CN112646748B - 源自枣树链霉菌属zh-356、菌剂及制备方法和应用 - Google Patents

源自枣树链霉菌属zh-356、菌剂及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了源自枣树的链霉菌属ZH‑356、菌剂及制备方法和应用，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No：M2020690。本发明的菌株为放线菌，培养时间短，繁殖速度快，发酵后可产生黑色素，其菌体和胞内活性提取物具有抑制植物病原真菌的功能。经过实验验证，链霉菌属ZH‑356菌体和胞内活性提取物对多种植物病原真菌具有抑制作用，特别是对苹果树腐烂病菌有极强的抑制能力。本发明还提供了链霉菌属ZH‑356的胞内活性提取物以及该胞内活性提取物的制备方法，本发明中的胞内活性提取物来源于链霉菌属ZH‑356的细胞内，且对温度及其酸碱条件具有极强的稳定性。

Description

源自枣树链霉菌属ZH-356、菌剂及制备方法和应用
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及源自枣树链霉菌属(Streptomycessp.)ZH-356，还涉及ZH-356的菌剂、ZH-356的活性提取物及其制备方法和应用。
背景技术
植物病害严重地制约了我国农作物产业的发展，尤其一些病害给种植户带来了巨大的经济损失。目前，农作物的防治主要还是依靠化学试剂，但是随着时代的进步，人们对健康问题越来越重视，饮食方面更注重安全绿色。因此，化学试剂的使用受到严重制约，寻找高效安全的植物病害防治方法已经迫在眉睫。生物防治具有无毒、无污染、不易产生抗性等优点，已成为多种植物病害的安全有效防治方法之一。近年来，使用微生物制作生物制剂对植物病害进行防治，受到越来越多的关注。
生防制剂的主要活性物质大多数都是来自于微生物所产生的次级代谢物。其中，黑色素是一种生物界普遍存在的，具有防止蛋白质降解、光子屏蔽、化学保护等作用，特别对紫外线和辐射具有抵抗性。比如，黑色素对晶体蛋白起到明显的紫外线保护作用,因此将多种特定目的杀虫晶体蛋白基因导入黑色素产生菌，使得构建广谱、高效、持久生物杀虫剂成为可能。另外，微生物在特定环境下也会产生黑色素，对其自身所产生的次级代谢物也起到保护作用。因此，筛选兼具生防和产黑色素特性的微生物功能菌株在植物病害防治方面具有非常重要的经济和生态价值。
目前，从微生物中已经发现了22500种生物活性物质，其中70％都是由放线菌产生。其中的链霉菌一直被认为是产生各种抗生素的主要来源。根据遗传多样性分析表明，链霉菌属能产生上万种抗生素，如链霉素、金霉素、四环素、巴龙霉素、丝裂霉素等重要抗生素。虽然链霉菌最初只在医药方面应用，但随着其对生态环境影响小、污染少等特点而在农业方面得到了广泛的应用。许多研究证实链霉菌在植物病虫草害的生物防治方面作用显著，具有良好的应用前景。
发明内容
本发明的第一个目的是提供源自枣树的链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356，发酵后可产生黑色素，其菌体对植物病原真菌具有极强的抑制活性。
本发明的第二个目的是提供上述链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356的胞内活性提取物。
本发明的第三个目的是提供一种由上述链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356得到的菌剂。
本发明的第四个目的在于提供上述链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356的胞内活性提取物的制备方法。
本发明的第五个目的是提供上述链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356的菌体在植物病原真菌生物防治中的应用。
本发明的第六个目的是提供上述链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356的胞内活性提取物在植物病原真菌生物防治中的应用。
本发明所采用的第一种技术方案是，源自枣树的链霉菌属ZH-356，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2020690，保藏日期：2020年11月6日。
本发明所采用的第二种技术方案是，一种胞内活性提取物，该胞内活性提取物是在链霉菌属ZH-356的胞内提取。
本发明所采用的第二种技术方案的特点还在于，链霉菌属ZH-356在发酵培养时产生的活性物质只在胞内积累，并不会分泌至胞外，而当链霉菌属ZH-356遭遇植物病原真菌时，才会分泌活性物质以抑制植物病原真菌的生长。
本发明所采用的第三种技术方案是：一种用于生物防治的菌剂，菌剂的活性成分主要为链霉菌属ZH-356的菌体或胞内活性提取物，菌剂可采用颗粒、粉末、片剂固体外形或是液体、糊状、胶状、膏状流体形式。
