CN112375688A

CN112375688A - 一种球孢白僵菌及其在生物防治玉米大斑病中的应用

Info

Publication number: CN112375688A
Application number: CN202010729141.2A
Authority: CN
Inventors: 张正坤; 路杨; 李启云; 隋丽; 赵宇; 杜茜; 李乐; 龚巧楠; 常玉明
Original assignee: Jilin Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jilin Hujie Jiamei Technology Development Co ltd
Priority date: 2020-07-27
Filing date: 2020-07-27
Publication date: 2021-02-19
Anticipated expiration: 2040-07-27
Also published as: CN112375688B

Abstract

本发明提出了一种球孢白僵菌，所述球孢白僵菌的16S rDNA含有如SEQ ID NO：1所示的序列，所述球孢白僵菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.19372。本发明利用球孢白僵菌浸种处理玉米种子及灌根处理玉米幼苗，通过球孢白僵菌在玉米植株体内的定植，实现对玉米大斑病发病率的降低，通过控制病害发生增加粮食产量。

Description

一种球孢白僵菌及其在生物防治玉米大斑病中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种球孢白僵菌及其在生物防治玉米大斑病中的应用。

背景技术

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)寄主范围广，是一种有效防治节肢动物害虫的微生物，在全世界范围内已得到广泛应用。近年研究发现，球孢白僵菌对多种土传病原菌和叶部病害病原菌具有一定拮抗能力，是一种双重生防菌。球孢白僵菌能抑制小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)等多种病原菌的生长。在我国, 球孢白僵菌已被广泛应用于亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis Guenée)和马尾松毛虫(Dendrolimus punctatus Walker)等多种大田及林业害虫的防治。近5 年来，仅吉林省每年通过白僵菌制剂防治玉米螟面积就达33万hm²左右。

近年来研究表明球孢白僵菌具有植物内生性，是一种植物内生菌，能够在自然状态下或采用不同人工接种方式定植在植物中。研究表明，球孢白僵菌可以通过种茎基部注射、叶面喷施和花朵喷施等方式接种到植物中，通过这些接种方法，研究者们能够将球孢白僵菌接种到高粱、小麦、番茄和松树等粮食作物、经济作物和林木中。研究证实，球孢白僵菌能从接种部位向周围组织扩散并能够在相当长的一段时间内定植在植物中。

玉米大斑病是一种由大斑病突脐蠕孢Exser ohilumturcicum(Pass.)LeonardetSuggs引起的叶部病害，我国东北玉米种植区分布广、发展快、为害重、防治难的主要病害，每年都有不同程度的发生，使玉米大幅度减产，严重减产50～60％甚至绝收。近年由于全球变暖，病菌越冬基数高，导致土壤含菌量增加，加之多年重茬连作和化学污染，使玉米植株普遍存在毒素，降低玉米抗性，使玉米大斑病有逐年加重的趋势，已成为难以防治的难题。目前，玉米大斑病的主要防治方法主要是栽培抗病品种，施用叶面肥增加抗性，以及利用化学农药进行防治。在玉米大斑病生物防治方面，生防真菌主要是木霉菌，细菌则为芽孢杆菌。未见利用球孢白僵菌内生性进行病害防治的报道。

中国专利申请CN101698828A公开了一种铜绿假单胞菌D10，Pseudomonasaeruginosa D10，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M209104。在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落呈棕色，圆形，有光泽，湿润，边缘整齐，菌落直径0.2～0.5cm，菌体成短杆状，无芽孢。所述铜绿假单胞菌D10抑菌谱广，可抑制玉米大、小斑病，对玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、玉米弯孢叶斑病菌、棉花黄萎病菌、小麦赤霉病菌、香蕉炭疽病菌和香蕉枯萎病菌也均有较强的拮抗作用。

