CN112471142A - 一种防治红火蚁的药剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种防治红火蚁的药剂及其制备方法，其为枯草芽孢杆菌悬浮剂，所述悬浮剂的含菌量为1×107cfu/mL，所述枯草芽孢杆菌的保藏登记号为CGMCC No.20143。其制备方法包括以下步骤：步骤一，菌种活化；步骤二，种子液制备；步骤三，发酵液制备；步骤四，离心菌体液的制备；步骤五，悬浮剂制备。本发明的有益效果：能够对红红火蚁具有较好的杀灭效果，对人畜、环境等安全无害，生产成本低，可有效的替代化学药剂，保护环境。
Description
技术领域
本发明涉及微生物药剂领域，尤其涉及一种防治红火蚁的药剂及其制备方法。
背景技术
红火蚁(Solenopsis invicta Buren)是一种杂食性土栖蚁类, 隶属于膜翅目(Hymenoptera)、蚁科(Formicidae)、切叶蚁亚科 (Myrmicinae)、火蚁属(Solenopsis),是一种原产于南美洲巴拉那河流域的危险性害虫。由于检疫上的疏忽,20世纪30年代通过船运的带土苗木侵入美国阿拉巴马州,之后平均以198km·a-1的速度在美国南部的19个州和地区迅速扩散,受害土地面积超过12800万 hm2。而后相继侵入澳大利亚、新西兰、菲律宾、马来西亚、新加坡、中国台湾、中国香港和多个太平洋群岛等国家和地区,在国际上被列为极具破坏性和攻击性的入侵生物之一。中国大陆地区于2004年9月在广东省吴川市首次发现该虫入侵为害,在短短的10余年间,已在中国南方11个省(市)的30多个县级区域出现危害,严重威胁生态环境、公共设施、动植物和人类安全等。红火蚁主要随园艺植物、草皮、运输工具等调运进行远距离传播和扩散,带土花木是一类高风险物品。
国外研究显示,红火蚁可直接取食并破坏向日葵、黄瓜、高粱、大豆、玉米、马铃薯、黄秋葵和茄子等植物的种子、果实、幼芽、嫩茎和根部，造成经济上的损失。据统计，美国佛罗里达州的茄子和德克萨斯州的向日葵产量因红火蚁的危害而分别下降了50％和4％。另外，红火蚁可直接导致大豆根部干物质和结节产量分别减少28％和 81％，严重影响大豆种子和幼苗的活力，数据显示小麦、玉米、高粱的干种子被红火蚁危害的比率高于棉花和大豆。
目前在杀灭红火蚁方面通采用的是化学喷洒试剂，这样杀灭效果好，但是化学试剂环境污染大。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足而提供一种防治红火蚁的药剂及其制备方法。
为达到上述目的，本发明通过以下技术方案来实现。
一种防治红火蚁的药剂，其为枯草芽孢杆菌悬浮剂，所述悬浮剂的含菌量为1×107cfu/mL，所述枯草芽孢杆菌的保藏登记号为CGMCC No.20143。
其制备方法包括以下步骤：
步骤一，菌种活化：将保存于-80℃下的枯草芽孢杆菌菌株在LB 固体培养基上活化16～24h，挑取单菌落在LB固体培养基上，在35℃培养18～24h，得活化的菌株；
步骤二，种子液制备：用无菌接种环刮取一环步骤一中活化的菌株，接种到50mlLB液体培养基中，在温度为35℃、转速为160rpm 条件下培养24-48h，得种子液；
步骤三，发酵液制备：按照菌种、培养液体积比为1：120的比例将步骤二制备的种子液接入到车间发酵料培养基中，在温度为36.5℃-37.5℃，转速为120rpm/min条件下培养24h-48h，得发酵液；
步骤四，离心菌体液的制备：将步骤三所得发酵液倒料进入离心机，离心机转速4000rpm/min条件下制备离心菌体液；
步骤五，悬浮剂制备：将步骤四所得离心菌体液中加入占离心菌液体质量10％的增稠剂、14.2％的乳化剂、2.2％的润湿剂、1.2％的表面活性剂、2.2％的抗冻剂，经搅拌器混合均匀，通过分装机进行分装即为悬浮剂。
进一步的，所述步骤一中的LB液体培养基的组成成分及其配比为：细菌学蛋白胨10g，酵母提取粉5g，氯化钠5g，水1L。
进一步的，所述步骤一中的LB固体培养基的组成成分及其配比为：细菌学蛋白胨10g，酵母提取粉5g，氯化钠5g，水1L，琼脂粉7.5g。
