单一使用，势必会带来病原菌抗药性升高的风险。例如，已有报道显示，甘肃省苹果树腐烂病菌对甲基硫菌灵产生了不同水平的抗药性。另外，化学农药残留严重污染环境，破坏生态环境，危及人类健康及生命。随着人们生活水平的不断提高，人们对环境及水果的质量要求越来越高。因此，寻找防治病害的低残留、无污染、易降解的生物农药将是防治病害的方向的问题。
为实现上述目的，本发明首先提供了一种产紫青霉。所述产紫青霉为青霉(Penicillium purpurogenum)，其菌株号为JK2，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.22435。
所述产紫青霉的18S rDNA的核苷酸序列含有序列表中序列1所示的DNA分子。
所述产紫青霉的微管蛋白的编码序列含有序列表中序列2所示的DNA分子。
>18S rDNA的核苷酸序列：
GAGGGCCCCTCGCGGCCCAACCTCCCACCCTTGTCTCCAACACCTGTTGCTTCGGCGGGCCCACCGGGGCCACCCGGTCGCCGGGGGACATCCGTCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAGGCGCTCTGTGAACCCTGATGAAGATGGGCTGTCTGAGTGATATGAAAATTGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTGTGGTCCCCCTGGGGACCTGCCCGAAAGGCAGCGGCGACGTCCGTCTGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTCTGTCACTCGCTCGGGAAGGACCTGCGGGGGTTGGTCACCACCACATCTTTTTACAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAGTTACCCGCTGAAC；
>JK2-微管蛋白的核苷酸序列：
GCTTTAGTCATTGTCGCGACGACTCGCTGACTATTTTCAGGCAAATCATCTCTGCTGAGCACGGTCTCGATGGATCCGGCGTGTAAGTGTTGATGGGATTCGAAATCCATCTACAATTCGACCGTATCTGATAATCAACAGTTACAATGGCTCCTCCGACCTCCAGTTGGAGCGTATGAACGTTTACTTCAACGAGGTGCGTCGAACAACCAACCAATAGAAACAAAAACAAAAACTCATATCCAATGCTTAACAGGCTTCCGGCAACAAATATGTTCCTCGTGCTGTCCTCGTCGACTTGGAACCCGGCACCATGGATGCCGTCCGCGCTGGTCCCTTTGGTCAGCTCTTCCGTCCCGACAACTTTGTTTTCGGTCAGTCCGGTGCTGGTAACAACTGGGCCAAGGGTCACTACACTGA。
本发明提供如下技术方案：一种利用内生菌防治腐烂病的方法，包括如下步骤：
S1：产紫青霉的制备，将梨树腐烂病发病枝干韧皮部剥离，剪成组织块，投放于75％的乙醇中消毒；将步骤再用1％次氯酸钠消毒，组织经无菌水清洗5次后置于含氨苄青霉素的PDA培养基表面；待组织块周围长出菌丝，挑针挑取菌落边缘菌丝或菌块，转移至新的培养基中进行纯化培养；经单孢纯化后得到单一菌株保存备用；
S2：制备无菌滤液，将内生真菌JK2接种PDA平板上，在25℃下培养7d；用无菌水将孢子洗脱后，用血球计数板统计浓度，并将其调整为108个/mL；接种1mL孢子液于50mLPD培养基中，获得的发酵液过滤，即得无菌滤液；
S3：制备带毒平板，取无菌滤液与冷却到50℃的PDA培养基混合倒入平板，制成不同浓度(10％和20％)的带毒平板，以无菌水代替无菌滤液与PDA培养基混合；
S4：梨树枝条的选取，选取健康、长势一致当年生梨树枝条，经无菌水清洗干净后，用75％乙醇擦拭消毒，再用无菌水清洗，晾干；
S5：用打孔器在枝条打孔，孔深至木质部；分别用内生真菌上清液或分生孢子(108个/mL)喷施处理打孔枝条，无菌水处理作为阴性对照，戊唑醇处理作为阳性对照；