中国专利申请CN101698829A公开了一种枯草芽孢杆菌A16，BacillussubtilisA16，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 209105。该枯草芽孢杆菌A16在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落呈乳白色，形状不规则，无光泽，不湿润，边缘不整齐，菌落直径0.5～1cm，表面有皱褶，菌体成直杆状，芽孢呈椭圆形。该枯草芽孢杆菌A16抑菌谱广，可抑制玉米大、小斑病，对玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、玉米弯孢叶斑病菌、棉花黄萎病菌、小麦赤霉病菌、香蕉炭疽病菌和香蕉枯萎病菌也均有较强的拮抗作用。

尽管已经筛选到一些对玉米大斑病菌具有生防作用的微生物，但还远远不够。一方面，生防中拮抗微生物的多样化使用有利于防止病菌产生抗性，所以对病菌具有拮抗作用的微生物的种类多多益善；另一方面，现有的能够抑制玉米大斑病菌的微生物的拮抗作用还不够理想，需要筛选定植能力和拮抗作用更强的微生物，以使生物防治方法能够更好地满足农业生产中防治玉米大斑病的要求。

发明内容

本发明的目的在于提出一种球孢白僵菌及其在生物防治玉米大斑病中的应用，利用球孢白僵菌浸种处理玉米种子及灌根处理玉米幼苗，通过球孢白僵菌在玉米植株体内的定植，实现对玉米大斑病发病率的降低，通过控制病害发生增加粮食产量。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一种球孢白僵菌，所述球孢白僵菌的16S rDNA含有如SEQ ID NO：1所示的序列，所述球孢白僵菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.19372，分类命名为球孢白僵菌，拉丁文名：Beauveria bassiana，参据的生物材料为BbCSJL1，保存日期为2020年3月18日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址：北京市朝阳区北辰西路 1号院3号。

本发明进一步保护一种球孢白僵菌在玉米大斑病生防中的应用，利用上述的球孢白僵菌抑制玉米大斑病菌，提高玉米植株对玉米螟的抗虫性和对玉米大斑病的抗病能力。

作为本发明的进一步改进，将含有所述球孢白僵菌的菌剂施于玉米植株上，使所述球孢白僵菌在玉米植株上定植，抑制玉米大斑病菌。

作为本发明的进一步改进，将含有所述球孢白僵菌的菌剂浸种处理玉米种子和/或灌根处理玉米幼苗。

作为本发明的进一步改进，所述菌剂为所述球孢白僵菌孢与含有助悬剂的无菌水配成的悬浮液。

作为本发明的进一步改进，所述悬浮液中球孢白僵菌孢的浓度为10⁸～10⁹个孢子/mL(优选1×10⁸个孢子/mL)，所述助悬剂浓度为0.01～0.1％(w/v，优选 0.1％)，所述助悬剂选自吐温-20、吐温-80、曲拉通-X100(可以是所有无毒表面活性剂)中的一种或几种混合。

作为本发明的进一步改进，述浸种处理的方法为将种子表面消毒后，在20～ 25℃，优选为22℃，浸种12～36小时，优选为24h，阴干后播种即可。

作为本发明的进一步改进，所述玉米幼苗处于2～3叶苗期。

作为本发明的进一步改进，所述灌根处理的方法为：在无雨的早上或夜间将 40～60mL(优选50mL)配制好的孢子悬液浇灌到每株玉米幼苗根部。

本发明进一步保护一种生防制剂，为上述的应用中的悬浮液。

本发明具有如下有益效果：本发明的一株球孢白僵菌具有田间防治水稻二化螟和玉米螟，并且提高玉米植株对玉米螟的抗虫和对玉米大斑病的抗病双重生物防治能力，并易于定殖到玉米植株内，为玉米提供持久抗性。本发明利用这株球孢白僵菌对水稻二化螟、玉米螟和玉米大斑病进行生物防治，是一种高效稳定的水稻二化螟、玉米螟和玉米大斑病生物防治方法，其利用了所述球孢白僵菌在玉米种子萌发期、苗期上易于定殖且与玉米共同作用提高了玉米植株对玉米螟和玉米大斑病菌抗性的特点，能够更好地满足农业生产中防治玉米玉米螟和玉米大斑病的要求。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中图1对峙结果图，其中第一列为玉米大斑病菌，第二列为菌株球孢白僵菌菌株BbCSJL1，第三列为两者对峙平板。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1球孢白僵菌菌株BbCSJL1抗病虫活性