本发明所采用的第四种技术方案是：链霉菌属ZH-356的胞内活性提取物的制备方法，具体包括以下制备步骤：
步骤1，种子液的制备；
将链霉菌属ZH-356接种至种子培养基中，在28℃～30℃、180r/min～200r/min振荡条件下培养1d～2d，得到种子液；
步骤2，发酵培养；
将步骤1得到的种子液接入发酵培养基中，接种量为5％～7％，在28℃～30℃、180r/min～200r/min振荡条件下培养6d～7d，得到发酵液；
步骤3，胞内活性提取物的制备；
将步骤2中得到的发酵液通过离心收集菌体，将菌体用丙酮浸泡1d，离心收集丙酮提取液，沉淀使用丙酮浸泡，并用超声波辅助提取，离心收集丙酮提取液，重复三次，直至丙酮提取液为无色透明，合并丙酮提取液，使用旋转蒸发仪浓缩挥干后，即得到胞内浓缩物，该胞内浓缩物即为胞内活性提取物。
本发明所采用的第四种技术方案的特点还在于，
步骤1中种子培养基由以下重量配比的物质组成：胰蛋白胨17.0g/L～22.0g/L，大豆蛋白胨3.0g/L～8.0g/L，氯化钠5.0g/L～7.5g/L，磷酸氢二钾2.5g/L～3.5g/L，葡萄糖2.5g/L～3.5g/L，pH为7.2～7.3，溶剂为水。
步骤2中发酵培养基由以下重量配比的物质组成：碳源10.0g/L～15.0g/L，有机氮源5.0g/L～8.0g/L，无机氮源5.0g/L～8.0g/L，天冬酰胺1.0g/L～2.0g/L，甜菜碱1.25g/L～2.0g/L，pH为7.1～7.3，溶剂为水。
步骤2中碳源为甘油、大米粉、黄豆饼粉、淀粉、花生饼粉、棉子饼粉、玉米浆、鱼粉、蚕蛹粉、麸皮、燕麦粉或纤维素中的任意一种；有机氮源为酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白或牛肉膏中任意一种；无机氮源为硝酸盐、氨水或铵盐中任意一种。
本发明所采用的第五种技术方案是：链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356的菌体可用于制备抗植物病原真菌的生物制剂以及在植物真菌病害防治中的应用。
本发明所采用的第六种技术方案是：链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356的胞内活性提取物可用于制备抗植物病原真菌的生物制剂以及在植物真菌病害防治中的应用。
本发明的有益效果是：本发明提供了一株对植物病原真菌具抑制作用，特别是对苹果树腐烂病菌(Valsa mali)具有极强抑制作用的链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356，还提供了利用该菌株发酵生产抗菌活性提取物的方法，并进一步利用链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356的菌体和胞内活性提取物制备用于防治植物病原真菌病害的菌剂，从而为植物真菌病害的防治提供了一种新的生物制剂。
本发明的链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356的优点如下：
1、对4种植物病原真菌有极强的抑制作用；
2、生长繁殖快，培养周期短，发酵7d即可用于制备菌剂；
3、链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356在发酵培养时，所产生的活性物质只在细胞内积累，并不会分泌至胞外；而当链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356遭遇植物病原真菌时，才会分泌活性物质以抑制植物病原真菌的生长。
4、链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356在发酵培养基中发酵培养的后期会产生黑色素，可对活性物质起到保护作用；
5、链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356的胞内活性物质对热、酸碱具有极强的稳定性，便于后续的分离纯化、应用及储藏；
6、链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356的菌体以及其胞内活性提取物对苹果树腐烂病等植物真菌病害具有极强的防治作用。
综上，链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356是理想的研究、改造应用的出发材料菌株。在抑制植物病原真菌，生产生物农药和生物菌肥等领域具有实现工业化生产的极大可能，并具有广阔的工农业应用范围和市场前景。
附图说明
图1是本发明链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356在高氏I号固体培养基上的菌落照片(2d和5d)；