S6：处理后将枝条置于培养箱中保湿2d后，每个孔接种1个直径为0.5cm的梨树腐烂病菌菌饼，再用蘸无菌水的脱脂棉缠绕，外用封口膜缠绕保湿，置于25℃下光照培养箱中培养。
作为本发明的一种优选实施方式，所述S1中乙醇消毒时间为1min，且组织块的规格为0.5cm×0.5cm。
作为本发明的一种优选实施方式，所述S1中次氯酸钠的消毒时间为3min，所述培养基的成分为马铃薯200g·L-1、葡萄糖20g·L-1和琼脂粉15g·L-1；其中氨苄青霉素的含量为100mg·L-1。
作为本发明的一种优选实施方式，所述S3中培养液于25℃、180r/min条件下振荡培养7d。
作为本发明的一种优选实施方式，所述S3中，发酵液经10000r/m离心20min后，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤。
作为本发明的一种优选实施方式，所述S5中打孔器所用的直径为0.5cm。
作为本发明的一种优选实施方式，所述S6中的枝条7d后测量病斑长度，并拍照记录。
作为本发明的一种优选实施方式，所述S6中每次接种10个孔，重复3次，发病率＝(总接种点数-无病症的接种点数)/总接种点数*100％。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明从梨树腐烂病发病枝条中分离获得一株真菌JK2，经形态学和分子生物学鉴定为青霉属产紫青霉。平板对峙试验显示，该菌株对梨树腐烂病菌具有强烈的抑制活性，抑制率达到95％以上。离体梨树枝条鉴定结果显示，JK2对梨树腐烂病具有良好的防治效果。产紫青霉是一种内生真菌，对环境和人类身体无害，有助于开发生物农药。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明JK2能拮抗梨树腐烂病的发病程度示意图；
图2为本发明梨树腐烂病发病率统计示意图；
图3为本发明梨树腐烂病病斑长度统计分析示意图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制；在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“设置”应做广义理解，例如，可以是固定相连、设置，也可以是可拆卸连接、设置，或一体地连接、设置。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
请参阅图1-3，本发明提供一种技术方案：一种利用内生菌防治腐烂病的方法，包括如下步骤：
S1：产紫青霉的制备，将梨树腐烂病发病枝干韧皮部剥离，剪成组织块，投放于75％的乙醇中消毒；将步骤再用1％次氯酸钠消毒，组织经无菌水清洗5次后置于含氨苄青霉素的PDA培养基表面；待组织块周围长出菌丝，挑针挑取菌落边缘菌丝或菌块，转移至新的培养基中进行纯化培养；经单孢纯化后得到单一菌株保存备用；
S2：制备无菌滤液，将内生真菌JK2接种PDA平板上，在25℃下培养7d；用无菌水将孢子洗脱后，用血球计数板统计浓度，并将其调整为108个/mL；接种1mL孢子液于50mLPD培养基中，获得的发酵液过滤，即得无菌滤液；
S3：制备带毒平板，取无菌滤液与冷却到50℃的PDA培养基混合倒入平板，制成不同浓度(10％和20％)的带毒平板，以无菌水代替无菌滤液与PDA培养基混合；
S4：梨树枝条的选取，选取健康、长势一致当年生梨树枝条，经无菌水清洗干净后，用75％乙醇擦拭消毒，再用无菌水清洗，晾干；
S5：用打孔器在枝条打孔，孔深至木质部；分别用内生真菌上清液或分生孢子(108个/mL)喷施处理打孔枝条，无菌水处理作为阴性对照，戊唑醇处理作为阳性对照；
S6：处理后将枝条置于培养箱中保湿2d后，每个孔接种1个直径为0.5cm的梨树腐烂病菌菌饼，再用蘸无菌水的脱脂棉缠绕，外用封口膜缠绕保湿，置于25℃下光照培养箱中培养。
本实施例中，利用内生菌防治腐烂病的方法S1中乙醇消毒时间为1min，且组织块的规格为0.5cm×0.5cm，利用内生菌防治腐烂病的方法S1中次氯酸钠的消毒时间为3min，利用内生菌防治腐烂病的方法培养基的成分为马铃薯200g·L-1、葡萄糖20g·L-1和琼脂粉15g·L-1；其中氨苄青霉素的含量为100mg·L-1。