1试验材料与方法

1.1供试虫源与菌株

供试水稻二化螟和亚洲玉米螟3龄幼虫为吉林省农业科学院农业生物技术研究中心人工饲养。

菌种分离采用改良的SDAY培养基(1％蛋白胨，1％酵母粉，3％葡萄糖，2％琼脂粉，0.1％蝉蜕粉，pH7.0)。

1.2方法

1.2.1玉米螟和水稻二化螟僵虫采集方法

2018年9月在吉林省长春市双阳区双营乡尹家村、吉林市岔路河镇南崴子村、松原市乾安县腾字村等地采集玉米螟与水稻二化螟僵虫，每头僵虫独立分装并标记。

1.2.2白僵菌菌株分离与选育方法

僵虫分离：无菌条件下，0.1％(v/v)H₂O₂对玉米螟僵虫和水稻二化螟僵虫虫体表面消毒3min，无菌水洗涤3次，然后置于改良SDAY固体培养基中央， 25℃培养8～10d，观察、记录。

单孢分离与纯化：用10μL移液器枪头沾取僵虫附近长出的菌丝，然后转接到改良SDAY固体培养基中，25℃培养7d，观察菌种生长情况；

斜面选育：选择生长状态好的单孢接种至改良SDAY固体斜面培养基中， 25℃培养7d，观察菌种生长情况。

1.2.3白僵菌产孢量测定

采用液固两相发酵获得白僵菌分生孢子。首先，液体发酵采用改良SDY培养液(1％蛋白胨，1％酵母粉，3％葡萄糖，0.1％蝉蜕粉，pH值7.0)。然后将50mL 发酵液喷洒到经灭菌处理的500g麦麸上，阴凉处继续培养20d，麦麸表面变为白色后用振荡过滤筛收集孢子，并对收集的分生孢子含量进行测定，每个处理重复3次。

1.2.4白僵菌气生孢子萌发率测定方法

制备浓度为10⁸个孢子/mL的孢子悬液，取1mL接种到定量改良SDY液体培养基中，25℃震荡培养12h，显微镜下用血球计数版对萌发的孢子进行计数，计算萌发率。

萌发率＝(萌发孢子总数/孢子总数)×100％

1.2.5球孢白僵菌菌株BbCSJL1孢子对玉米螟幼虫毒力测定方法

采用浸渍法测定球孢白僵菌菌株BbCSJL1对亚洲玉米螟的致病力。将球孢白僵菌菌株BbCSJL1孢子用0.01％(v/v)吐温-80稀释成1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹个孢子/mL共3种不同浓度的孢子悬液，将室内饲养龄期一致的敏感3龄幼虫浸渍于10mL上述3个浓度梯度孢子悬浮液的无菌培养皿中，每个浓度处理50头， 3次重复。浸渍10s后将幼虫转移到滤纸上，吸干体表多余液体再接入含有无菌饲料离心管中，对照处理为吐温-80的无菌蒸馏水浸渍。培养及调查方法同上。 3d后后开始调查死虫数、僵虫数，以后每24h调查1次，连续调查8d。

1.2.6球孢白僵菌菌株BbCSJL1孢子对水稻二化螟幼虫毒力测定方法

采用浸渍法测定球孢白僵菌菌株BbCSJL1对水稻二化螟的致病力。将球孢白僵菌菌株BbCSJL1孢子用0.01％(v/v)吐温-80稀释成1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹个孢子/mL共3种不同浓度的孢子悬液，将室内饲养龄期一致的敏感3龄幼虫浸渍于10mL上述3个浓度梯度孢子悬浮液的无菌培养皿中，每个浓度处理50头， 3次重复。浸渍10s后将幼虫转移到滤纸上，吸干体表多余液体再接入含有无菌饲料离心管中，对照处理为吐温-80的无菌蒸馏水浸渍。培养及调查方法同上。 3d后后开始调查死虫数、僵虫数，以后每24h调查1次，连续调查8d。