进一步的，所述步骤三中车间发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：黄豆粉1.0-1.6％、蔗糖0.1-0.5％、蛋白胨0.2-0.6％、玉米粉 0.2-0.6％、碳酸钙0.3-0.9％、鱼粉0.1-0.3％、硫酸铵0.01-0.08％、硫酸镁0.02-0.05％、磷酸二氢钾0.01-0.04％、磷酸氢二钾0.02-0.05％、硫酸锰0.01-0.04％、氢氧化钠0.01-0.04％、氯化钠0.02-0.03％、消泡剂0.5-1.5％，用盐酸及氢氧化钠调节pH至6.8-7.5。
本发明的有益效果：能够对红红火蚁具有较好的杀灭效果，对人畜、环境等安全无害，生产成本低，可有效的替代化学药剂，保护环境。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不局限于说明书上的内容。
一种防治红火蚁的药剂，其为一株枯草芽孢杆菌悬浮剂，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的保藏登记号为CGMCC No.20143。保藏日期：2020年6月28日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
枯草芽孢杆菌形态特征：在LB培养基上为乳白色圆形菌落，表面及边缘较为平整，无隔膜，菌落不透明，较为浓稠。
制备方法：
(1)菌种活化：将筛选出的保存于-80℃下的枯草芽孢杆菌菌株在LB固体培养基上活化16～24h，挑取单菌落在LB固体培养基上，在35℃培养18～24h，得活化的菌株。
(2)种子液制备：用无菌接种环刮取一环步骤(1)中活化的菌株接种到50ml LB液体培养基中，在温度为35℃、转速为160rpm条件下培养24-48h，得种子液。
(3)发酵液制备：按照菌种、培养液体积比为1：120左右的比例将步骤(2)所得的种子液接入到车间发酵料培养基中，在温度为 37℃(可上下浮动0.5℃)，转速为120rpm/min条件下培养24h-48h，得发酵液。
(4)离心菌体的制备：将步骤(3)所得发酵液经设备倒料进入离心机，离心机转速4000rpm/min条件下制备。
(5)悬浮剂制备：将步骤(4)所得离心液中分别加入加入离心液质量分数8％的羧甲基纤维素钠增稠剂、12％的600#乳化剂(方富(广州)高新材料科技有限公司)、2.2％的润湿剂D425(阿克苏诺贝尔)、 2.2％的OP-10乳化剂(鑫蓝星科技)、1.2％的吐温20表面活性剂、1.2％的PEG600抗冻剂(鑫蓝星科技)、2％的黄原胶增稠剂、1％的丙二醇抗冻剂而后经搅拌器混合均匀，通过分装机进行分装即为悬浮剂。
步骤1、2中的LB培养基的组成成分及其配比为：细菌学蛋白胨10g，酵母提取粉5g，氯化钠5g，水1L，即得液体培养基；在以上物质中再加入琼脂粉7.5g即得固体培养基。
步骤3中车间发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：黄豆粉 1.0-1.6％、蔗糖0.1-0.5％、蛋白胨0.2-0.6％、玉米粉0.2-0.6％、碳酸钙0.3-0.9％、鱼粉0.1-0.3％、硫酸铵0.01-0.08％、硫酸镁0.02-0.05％、磷酸二氢钾0.01-0.04％、磷酸氢二钾0.02-0.05％、硫酸锰0.01-0.04％、氢氧化钠0.01-0.04％、氯化钠0.02-0.03％、消泡剂0.5-1.5％，用盐酸及氢氧化钠调节pH至6.8-7.5。
微生物杀虫悬浮剂使用时，需用水稀释，悬浮剂的含菌量为 1×107cfu/mL，具有高效杀死红火蚁的效果。
下面适用本菌株制备的悬浮剂与市售产品进行对比。
检测1
按以下方法设置实验组和对照组：
(1)本申请的悬浮剂稀释150倍液(含菌量为1×107cfu/mL左右)；
(2)本申请的悬浮剂稀释100倍液；
(3)本申请的悬浮剂稀释200倍液；
(4)阳性对照：5％高效氯氟氰菊酯(上海沪联生物药业股份有限公司)
(5)空白对照：清水。
试验在云南农业大学科研基地进行，设3个处理，每个处理4个蚁巢(人工培育蚁巢，蚁巢中蚂蚁数量相差率在0.1％以内)，重复3 次，设5％高效氯氟氰菊酯与清水对照。施药时先用细木棒搅动蚁巢，引诱大量红火蚁爬出蚁巢表面，分别喷洒不同浓度的悬浮液直至蚁巢完全湿透，处理后对蚁巢做好标记。在施药后，调查爬出红火蚁总数及死亡率。
虫子死亡率(％)等于100x死亡虫数/总虫数。
经检测红火蚁死亡率如下表所示。
表1红火蚁处理平均死亡率(％)
检测2
制作悬浮剂，按以下方法设置实验组和对照组：
(1)本申请的悬浮剂稀释150倍液(含菌量为1×107cfu/mL左右)；