图2是本发明链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356在胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)固体培养基上的菌落照片；
图3是本发明链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356在LB固体培养基上的菌落照片；
图4是本发明链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356在发酵固体培养基上的菌落照片；
图5是本发明链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356菌株在不同液体培养基中的培养照片；
图6是本发明链霉菌株(Streptomyces sp.)ZH-356基于16S rDNA序列构建的系统发育树；
图7是本发明链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356的菌体及发酵液提取物抑制植物病原真菌效果图；
图8是本发明链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356的发酵上清浓缩液及胞内活性提取物抑制植物病原真菌效果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
本发明链霉菌属ZH-356的筛选分离过程为：
链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356是从陕北地区的枣树中分离得到；将采集到的枣树枝条在120℃下加热1h后，剪碎，接种在含有775μg/mL重铬酸钾和2μg/mL青霉素的100mL筛选平板上，倒置，在30℃下恒温培养，待菌落长出后，经过三次划线后，分离出单菌落，将得到的纯菌株接种到斜面筛选培养基上，即为链霉菌属ZH-356；其中筛选培养基由以下重量配比的物质组成：甘油10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，硝酸钾5.0g/L，天冬酰胺1.0g/L，甜菜碱1.25g/L，琼脂粉15.0g/L，pH为7.2，溶剂为水；
本发明分离得到的链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC No：M2020690，保藏日期：2020年11月6日。
本发明链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356的特征为：
(1)形态特征：
链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356在高氏I号固体培养基上的菌落密集成褶皱状，如图1所示。菌株培养2d时呈白色，5d左右变为黑色，菌体绒毛状，坚实、干燥，质地致密而不易挑起，可产生黑色素，使菌落和培养基变黑；链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356在胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)固体培养基上的菌落如图2所示，较小而不蔓延，呈圆形、光平、黄色、菌落起初表面光滑、后面逐渐形成褶皱，犹如四叶草形，菌落坚实、质地致密而不易挑起；链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356在LB固体培养基上的菌落如图3所示，菌落较大，呈圆形，黄色，表面具有微绒毛，质地坚硬而不易挑起：链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356在发酵固体培养基上的菌落，如图4所示，菌落较小而密集，不产生黑色素，起初表面光滑，后表面具微绒毛，且逐渐形成褶皱，形如四叶草，菌落坚硬而不易被挑起。在不同液体培养基中生长形态也不同，如图5所示，图5(a)是链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356在高氏I号液体培养基中的生长状况，图5(b)是链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356在TSB液体培养基中生长状况，图5(c)是链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356在LB液体培养基中的生长状况，图5(d)是链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356在液体发酵培养基中的生长状况。培养3d时，链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356在高氏I号液体培养基中开始产生色素，到7d时产生的色素完全变黑，致使培养基变为黑色；培养5d时，链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356在液体发酵培养基中开始产生色素，到7d时产生的色素为黑褐色，导致培养基变为黑褐色。即链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356在高氏I号液体培养基和液体发酵培养基的发酵培养后期会产生色素，且色素颜色分别为黑色和黑褐色，导致培养液变成黑色和黑褐色，而在TSB和LB中则不会产生黑色素。