2试验结果

2.1水稻二化螟僵虫采集情况

为了采集野生的对鳞翅目害虫具有光谱杀虫活性的白僵菌菌株，本试验选取未防治的玉米田和稻田作为采集地，共采集到僵虫17头，具体情况见下表：

表1僵虫采集情况

采集地点	玉米螟僵虫	水稻二化螟僵虫
			双阳区双营乡尹家村	4	4
吉林市岔路河镇南崴子村	5	2
			松原市乾安县腾字村	1	1

2.2白僵菌菌株分离情况

通过单孢分离和斜面培养，获得菌落边界光滑、孢子层厚、菌落中间无次生菌丝菌株5株，分别为BbOFSY1、BbOFSY3、BbCSSY4、BbOFJL2和BbCSJL1 (OF代表从玉米螟僵虫分离的菌株，CS代表从水稻二化螟僵虫分离得到的菌株， SY代表双阳，JL代表吉林市)。

2.3白僵菌气生孢子萌发率情况

结果表明，BbCSJL1产孢量最高，为4.66×10¹⁰亿个孢子/g发酵物；BbCSSY4 产孢量其次，为2.29×10¹⁰亿个孢子/g发酵物；BbOFSY1产孢量为2.06×10¹⁰亿个孢子/g发酵物。BbOFJL2和BbOFSY3产孢量相对较低：BbOFJL2产孢量为 8.61×10⁹亿个孢子/g发酵物BbOFSY3产孢量最低，为1.97×10⁹亿个孢子/g发酵物。

2.4白僵菌气生孢子萌发率

球孢白僵菌菌株BbCSJL1、BbCSSY4、BbOFSY1、BbOFJL2和BbOFSY3孢子萌发率分别为95.81％、93.33％、92.51％、90.09％和88.10％。

2.5对害虫毒力测定

2.5.1对玉米螟毒力

孢子悬液杀虫毒力研究表明，5个菌株接种5d后，玉米螟幼虫开始大量死亡，其中球孢白僵菌菌株BbCSJL1菌株毒力表现突出，具体见下表：

表2不同白僵菌菌株对玉米螟毒力测定

菌株	LC<sub>50</sub>(个/mL)	LT<sub>50</sub>(h)
			BbOFSY1	4.78×10<sup>8</sup>	130.71
BbOFSY3	9.19×10<sup>8</sup>	140.62
			BbCSSY4	9.71×10<sup>7</sup>	108.44
BbCSJL1	3.50×10<sup>7</sup>	99.86
			BbOFJL2	3.17×10<sup>8</sup>	129.81

2.5.1对水稻二化螟毒力

孢子悬液杀虫毒力研究表明，5个菌株接种5d后，水稻二化螟幼虫开始死亡，其中分离自水稻二化螟的两株菌球孢白僵菌菌株BbCSJL1和BbCSSY4毒力均比分离自玉米螟3个菌株毒力高，具体见下表：

表3不同白僵菌菌株对水稻二化螟毒力测定

由此可见，从水稻二化螟僵虫表面分离得到的菌株球孢白僵菌菌株BbCSJL1 具有较好广谱杀虫活性、产孢能力、孢子萌发率和毒力。

实施例2球孢白僵菌菌株BbCSJL1对玉米大斑病菌抑制效果

1材料与方法

1.1培养基

PDA培养基购自青岛海博生物技术有限公司

1.2对峙培养

采用平板对峙培养检测球孢白僵菌菌株BbCSJL1对玉米大斑病菌抑制效果，将两种菌的菌饼分别接种到PDA培养基两侧，间距5cm，25℃培养5d。记录并观察两种菌各自生长情况及菌落直径。

