CN111109298A - 一种具有防治蚜虫功能的微生物菌剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种具有防治蚜虫功能的微生物菌剂及其制备方法，它包括以下重量份的组分：离心菌体50％、助剂37.7％、离心菌体上清液12.3％；离心菌体中的菌体为枯草芽孢杆菌；助剂由润湿分散剂、醇类抗冻剂、增稠剂和非离子表面活性剂组成，所述润湿分散剂、醇类抗冻剂、增稠剂、非离子表面活性剂分别占微生物菌剂总重量分数为19.8％、0.3％、3.4％、14.2％。本发明采用“以菌治虫”的防治新理念，将其应用于农业生产过程中，可以对虫害进行有效防控，能够在很大程度上替代化学农药的使用，减少环境污染，提高作物安全性。

Description

一种具有防治蚜虫功能的微生物菌剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及药剂领域，尤其涉及一种具有防治蚜虫功能的微生物菌剂及其制备方法。
背景技术
蚜虫类在动物界(Animalia)中,属节肢动物门(Arthropoda),昆虫纲(Insecta),半翅目(Hemiptera),胸喙亚目。此亚目的两个总科,分别为球蚜总科和蚜总科(Aphidoidea),再分为13个科,500余属,世界已知种类4 700余种,主要分布在温带地区,我国蚜虫资源丰富,已知种类1 000余种，蚜虫具有周期性的孤雌生殖(孤雌世代和有性世代交替)、多型现象、复杂多样的生活史、卵生或卵胎生等特征,雌雄蚜虫通过遗传物质重组,既保持了种的特征,同时又由于遗传物质的重组而导致蚜虫的遗传异质性，出现种群内的分化,对环境条件的适应性更强。蚜虫寄主杂、分布广、种类多、世代重叠、数量大、繁殖快、危害大,常聚集在植株的芽、花蕾、嫩叶或嫩枝上。蚜虫唾液中含有多酚氧化酶、果胶酶、过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、共轭碳水化合物等活性成分,多酚氧化酶将酚类物质转变成毒性更小的衍生物,葡萄糖氧化酶抑制脂肪氧化酶的活性,改变植物信号通路以降低茉莉酸的诱导产生，蚜虫用口针穿刺造成的机械损伤小以至于植物几乎不能察觉,蚜虫唾液中的钙结合蛋白结合了植物参加防御反应所需的钙,抑制了植物的防御反应，其通过尖利的口器刺吸植物汁液,造成植物生长率降低、发育不良,出现叶斑、泛黄、卷叶、枯萎等不同症状使产量降低甚至死亡。蚜虫以群体形式吸取植物的养分并传播植物病毒,造成很严重的间接危害,目前已知病毒的昆虫传播介体有600种,其中275种属于蚜虫,居世界传病毒昆虫之首，由于蚜虫对农林业的严重危害,蚜虫防治的研究一直是一个基础理论和实际应用并重的重大课题。
现有的防止方法通常采用施加农药的方式，但是农药会对污染环境，还会有农药残余，影响健康。
“以菌治虫”的防治新理念，筛选出具有防虫功效的枯草芽孢杆菌，将其应用于农业生产过程中，可以对虫害进行有效防控，能够在很大程度上替代化学农药的使用，减少环境污染，提高作物安全性。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足而提供一种具有防治蚜虫功能的微生物菌剂及其制备方法，采用“以菌治虫”的防治新理念，将其应用于农业生产过程中，可以对虫害进行有效防控，能够在很大程度上替代化学农药的使用，减少环境污染，提高作物安全性。
为达到上述目的，本发明通过以下技术方案来实现。
一种具有防治蚜虫功能的微生物菌剂及其制备方法，它包括以下重量份的组分：离心菌体50％、助剂37.7％、离心菌体上清液12.3％；
所述离心菌体中的菌体为枯草芽孢杆菌，其保藏登记号为CGMCC No.18459；
所述助剂由润湿分散剂、醇类抗冻剂、增稠剂和非离子表面活性剂组成，所述润湿分散剂、醇类抗冻剂、增稠剂、非离子表面活性剂分别占微生物菌剂总重量分数为19.8％、0.3％、3.4％、14.2％。
进一步的，所述润湿分散剂包括羧甲基纤维素钠、萘磺酸盐、吐温20，所述羧甲基纤维素钠、萘磺酸盐、吐温20分别占微生物菌剂总重量分数为10％、5％、4.8％。
进一步的，所述增稠剂为黄原胶。
进一步的，所述醇类抗冻剂为乙二醇。