(2)16S rDNA序列鉴定：
用于扩增细菌16S rDNA的引物分别为：
27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；
1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；
PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min，95℃50s，55℃50s、72℃90s，31个循环；72℃完全延伸10min；PCR扩增结束后，将PCR产物利用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳分析；将经纯化回收约1500bp左右的PCR产物与载体pMD19-T连接后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞；挑取阳性转化子送至上海生工生物工程有限公司测定；获得的16S rDNA序列，序列如SEQ IDNO：1所示，将该序列在EzTaxon(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net)上进行序列相似性搜索和比对，发现该菌株与链霉菌属(Streptomyces)菌株具有非常高的相似度，说明该菌株属于链霉菌属，利用BioEdit和MEGA 7.0软件邻接法构建系统发育树，发现该菌株与Streptomyces rectiviolaceus NRRL B-16374(T)相似度为99.02％，如图7所示，因此将该菌株命名为链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356。
一种用于生物防治的菌剂，菌剂的活性成分主要为链霉菌属ZH-356的菌体或胞内活性提取物，菌剂可采用颗粒、粉末、片剂固体外形或是液体、糊状、胶状、膏状流体形式。
上述菌剂的制备方法，具体按照以下步骤进行：
将发酵后的发酵液、其离心收集的菌体或从中提取的胞内活性提取物分别与水、凡士林、液体石蜡、草炭、动物的粪便、各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生皮等辅料中的一种或多种混合制成菌剂，该菌剂根据使用情况可采用颗粒、粉末、片剂等固体外形或是液体、糊状、胶状、膏状等流体形式用于对植物真菌病害的防治。
本发明胞内性提取物的制备方法，具体按照以下步骤制备：
步骤1，种子液的制备；
将链霉菌属ZH-356接种至种子培养基中，在28℃～30℃、180r/min～200r/min振荡条件下培养1d～2d，得到种子液；
种子培养基由以下重量配比的物质组成：胰蛋白胨17.0g/L～22.0g/L，大豆蛋白胨3.0g/L～8.0g/L，氯化钠5.0g/L～7.5g/L，磷酸氢二钾2.5g/L～3.5g/L，葡萄糖2.5g/L～3.5g/L，pH为7.2～7.3，溶剂为水。
步骤2，发酵培养；
将步骤1得到的种子液接入发酵培养基中，接种量为5％～7％，在28℃～30℃、180r/min～200r/min振荡条件下培养6d～7d，得到发酵液；
发酵培养基由以下重量配比的物质组成：碳源10.0g/L～15.0g/L；有机氮源5.0g/L～8.0g/L，无机氮源5.0g/L～8.0g/L，天冬酰胺1.0g/L～2.0g/L，甜菜碱1.25g/L～2.0g/L，pH为7.1～7.3，溶剂为水。
碳源为甘油、大米粉、黄豆饼粉、淀粉、花生饼粉、棉子饼粉、玉米浆、鱼粉、蚕蛹粉、麸皮、燕麦粉或纤维素中的任意一种；有机氮源为酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白或牛肉膏中任意一种；无机氮源为硝酸盐、氨水或铵盐中任意一种。
步骤3，胞内活性提取物的制备；
将步骤2中得到的发酵液通过离心收集菌体，将菌体用丙酮浸泡1d，离心收集丙酮提取液，沉淀使用丙酮浸泡，并用超声波辅助提取，离心收集丙酮提取液，重复三次，直至丙酮提取液为无色透明，合并丙酮提取液，使用旋转蒸发仪浓缩挥干后，即得到胞内浓缩物，该胞内浓缩物即为胞内活性提取物。
实施例1
该链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356的胞内活性提取物制备方法，具体包括以下步骤：
步骤1，种子液的制备；
将链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356接种至种子培养基中，在30℃、200r/min振荡条件下培养2d，得到种子液。