2结论

对峙培养结果表明，菌株球孢白僵菌菌株BbCSJL1对玉米大斑病菌没有明显的抑制作用，见图1。

实施例2菌株球孢白僵菌菌株BbCSJL1提高玉米植株对玉米大斑病抗性

1材料和方法

1.1试验材料

本试验使用的玉米品种为B73，本研究使用的球孢白僵菌菌株为球孢白僵菌菌株BbCSJL1。

1.2试验设计

本研究采取随机区组试验设计，盆栽控制试验。试验设置8个处理，分别为自然条件下及人工接种条件下，每个处理5个重复，每个重复10株玉米。用0.1％ (v/v)Tween-80溶液配置球孢白僵菌孢悬液，浓度为1×10⁸个孢子/mL。选取颗粒大小均一的玉米种子，将种子表面消毒后备用。播种花盆规格为直径288 (mm)×高378(mm)，栽培基质选用丹麦品氏托普商品草炭土，1株/盆。

表3各处理所采用的接菌方法

1.3球孢白僵菌在玉米组织内的定殖

待玉米幼苗三次灌根结束后，分别取各处理的玉米最顶端完全展开的叶片，每处理取1片叶子，使用PDA平板检测法对球孢白僵菌在玉米植株的定殖率进行定性检测。首先对样品进行表面消毒，即采用70％(v/v)乙醇溶液浸泡30s，其次使用1％(v/v)次氯酸钠溶液浸泡30s，最后用无菌水清洗3次，每个平板均匀摆放4块样品，26℃暗培养。5d后观察并记录植物组织上菌体生长情况。

1.4玉米大斑病病害发生调查

在玉米蜡熟期，对玉米总株数、病株数，计算病株率、防治效果进行调查。计算方法如下：

其中，CK—对照组病株率，

PT—处理组病株率。

1.5数据统计分析及测序数据处理

采用SPSS 26.0软件对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，描述性统计及方差齐性检测，并通过Duncan氏方法进行多重比较及显著性分析，利用Sigmaplot12.5软件做图。

2结果

2.1玉米大斑病发病率调查结果

结果表明，两个对照组(JZ-CK和GG-CK)中玉米植株自然发病程度较低，发病率为18.66％和16.66％，而经过菌株球孢白僵菌菌株BbCSJL1浸种(JZ-Bb) 和灌根(GG-Bb)两个处理组的发病程度明显降低，病株率仅为4.33％和4.76％，防效分别为76.71％和71.42％。

表4自然发生的玉米大斑病病害发生调查统计结果

人工接种玉米大斑病菌可显著提高玉米植株大斑病的发病率，两个人工接种对照组(JZ-CK-EO和GG-CK-EO)中玉米植株发病较重，发病率为69.76％和 66.67％，经过菌株球孢白僵菌菌株BbCSJL1浸种(JZ-Bb-EO)和灌根(GG-Bb-EO) 两个处理组的发病率明显降低，病株率仅为41.67％和40.48％，防效分别为40.39％和39.28％。

表5人工接种玉米大斑病病害调查统计结果

处理	病株率/％	校正发病率/％
			JZ-CK-EO	81.67	69.76
JZ-Bb-EO	55.33	41.67
			校正防效		40.39
GG-CK-EO	83.33	66.67
			GG-Bb-EO	57.14	40.48
校正防效		39.28

该结果表明，在自然发生情况下，白僵菌接种能够降低大斑病发病率，防效达71.42％；在人工接种大斑病的条件下，利用白僵菌处理能够显著降低大斑病发病率达39.28％。