本实施例中，利用内生菌防治腐烂病的方法S3中培养液于25℃、180r/min条件下振荡培养7d，利用内生菌防治腐烂病的方法S3中，发酵液经10000r/m离心20min后，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤。
本实施例中，利用内生菌防治腐烂病的方法S3中，发酵液经10000r/m离心20min后，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤利用内生菌防治腐烂病的方法S5中打孔器所用的直径为0.5cm。
本实施例中，利用内生菌防治腐烂病的方法S6中的枝条7d后测量病斑长度，并拍照记录，利用内生菌防治腐烂病的方法S6中每次接种10个孔，重复3次，发病率＝(总接种点数-无病症的接种点数)/总接种点数*100％。
阴性对照例：
选取健康、长势一致当年生梨树枝条，经无菌水清洗干净后，用75％乙醇擦拭消毒，再用无菌水清洗，晾干。用直径为0.5cm的打孔器在枝条打孔，孔深至木质部，用无菌水处理打孔处作为阴性对照，处理后将枝条置于培养箱中保湿2d后，每个孔接种1个直径为0.5cm的梨树腐烂病菌菌饼，再用蘸无菌水的脱脂棉缠绕，外用封口膜缠绕保湿，置于25℃下光照培养箱中培养，7d后测量病斑长度，并拍照。每次接种10个孔，重复3次。发病率＝(总接种点数-无病症的接种点数)/总接种点数*100％。
阳性对照例：
选取健康、长势一致当年生梨树枝条，经无菌水清洗干净后，用75％乙醇擦拭消毒，再用无菌水清洗，晾干。用直径为0.5cm的打孔器在枝条打孔，孔深至木质部。用戊唑醇(安徽省银山药业有限公司)处理枝条打孔处作为阳性对照。处理后将枝条置于培养箱中保湿2d后，每个孔接种1个直径为0.5cm的梨树腐烂病菌菌饼，再用蘸无菌水的脱脂棉缠绕，外用封口膜缠绕保湿，置于25℃下光照培养箱中培养，7d后测量病斑长度，并拍照。每次接种10个孔，重复3次。发病率＝(总接种点数-无病症的接种点数)/总接种点数*100％。
实验例：
选取健康、长势一致当年生梨树枝条，经无菌水清洗干净后，用75％乙醇擦拭消毒，再用无菌水清洗，晾干。用直径为0.5cm的打孔器在枝条打孔，孔深至木质部。分别用内生真菌上清液或分生孢子(108个/mL)喷施处理打孔枝条，处理后将枝条置于培养箱中保湿2d后，每个孔接种1个直径为0.5cm的梨树腐烂病菌菌饼，再用蘸无菌水的脱脂棉缠绕，外用封口膜缠绕保湿，置于25℃下光照培养箱中培养，7d后测量病斑长度，并拍照。每次接种10个孔，重复3次。发病率＝(总接种点数-无病症的接种点数)/总接种点数*100％。
平皿对峙实验：
利用平皿对峙实验，检测分离纯化的内生真菌菌株JK2对梨树腐烂病菌的抑制情况。将梨腐烂病病原菌接种于PDA平板上，在25℃下培养4天，用直径5mm的打孔器打取菌落生长一致的菌块，接种于PDA平板中央，在病菌的上下左右各2cm处接种分离纯化的内生真菌菌株，以只接病原菌为对照，每个处理3个重复，25℃恒温培养。待对照组的病原菌长满整个培养皿后，统计其抑菌率。抑菌率(％)＝(对照菌落直径－处理菌落直径)/对照平板菌落直径×100％。结果显示，内生真菌JK2对梨树腐烂病菌均具有很好的抑制作用(表1)。
表1、内生真菌JK2对梨树腐烂病菌的抑制率
无菌滤液对梨树腐烂病菌的抑制：
用直径5mm的打孔器打取菌落生长一致的菌块，接种于PDA平板中央，在病菌的上下左右各2cm处接种分离纯化的内生真菌菌株，以只接病原菌为对照，每个处理3个重复，25℃恒温培养。待对照组的病原菌长满整个培养皿后，统计直径并计算其抑菌率。结果显示，不同浓度的无菌滤液对梨树腐烂病菌均具有显著的的抑制作用(表2)。
表2、内生真菌JK2滤液对梨树腐烂病菌的抑制率
实验鉴定：
鉴定结果显示，接种梨树腐烂病菌7d后发现，对照水处理的梨树枝条表现出明显的腐烂病病斑症状，而JK2上清液或孢子悬浮液处理的枝条腐烂病发病程度显著降低，阳性对照戊唑醇处理后的枝条无病斑症状(图1)。进一步统计结果发现，与对照处理相比，上清液处理不影响腐烂病的发病率(图2)，但能显著抑制腐烂病病斑扩增(图3)。孢子悬浮液处理枝条发病率约23.33％，平均病斑长度为0.29cm，均显著低于对照(图2～图3)。以上结果表明，内生真菌JK2对梨树腐烂病具有较好的防治潜力。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (8)