其中，该种子培养基由以下重量配比的物质组成：胰蛋白胨17g/L，大豆蛋白胨3g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，pH为7.2，溶剂为水。
步骤2，发酵培养；
将步骤1得到的种子液接入发酵培养基中，接种量为5％，在30℃、200r/min振荡条件下培养7d，得到发酵液。
其中，发酵培养基由以下重量配比的物质组成：甘油10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，硝酸钾5.0g/L，天冬酰胺1.0g/L，甜菜碱1.25g/L，pH为7.1，溶剂为水。
步骤3，胞内活性提取物的制备；
将步骤2中得到的发酵液通过离心收集菌体；将菌体用丙酮浸泡1d，离心收集丙酮提取液，而离心后的沉淀再次用丙酮浸泡，并用超声波辅助提取，离心收集丙酮提取液(重复三次，直至丙酮提取液变为无色透明)，合并丙酮提取液，使用旋转蒸发仪浓缩挥干后，即得到胞内浓缩物，该胞内浓缩物即为链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356的胞内活性提取物；
实施例2
该链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356的胞内活性提取物的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤1，种子液的制备；
将链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356接种至种子培养基中，在28℃、180r/min振荡条件下培养1d，得到种子液。
其中，该种子培养基由以下重量配比的物质组成：胰蛋白胨22.0g/L，大豆蛋白胨8.0g/L，氯化钠7.5g/L，磷酸氢二钾3.5g/L，葡萄糖3.5g/L，pH为7.3，溶剂为水。
步骤2，发酵培养：
将步骤1得到的种子液接入发酵培养基中，接种量为7％，在28℃、180r/min振荡条件下培养6d，得到发酵液。
其中，发酵培养基由以下重量配比的物质组成：大米粉15.0g/L，酵母提取物8.0g/L，硝酸钾8.0g/L，天冬酰胺2.0g/L，甜菜碱2.0g/L，pH为7.3，溶剂为水。
步骤3，胞内活性提取物的制备；
将步骤2中得到的发酵液通过离心收集菌体；将菌体用丙酮浸泡1d，离心收集丙酮提取液，而离心后的沉淀再次用丙酮浸泡，并用超声波辅助提取，离心收集丙酮提取液(重复三次，直至丙酮提取液变为无色透明)，合并丙酮提取液，使用旋转蒸发仪浓缩挥干后，即得到胞内浓缩物，该胞内浓缩物即为链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356的胞内活性提取物；
链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356菌体及发酵液活性提取物对植物病原真菌的拮抗作用，采用平板对峙法进行测试：
将实施例2步骤2中得到的发酵液通过离心，分别收集发酵上清液及菌体；上清液中加入1-2倍体积的丙酮，然后使用旋转蒸发仪浓缩去除绝大部分溶剂后，即得到上清浓缩液；菌体用丙酮浸泡1d，离心收集丙酮提取液，而离心后的沉淀再次用丙酮浸泡，并用超声波辅助提取，离心收集丙酮提取液(重复三次，直至丙酮提取液变为无色透明)，合并丙酮提取液，使用旋转蒸发仪浓缩挥干后，即得到胞内浓缩物；将得到上清浓缩液和胞内浓缩物合并，即为发酵液活性提取物。
用对称法在PDA平板背面做标记，中心位置接倒置的不同真菌菌饼(d＝5mm)，真菌分别为：苹果树腐烂病菌(Valsa mali Miyabe et Yamada)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、小麦根腐病菌(Bipolaris sorokinianum)和番茄早疫病菌(Alternariasolani Sorauer)。每组PDA平板各4个。
采用对称法将链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356的菌饼(d＝5mm)放在供试真菌菌饼的一侧，另一侧放培养基对照，进行平板对峙实验；将链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356的发酵液活性提取物用甲醇溶解，使用灭菌后的打孔器(d＝5mm)在供试真菌菌饼两侧25mm处各对称地打一个孔，一侧添加发酵液活性提取物，另一侧则为溶剂空白对照，进行平板对峙实验。结果如图6所示，图6中供试真菌1为苹果树腐烂病菌，2为小麦赤霉病菌，3为小麦根腐病菌，4为番茄早疫病菌。A为链霉菌属ZH-356菌体与供试真菌的对峙实验，左侧为培养基对照，右侧为链霉菌属ZH-356菌饼；B为链霉菌属ZH-356发酵液活性提取物与供试真菌的对峙实验，左侧为溶剂空白对照，右侧为发酵液活性提取物；C为供试真菌的对照组。由图7可知：无论是菌体还是发酵液活性提取物，链霉菌属ZH-356对四种供试植物病原真菌均有显著抑制效果。