进一步的，所述非离子表面活性剂为三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚磷酸酯、烷基酚聚氧乙烯醚、聚乙二醇，所述三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚磷酸酯、烷基酚聚氧乙烯醚、聚乙二醇分别占微生物菌剂总重量分数为8％、4％、2.2％。
一种具有防治蚜虫功能的微生物菌剂的制备方法包括以下步骤：
步骤一，将微生物菌体总质量50％的离心菌体、19.8％的润湿分散剂、0.3％的醇类抗冻剂、12.1％的离心上清液混合均匀，转入到搅拌器中进行搅拌均匀；
步骤二，将微生物菌体总质量3.4％的增稠剂均匀加入到步骤一的搅拌器中，继续搅拌均匀；
步骤三，出料，将剩余的占微生物菌体总质量0.3％的离心上清加入到步骤二中继续搅拌均匀，然后用水稀释，使有效活菌数大于1×107cfu/mL，备用。
进一步的，所述步骤一中的离心菌体的制备方法包括以下步骤：
步骤一，菌种活化，将-80℃下保存的枯草芽孢杆菌菌株在LB固体培养基上活化12～16h，挑取单菌落在LB固体培养基上，在35℃条件下培养1～2天，得活化的菌株；
步骤二，种子液制备，用无菌接种环刮取一环步骤一中活化的菌株接种到50ml LB液体培养基中，在温度为35℃、转速为160rpm/min条件下培养24h，得种子液；
步骤三，发酵液制备，按照菌种、培养液体积比为1：120的比例将步骤二所得的种子液接入到车间发酵料培养基中，在温度为36.5℃—37.5℃条件下，转速为120rpm/min条件下培养25-30h，得发酵液，发酵液的有效活菌数在2.0×1010cfu/g以上；
步骤四，离心菌体的制备，将步骤三所得发酵液经设备倒料进入离心机，离心机转速4000rpm/min条件下离心15min，除去上清液，得离心菌体。
进一步的，所述步骤一中LB固体培养基的组成成分及其配比为：细菌学蛋白胨10g，酵母提取粉5g，氯化钠10g，水1L，即得液体培养基；在液体培养基中加入琼脂粉15g即得固体培养基。
进一步的，所述步骤三中车间发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：黄豆粉1.0-1.6％、蔗糖0.1-0.5％、蛋白胨0.2-0.6％、玉米粉0.2-0.6％、碳酸钙0.3-0.9％、鱼粉0.1-0.3％、硫酸铵0.01-0.08％、硫酸镁0.02-0.05％、磷酸二氢钾0.01-0.04％、磷酸氢二钾0.02-0.05％、硫酸锰0.01-0.04％、氢氧化钠0.01-0.04％、氯化钠0.02-0.03％、消泡剂0.5-1.5％，用盐酸及氢氧化钠调节pH至6.8-7.5。
本发明与现有技术比较具有以下优点：
1.有较强的选择性本申请中的功能菌种APHID-C具有对人畜等靶标以外生物(非靶标生物)安全无害的特点，甚至对天敌昆虫也是安全的、是由自然界中筛选分离得到，未进行基因改造，田间使用不具有风险，可在土壤中自然快速分解，对作物、动物和人体均不产生危害，可实现田间、作物、水源无污染、无残留，与常规杀虫农药相比安全性大大提高，有利于有机农业的发展。
2.能散布蔓延，病原体能在虫体内增殖，最后能产生大量具有感染力的繁殖体。
3、杀虫效果好，采用本申请的枯草芽孢杆菌APHID-C生产出的微生物杀虫剂对害虫进行防控，害虫接触到微生物杀虫剂后，能在18h-24h之内快速死亡。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不局限于说明书上的内容。
一种具有防治蚜虫功能的微生物菌剂，它包括以下重量份的组分：离心菌体50％、助剂37.7％、离心菌体上清液12.3％；
助剂由润湿分散剂、醇类抗冻剂、增稠剂和非离子表面活性剂组成，润湿分散剂、醇类抗冻剂、增稠剂和非离子表面活性剂分别占悬浮剂总重量的19.8％、0.3％、3.4％和14.2％。
润湿分散剂由微生物菌剂总质量10％的蓖麻油聚氧乙烯醚(EMA)、5％的萘磺酸盐(D425)、4.8％的吐温20组成。
增稠剂为黄原胶。
醇类抗冻剂为乙二醇。
非离子表面活性剂由微生物菌剂总质量8％的三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚磷酸酯(600#)、4％的烷基酚聚氧乙烯醚(OP-10)、2.2％的聚乙二醇(PEG600)组成。