实施例3球孢白僵菌菌株BbCSJL1提高玉米植株对玉米螟抗性

1材料与方法

1.1试验材料

供试菌粉：采用液固两相发酵获得球孢白僵菌菌株BbCSJL1孢子粉，孢子粉含水量约为10％，孢子萌发率95％，孢子含量6.0×10¹¹个/g。

Tween-80购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

本试验使用的玉米品种为垦黏一号。

1.2试验方法

玉米种子表面消毒：70％(v/v)乙醇溶液浸泡30s，其次使用1％(v/v) 次氯酸钠溶液浸泡30s，最后用无菌水清洗3次。

浸种处理：采用1×10⁸孢子/mL球孢白僵菌孢悬液将表面消毒后的种子浸种处理24h，然后将种子转移到滤纸上，阴干后待用。

灌根处理：将表面消毒后的种子播种，在每株二叶一心期玉米幼苗沿根基部分别浇灌50mL 1×10⁸孢子/mL球孢白僵菌孢悬液。

试验设计：试验共设3个处理，分别为浸种处理组、灌根处理组和空白对照组。每小区面积为100m²(10m×10m)，间设200m隔离带。每个处理重复5 次。

1.3调查方法

七月中旬进行剖秆调查自然发生一代玉米螟危害情况，每个重复调查100株，采取5点取样法进行调查，每点调查20株，分别记录活虫数。以虫口减退率作为防效指标，虫口减退率＝(对照活虫数-处理活虫数)/对照活虫数×100％。

2试验结果

在玉米收获前对应用球孢白僵菌菌株BbCSJL1浸种处理组、灌根处理组和对照组试验田进行了被害株数、蛀孔数、活虫数和僵虫数调查。结果表明，浸种处理组中每百株活虫数分别为4.1头，灌根处理组每百株活虫数为3.8头，而对照组每百株活虫数为7.9头，以虫口减退率计算，浸种处理组和灌根处理组防效为48.10％和56.96％。

与现有技术相比，本发明的一株球孢白僵菌具有田间防治水稻二化螟和玉米螟，并且提高玉米植株对玉米螟的抗虫和对玉米大斑病的抗病双重生物防治能力，并易于定殖到玉米植株内，为玉米提供持久抗性。本发明利用这株球孢白僵菌对水稻二化螟、玉米螟和玉米大斑病进行生物防治，是一种高效稳定的水稻二化螟、玉米螟和玉米大斑病生物防治方法，其利用了所述球孢白僵菌在玉米种子萌发期、苗期上易于定殖且与玉米共同作用提高了玉米植株对玉米螟和玉米大斑病菌抗性的特点，能够更好地满足农业生产中防治玉米玉米螟和玉米大斑病的要求。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种球孢白僵菌，其特征在于，所述球孢白僵菌的16S rDNA含有如SEQ ID NO：1所示的序列，所述球孢白僵菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.19372。

2.一种球孢白僵菌在玉米大斑病生防中的应用，其特征在于，利用权利要求1所述的球孢白僵菌抑制玉米大斑病菌，提高玉米植株对玉米螟的抗虫性和对玉米大斑病的抗病能力。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，将含有所述球孢白僵菌的菌剂施于玉米植株上，使所述球孢白僵菌在玉米植株上定植，抑制玉米大斑病菌。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，将含有所述球孢白僵菌的菌剂浸种处理玉米种子和/或灌根处理玉米幼苗。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述菌剂为所述球孢白僵菌孢与含有助悬剂的无菌水配成的悬浮液。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述悬浮液中球孢白僵菌孢的浓度为10⁸～10⁹个孢子/mL(优选1×10⁸个孢子/mL)，所述助悬剂浓度为0.01～0.1％(w/v，优选0.1％)，所述助悬剂选自吐温-20、吐温-80、曲拉通-X100(可以是所有无毒表面活性剂)中的一种或几种混合。

7.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述浸种处理的方法为将种子表面消毒后，在20～25℃，优选为22℃，浸种12～36小时，优选为24h，阴干后播种即可。

8.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述玉米幼苗处于2～3叶苗期。

9.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述灌根处理的方法为：在无雨的早上或夜间将40～60mL(优选50mL)配制好的孢子悬液浇灌到每株玉米幼苗根部。

10.一种生防制剂，其特征在于，为权利要求5或6所述的应用中的悬浮液。