链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356活性物质的分泌测试；
将实施例2步骤2中得到的发酵液通过离心，分别收集发酵上清液及菌体；上清液中加入1-2倍体积的丙酮，然后使用旋转蒸发仪浓缩去除绝大部分溶剂后，即得到上清浓缩液；菌体用丙酮浸泡1d，离心收集丙酮提取液，而离心后的沉淀再次用丙酮浸泡，并用超声波辅助提取，离心或过滤收集丙酮提取液(重复三次，直至丙酮提取液变为无色透明)，合并丙酮提取液，使用旋转蒸发仪浓缩挥干后，即得到胞内浓缩物，该胞内浓缩物即为胞内活性提取物。
将上述得到的部分上清浓缩液和胞内浓缩物分别使用丙酮溶解，采用打孔法对上清浓缩液和胞内活性提取物进行真菌拮抗实验，以丙酮为对照，供试真菌为苹果树腐烂病菌(Valsa mali Miyabe et Yamada)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、小麦根腐病菌(Bipolaris sorokinianum)和番茄早疫病菌(Alternaria solani Sorauer)。
测试结果如图8所示，图8中供试真菌为苹果树腐烂病菌、小麦赤霉病菌、小麦根腐病菌和番茄早疫病菌；1为丙酮、2为上清浓缩液、3为胞内活性提取物。上清浓缩液及丙酮对供试真菌均没有拮抗作用，而胞内活性提取物对供试真菌有极强的拮抗作用。同时，由于没有经过浓缩的发酵培养物经0.22μm微孔滤膜过滤后得到的无细胞上清液对供试真菌也没有拮抗作用(图片未展示)，这排除了丙酮浓缩对上清液活性的影响，因此，这些结果表明在发酵培养期间链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356所产生的活性物质只在胞内积累，并不会分泌至胞外。然而，图7中链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356的菌体对供试真菌却具有拮抗作用，这表明当链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356遭遇植物病原真菌时，才会分泌拮抗活性物质以抑制植物病原真菌的生长。
链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356胞内活性提取物的稳定性测试，采用平板对峙法进行测试：
制备PDA平板，用对称法在PDA平板背面做标记，平板中心位置接倒置的供试真菌菌饼(d＝5mm)，菌饼两侧25mm处使用灭菌后的打孔器(d＝5mm)打孔。将链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356菌株的胞内活性提取物用甲醇溶解，以苹果树腐烂病菌为指示菌，将胞内活性提取物质分别在50、60、70、80、90、100℃温度下处理30min，使用1mol/L HC1和1mol/L NaOH将胞内活性提取物分别调至2、4、6、8、10、12等不同pH值，采用1mol/L HC1和1mol/L NaOH作为对照，每孔各添加200μL样品，每个处理3个重复，进行胞内活性提取物稳定性分析。
如表1所示，链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356的胞内活性提取物经过不同温度处理后，其活性依旧存在，且活性大小没有发生显著变化。如表2所示，在不同pH中，只有pH为2和4的胞内活性提取物的拮抗作用降低，其余均没有差异，该测试结果表明链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356的胞内活性提取物对温度以及酸碱性具有极强的稳定性。
表1.胞内活性提取物在不同温度下的稳定性
Figure BDA0002898780510000161
注：+++表示有很强的活性，-表示无抑菌活性
表2.胞内活性提取物在不同pH中的稳定性
Figure BDA0002898780510000162
Figure BDA0002898780510000171
注：++表示有较强的活性，+++表示有很强的活性，-表示无抑菌活性
链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356的菌体及胞内活性提取物对苹果树腐烂病的防效测定；
参照烫伤接种法测定离体枝条防治效果。采集多年生‘富士’苹果枝条若干(d＝15mm-20mm)，截成25cm长的枝段，先用自来水冲洗枝条接着用75％酒精消毒10min，最后用无菌水冲洗3遍，两端口封蜡。用烧红的铁钉冒(d＝5mm)烫伤枝条，在烫伤处分别涂抹链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356的菌体或其胞内活性提取物原液、2、5、10、20、50和100倍稀释液，晾干后接种培养5d的苹果树腐烂病菌菌饼(d＝5mm)，每个枝条2个接种点，每组处理重复5个枝条，以涂抹无菌水作对照。25℃黑暗保湿培养，7d后测量病斑大小，计算病斑面积，并计算防病效果，计算公式为：