(2)本申请的悬浮剂稀释100倍液；
(3)本申请的悬浮剂稀释200倍液；
(4)阳性对照：5％高效氯氟氰菊酯(上海沪联生物药业股份有限公司)
(5)空白对照：清水。
试验在云南省微生物发酵工程研究中心有限公司实验室进行，设 3个处理，每个处理200头，设5％高效氯氟氰菊酯与清水对照。将活跃的红火蚁装在容积为100ml的透明广口瓶中，以喷雾的形式施药，在施药后，调查红火蚁死亡头数。实验结果如下表2所示。
表2红火蚁处理平均死亡率(％)
通过上述上述实验可知，不论在防蚁巢中的杀灭试验还是喷雾杀灭实验中，本申请的悬浮药剂均具有较好的杀灭效果，稀释150倍时使用效果最佳。
检测3
按以下方法设置实验组和对照组：
(1)本申请的悬浮剂稀释150倍液(含菌量为1×107cfu/mL左右)；
(2)阳性对照：5％高效氯氟氰菊酯(上海沪联生物药业股份有限公司)
(3)空白对照：清水。
分别使用上述三种溶剂处理红火蚁、大头蚁、黑蚁。
试验在云南农业大学科研基地进行，每种溶剂设3个处理，每个处理4个蚁巢(人工培育蚁巢，每个蚁巢中蚂蚁数量相差率在0.1％以内)，施药时先用细木棒搅动蚁巢，引诱大量红火蚁爬出蚁巢表面，分别喷洒不同浓度的悬浮液直至蚁巢完全湿透，处理后对蚁巢做好标记。在施药后，调查爬出红火蚁总数及死亡率。
虫子死亡率(％)等于100x死亡虫数/总虫数。
表3红火蚁处理平均死亡率(％)
表4大头蚁处理平均死亡率(％)
表5大头蚁处理平均死亡率(％)
通过上述表3、4、5可知，本发明的药剂对红火蚁杀灭效果好，但是对其它种类的蚂蚁，例如大头蚁、黑蚁的杀灭效果与清水相差不大，没有杀灭效果。
显然，本发明的上述实施方式仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (5)
1.一种防治红火蚁的药剂，其特征在于：其为枯草芽孢杆菌悬浮剂，所述悬浮剂的含菌量为1×107cfu/mL，所述枯草芽孢杆菌的保藏登记号为CGMCC No.20143。
2.根据权利要求1所述的一种防治红火蚁的药剂，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：
步骤一，菌种活化：将保存于-80℃下的枯草芽孢杆菌菌株在LB固体培养基上活化16～24h，挑取单菌落在LB固体培养基上，在35℃培养18～24h，得活化的菌株；
步骤二，种子液制备：用无菌接种环刮取一环步骤一中活化的菌株，接种到50ml LB液体培养基中，在温度为35℃、转速为160rpm条件下培养24-48h，得种子液；
步骤三，发酵液制备：按照菌种、培养液体积比为1：120的比例将步骤二制备的种子液接入到车间发酵料培养基中，在温度为36.5℃-37.5℃，转速为120rpm/min条件下培养24h-48h，得发酵液；
步骤四，离心菌体液的制备：将步骤三所得发酵液倒料进入离心机，离心机转速4000rpm/min条件下制备离心菌体液；
步骤五，悬浮剂制备：将步骤四所得离心菌体液中加入占离心菌液体质量10％的增稠剂、14.2％的乳化剂、2.2％的润湿剂、1.2％的表面活性剂、2.2％的抗冻剂，经搅拌器混合均匀，通过分装机进行分装即为悬浮剂。
3.根据权利要求2所述的一种防治红火蚁的药剂，其特征在于：所述步骤一中的LB液体培养基的组成成分及其配比为：细菌学蛋白胨10g，酵母提取粉5g，氯化钠5g，水1L。
4.根据权利要求2所述的一种防治红火蚁的药剂，其特征在于：所述步骤一中的LB固体培养基的组成成分及其配比为：细菌学蛋白胨10g，酵母提取粉5g，氯化钠5g，水1L，琼脂粉7.5g。
5.根据权利要求2所述的一种防治红火蚁的药剂，其特征在于：所述步骤三中车间发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：黄豆粉1.0-1.6％、蔗糖0.1-0.5％、蛋白胨0.2-0.6％、玉米粉0.2-0.6％、碳酸钙0.3-0.9％、鱼粉0.1-0.3％、硫酸铵0.01-0.08％、硫酸镁0.02-0.05％、磷酸二氢钾0.01-0.04％、磷酸氢二钾0.02-0.05％、硫酸锰0.01-0.04％、氢氧化钠0.01-0.04％、氯化钠0.02-0.03％、消泡剂0.5-1.5％，用盐酸及氢氧化钠调节pH至6.8-7.5。
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