其制备方法：
1)先将先将离心菌体50％、润湿分散剂19.8％、醇类抗冻剂0.3％、和部分离心上清液12.1％充分混合均匀，转入到搅拌器中进行搅拌均匀；
2)再将增稠剂按照上述比例取量均匀加入到正在搅拌的步骤1的物料中，继续搅拌；
3)出料，将剩余的离心上清液加入到步骤2的混合液中，搅拌均匀即可。
离心菌体中的菌体为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),其保藏登记号为CGMCCNo.18459,保藏日期为2019年9月2日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
枯草芽孢杆菌编号：APHID-C，从自然死亡的甘蓝蚜虫虫体中分离出生防菌株。
APHID-C形态特征：在PDA培养基上淡乳黄色圆形菌落，表面及边缘光滑，无隔膜，菌落不透明，较为浓稠。
序列信息：介于Mitsuaria chitosanitabida和Roseateles depolymerans两个种属之间，与两个种的部分16S rRNA的Blast比对后，相似性均为99％，从进化树的角度看与Roseateles属更为接近。
APHID-C的制备方法按以下步骤进行：
(1)菌种活化：将-80℃下保存的枯草芽孢杆菌菌株APHID-C在LB固体培养基上活化12～16h，挑取单菌落在LB固体培养基上，在35℃培养1～2天，得活化的菌株。
(2)种子液制备：用无菌接种环刮取一环步骤1中活化的菌株接种到50ml LB液体培养基中，在温度为35℃、转速为160rpm/min条件下培养24h，得种子液。
(3)发酵液制备：按照菌种、培养液体积比为1：120左右的比例将步骤2所得的种子液接入到车间发酵料培养基中，在温度为37℃(可上下浮动0.5℃)，转速为120rpm/min条件下培养25-30h，得发酵液，即为具有防治功能的枯草芽孢杆菌菌液；对发酵液进行喷粉干燥，即为具有防虫功能的枯草芽孢杆菌菌粉。菌液和菌粉的有效活菌数均控制在2.0×1010cfu/g以上。
(4)离心菌体的制备：将(3)所得发酵液经设备倒料进入离心机，离心机转速4000rpm/min条件下离心15min。
LB固体培养基的组成成分及其配比为：细菌学蛋白胨10g，酵母提取粉5g，氯化钠10g，水1L，即得液体培养基；在以上物质中再加入琼脂粉15g即得固体培养基。
车间发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：黄豆粉1.0-1.6％、蔗糖0.1-0.5％、蛋白胨0.2-0.6％、玉米粉0.2-0.6％、碳酸钙0.3-0.9％、鱼粉0.1-0.3％、硫酸铵0.01-0.08％、硫酸镁0.02-0.05％、磷酸二氢钾0.01-0.04％、磷酸氢二钾0.02-0.05％、硫酸锰0.01-0.04％、氢氧化钠0.01-0.04％、氯化钠0.02-0.03％、消泡剂0.5-1.5％，用盐酸及氢氧化钠调节pH至6.8-7.5；
微生物杀虫剂使用时需用水稀释至有效菌数为1×107cfu/mL，具有最佳杀虫效果。
下面通过具体实施实验来说明。
利用APHID-C悬浮剂制备微生物杀虫剂对甘蓝蚜虫的室内防效测定。
1.材料与方法
1.1供试药剂：70％的水分散粒剂吡虫啉、APHID-C悬浮剂、APHID-C发酵液、CK对照(清水)，供试昆虫从云南省微生物发酵工程研究中心实验温室采集甘蓝蚜。
1.2室内防效验证：采用浸液法，将待测药剂稀释为系列浓度梯度，以清水为对照，从甘蓝上采集带有蚜虫的嫩叶，将带有蚜虫的叶片浸入药液10s，然后用滤纸吸掉多余的药液，放入培养皿内，每处理重复3次，置于(25±2℃)恒温培养箱中定时检查结果。
表1：不同处理对甘蓝蚜虫死亡率统计(室内)
Figure BDA0002328251600000081
Figure BDA0002328251600000091
表2本申请APHID-C生物杀虫悬浮剂对玉米蚜虫的防治效果
Figure BDA0002328251600000092
通过表1、2可知本申请的微生物菌剂对玉米蚜虫具有非常优异的杀灭效果，效果优于现有现有枯草芽孢杆菌制剂的效果，并且稀释500倍时使用效果最佳。