1.一种利用内生菌防治腐烂病的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：产紫青霉的制备，将梨树腐烂病发病枝干韧皮部剥离，剪成组织块，投放于75％的乙醇中消毒；将步骤再用1％次氯酸钠消毒，组织经无菌水清洗5次后置于含氨苄青霉素的PDA培养基表面；待组织块周围长出菌丝，挑针挑取菌落边缘菌丝或菌块，转移至新的培养基中进行纯化培养；经单孢纯化后得到单一菌株保存备用；
S2：制备无菌滤液，将内生真菌JK2接种PDA平板上，在25℃下培养7d；用无菌水将孢子洗脱后，用血球计数板统计浓度，并将其调整为108个/mL；接种1mL孢子液于50mL PDB培养基中，获得的发酵液过滤，即得无菌滤液；
S3：制备带毒平板，取无菌滤液与冷却到50℃的PDA培养基混合倒入平板，制成不同浓度(10％和20％)的带毒平板，以无菌水代替无菌滤液与PDA培养基混合；
S4：梨树枝条的选取，选取健康、长势一致当年生梨树枝条，经无菌水清洗干净后，用75％乙醇擦拭消毒，再用无菌水清洗，晾干；
S5：用打孔器在枝条打孔，孔深至木质部；分别用内生真菌上清液或分生孢子(108个/mL)喷施处理打孔枝条，无菌水处理作为阴性对照，戊唑醇处理作为阳性对照；
S6：处理后将枝条置于培养箱中保湿2d后，每个孔接种1个直径为0.5cm的梨树腐烂病菌菌饼，再用蘸无菌水的脱脂棉缠绕，外用封口膜缠绕保湿，置于25℃下光照培养箱中培养。
2.根据权利要求1所述的一种利用内生菌防治腐烂病的方法，其特征在于，所述S1中乙醇消毒时间为1min，且组织块的规格为0.5cm×0.5cm。
3.根据权利要求1所述的一种利用内生菌防治腐烂病的方法，其特征在于，所述S1中次氯酸钠的消毒时间为3min，所述培养基的成分为马铃薯200g·L-1、葡萄糖20g·L-1和琼脂粉15g·L-1；其中氨苄青霉素的含量为100mg·L-1。
4.根据权利要求1所述的一种利用内生菌防治腐烂病的方法，其特征在于，所述S3中培养液于25℃、180r/min条件下振荡培养7d。
5.根据权利要求1所述的一种利用内生菌防治腐烂病的方法，其特征在于，所述S3中，发酵液经10000r/m离心20min后，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤。
6.根据权利要求1所述的一种利用内生菌防治腐烂病的方法，其特征在于，所述S5中打孔器所用的直径为0.5cm。
7.根据权利要求1所述的一种利用内生菌防治腐烂病的方法，其特征在于，所述S6中的枝条7d后测量病斑长度，并拍照记录。
8.根据权利要求1所述的一种利用内生菌防治腐烂病的方法，其特征在于，所述S6中每次接种10个孔，重复3次，发病率＝(总接种点数-无病症的接种点数)/总接种点数*100％。
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|---|---|---|---|---|
| CN114921421A (zh) * | 2022-05-07 | 2022-08-19 | 华中农业大学 | 一种真菌病毒VpFV1、一种弱毒性菌株及其应用 |
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|---|---|---|---|---|
| CN104140938A (zh) * | 2014-07-16 | 2014-11-12 | 新疆农业大学 | 一种防治果树腐烂病的拮抗细菌菌株及其应用 |
| CN105284902A (zh) * | 2015-11-16 | 2016-02-03 | 山西省农业科学院植物保护研究所 | 一种防治苹果树腐烂病的生防菌发酵液的制备方法 |
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| CN114921421B (zh) * | 2022-05-07 | 2023-06-27 | 华中农业大学 | 一种真菌病毒VpFV1、一种弱毒性菌株及其应用 |
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