防病效果＝(对照病斑面积－处理病斑面积)/对照病斑面积×100％。
如表3所示，链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356的菌体能够有效地抑制病斑的扩展，防病效果达到94.03％；如表4所示，链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356的胞内活性提取物也能够有效地抑制病斑的扩展，其中胞内活性提取物原液、2、5倍稀释液在离体枝条上对苹果树腐烂病有非常好的预防效果，防病效果分别达到94.84％，94.59％和93.99％，此后随着稀释倍数的增大，预防效果逐渐降低。
表3.ZH-356菌株的菌体在离体枝条上对苹果树腐烂病的防病效果
Figure BDA0002898780510000181
表4.ZH-356菌株的胞内活性提取物在离体枝条上对苹果树腐烂病的防病效果
Figure BDA0002898780510000182
以上的实验结果表明，链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356的菌体及其胞内活性提取物可用于制备生防菌剂，用于防治植物真菌病害。
该菌剂的活性成分为链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356的菌体或其胞内活性提取物；所述菌剂可采用颗粒、粉末、片剂等固体外形或是液体、糊状、胶状、膏状等流体形式。菌剂辅料为：水、凡士林、液体石蜡、草炭、动物的粪便、各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生皮等中的一种或多种。
由链霉菌属(Streptomyces sp.)ZH-356经过发酵培养基得到的发酵制品也具有抑制植物病原真菌的功能。所述发酵制品可为发酵产品本身、经稀释过的发酵产品或经纯化的发酵产品；所述发酵制品可采用颗粒、粉末、片剂等固体外形或是液体、糊状、胶状、膏状等流体形式。
序列表
<110> 西安致用生物科技有限公司
<120> 源自枣树链霉菌株ZH-356、菌剂及制备方法和应用
<130> 2020
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1374
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgcagtcgac gatgaagccc ttcggggtgg attagtggcg aacgggtgag taacacgtgg 60
gcaatctgcc ctgcactctg ggacaagccc tggaaacggg gtctaatacc ggatgacact 120
ttctctcgca tgggagaagg ttgaaagctc cggcggtgca ggatgagccc gcggcctatc 180
agctagttgg tgaggtagaa gctcaccaag gcgacgacgg gtagccggcc tgagagggcg 240
accggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat 300
attgcacaat gggcgaaagc ctgatgcagc gacgccgcgt gagggatgac ggccttcggg 360
ttgtaaacct ctttcagcag ggaagaagcg caagtgacgg tacctgcaga agaagcgccg 420
gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggcgc aagcgttgtc cggaattatt 480
gggcgtaaag agctcgtagg cggcttgtca cgtcggttgt gaaagcccgg ggcttaaccc 540
cgggtctgca gtcgatacgg gcaggctaga gtgtggtagg ggagatcgga attcctggtg 600
tagcggtgaa atgcgcagat atcaggagga acaccggtgg cgaaggcgga tctctgggcc 660
attactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc 720
cacgccgtaa acggtgggaa ctaggtgttg gcgacattcc acgtcgtcgt gccgcagcta 780
acgcattaag ttccccgcct ggggagtacg gccgcaaggc taaaactcaa aggaattgac 840