显然，本发明的上述实施方式仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (9)

1.一种具有防治蚜虫功能的微生物菌剂，其特征在于：它包括以下重量份的组分：离心菌体50％、助剂37.7％、离心菌体上清液12.3％；
所述离心菌体中的菌体为枯草芽孢杆菌，其保藏登记号为CGMCC No.18459；
所述助剂由润湿分散剂、醇类抗冻剂、增稠剂和非离子表面活性剂组成，所述润湿分散剂、醇类抗冻剂、增稠剂、非离子表面活性剂分别占微生物菌剂总重量分数为19.8％、0.3％、3.4％、14.2％。
2.根据权利要求1所述的一种具有防治蚜虫功能的微生物菌剂，其特征在于：所述润湿分散剂包括羧甲基纤维素钠、萘磺酸盐、吐温20，所述羧甲基纤维素钠、萘磺酸盐、吐温20分别占微生物菌剂总重量分数为10％、5％、4.8％。
3.根据权利要求1所述的一种具有防治蚜虫功能的微生物菌剂，其特征在于：所述增稠剂为黄原胶。
4.根据权利要求1所述的一种具有防治蚜虫功能的微生物菌剂，其特征在于：所述醇类抗冻剂为乙二醇。
5.根据权利要求1所述的一种具有防治蚜虫功能的微生物菌剂，其特征在于：所述非离子表面活性剂为三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚磷酸酯、烷基酚聚氧乙烯醚、聚乙二醇，所述三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚磷酸酯、烷基酚聚氧乙烯醚、聚乙二醇分别占微生物菌剂总重量分数为8％、4％、2.2％。
6.根据权利要求1所述的一种具有防治蚜虫功能的微生物菌剂，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：
步骤一，将微生物菌体总质量50％的离心菌体、19.8％的润湿分散剂、0.3％的醇类抗冻剂、12.1％的离心上清液混合均匀，转入到搅拌器中进行搅拌均匀；
步骤二，将微生物菌体总质量3.4％的增稠剂均匀加入到步骤一的搅拌器中，继续搅拌均匀；
步骤三，出料，将剩余的占微生物菌体总质量0.3％的离心上清加入到步骤二中继续搅拌均匀，然后用水稀释，使有效活菌数大于1×107cfu/mL，备用。
7.根据权利要求6所述的一种具有防治蚜虫功能的微生物菌剂，其特征在于：所述步骤一中的离心菌体的制备方法包括以下步骤：
步骤一，菌种活化，将-80℃下保存的枯草芽孢杆菌菌株在LB固体培养基上活化12～16h，挑取单菌落在LB固体培养基上，在35℃条件下培养1～2天，得活化的菌株；
步骤二，种子液制备，用无菌接种环刮取一环步骤一中活化的菌株接种到50ml LB液体培养基中，在温度为35℃、转速为160rpm/min条件下培养24h，得种子液；
步骤三，发酵液制备，按照菌种、培养液体积比为1：120的比例将步骤二所得的种子液接入到车间发酵料培养基中，在温度为36.5℃—37.5℃条件下，转速为120rpm/min条件下培养25-30h，得发酵液，发酵液的有效活菌数在2.0×1010cfu/g以上；
步骤四，离心菌体的制备，将步骤三所得发酵液经设备倒料进入离心机，离心机转速4000rpm/min条件下离心15min，除去上清液，得离心菌体。
8.根据权利要求7所述的一种具有防治蚜虫功能的微生物菌剂，其特征在于：所述步骤一中LB固体培养基的组成成分及其配比为：细菌学蛋白胨10g，酵母提取粉5g，氯化钠10g，水1L，即得液体培养基；在液体培养基中加入琼脂粉15g即得固体培养基。
9.根据权利要求7所述的一种具有防治蚜虫功能的微生物菌剂，其特征在于：所述步骤三中车间发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：黄豆粉1.0-1.6％、蔗糖0.1-0.5％、蛋白胨0.2-0.6％、玉米粉0.2-0.6％、碳酸钙0.3-0.9％、鱼粉0.1-0.3％、硫酸铵0.01-0.08％、硫酸镁0.02-0.05％、磷酸二氢钾0.01-0.04％、磷酸氢二钾0.02-0.05％、硫酸锰0.01-0.04％、氢氧化钠0.01-0.04％、氯化钠0.02-0.03％、消泡剂0.5-1.5％，用盐酸及氢氧化钠调节pH至6.8-7.5。
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