gggggcccgc acaagcagcg gagcatgtgg cttaattcga cgcaacgcga agaaccttac 900
caaggcttga catcgcccgg aaagccgtag agatacggcc ccccttgtgg tcgggtgaca 960
ggtggtgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1020
cgcaaccctt gttctgtgtt gccagcatgc ccttcggggt gatggggact cacaggagac 1080
tgccggggtc aactcggagg aaggtgggga cgacgtcaag tcatcatgcc ccttatgtct 1140
tgggctgcac acgtgctaca atggcaggta caatgagctg cgaagccgcg aggcggagcg 1200
aatctcaaaa agcctgtctc agttcggatt ggggtctgca actcgacccc atgaagtcgg 1260
agttgctagt aatcgcagat cagcattgct gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac 1320
accgcccgtc acgtcacgaa agtcggtaac acccgaagcc ggtggcccaa cccc 1374

Claims (9)

1.源自枣树的链霉菌属ZH-356，所述菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2020690，保藏日期：2020年11月6日。
2.一种胞内活性提取物，其特征在于，所述胞内活性提取物是在权利要求 1 所述的链霉菌属ZH-356细胞中提取；所述链霉菌属ZH-356在发酵培养时产生的活性物质只在胞内积累，并不会分泌至胞外，而当链霉菌属ZH-356遭遇植物病原真菌时，才会分泌活性物质以抑制植物病原真菌的生长。
3.一种用于生物防治的菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分为权利要求1所述的链霉菌属ZH-356的菌体或权利要求2所述的胞内活性提取物，所述菌剂采用颗粒、粉末、片剂固体外形或是液体、糊状、胶状、膏状流体形式。
4.一种权利要求2所述的一种胞内活性提取物的制备方法，其特征在于，具体包括以下制备步骤：
步骤1，种子液的制备；
将链霉菌属ZH-356接种至种子培养基中，在28℃～30℃、180r/min～200r/min振荡条件下培养1d～2d，得到种子液；
步骤2，发酵培养；
将步骤1得到的种子液接入发酵培养基中，接种量为5％～7％，在28℃～30℃、180r/min～200r/min振荡条件下培养6d～7d，得到发酵液；
步骤3，胞内活性提取物的制备；
将步骤2中得到的发酵液通过离心收集菌体，将菌体用丙酮浸泡1d，离心收集丙酮提取液，沉淀使用丙酮浸泡，并用超声波辅助提取，离心收集丙酮提取液，重复三次，直至丙酮提取液为无色透明，合并丙酮提取液，使用旋转蒸发仪浓缩挥干后，即得到胞内浓缩物，该胞内浓缩物即为胞内活性提取物。
5.根据权利要求4所述的一种胞内活性提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤1中种子培养基由以下重量配比的物质组成：胰蛋白胨17.0g/L～22.0g/L，大豆蛋白胨3.0g/L～8.0g/L，氯化钠5.0g/L～7.5g/L，磷酸氢二钾2.5g/L～3.5g/L，葡萄糖2.5g/L～3.5g/L，pH7.2～7.3，溶剂为水。
6.根据权利要求4所述的一种胞内活性提取物的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基由以下重量配比的物质组成：碳源10.0g/L～15.0g/L；有机氮源5.0g/L～8.0g/L，无机氮源5.0g/L～8.0g/L，天冬酰胺1.0g/L～2.0g/L，甜菜碱1.25g/L～2.0g/L，pH为7.1～7.3，溶剂为水。
7.根据权利要求6所述的一种胞内活性提取物的制备方法，其特征在于，所述碳源为甘油、大米粉、黄豆饼粉、淀粉、花生饼粉、棉子饼粉、玉米浆、鱼粉、蚕蛹粉、麸皮、燕麦粉或纤维素中的任意一种；有机氮源为酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白或牛肉膏中任意一种；无机氮源为硝酸盐、氨水或铵盐中任意一种。
8.一种权利要求1所述的链霉菌属ZH-356的菌体用于制备苹果树腐烂病菌、小麦赤霉病菌、小麦根腐病菌和番茄早疫病菌的生物制剂以及在植物真菌病害防治中的应用。
9.一种权利要求2所述的胞内活性提取物用于制备苹果树腐烂病菌、小麦赤霉病菌、小麦根腐病菌和番茄早疫病菌的生物制剂以及在植物真菌病害防治中的应用。
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