CN108841755A - 一种具有防虫功能的枯草芽孢杆菌及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有防虫功能的枯草芽孢杆菌及其制备方法和应用，编号为WSWFJ‑15，其保藏登记号为CGMCC No.15855。将其培养制成微生物杀虫菌液或者微生物杀虫肥料。枯草芽孢杆菌发酵后可作为微生物杀虫剂使用，并可添加到肥料中制成具有防虫功能的肥料产品进行使用，杀虫效果好，广谱性强，不需多次多品种施药，节约成本，提高经济效益。

Description

一种具有防虫功能的枯草芽孢杆菌及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种具有防虫功能的枯草芽孢杆菌及其制备方法和应用。
背景技术
人类从40年代起开始使用农药除虫除草，每年挽回农业总产量15％左右的损失。但是，由于长期滥用农药，使环境中的有害物质大大增加，危害到生态和人类，形成农药污染。造成污染的农药主要是有机氯农药，含铅、砷、汞等物质的金属制剂，以及某些特异性除草剂。
多数农药对人和动物有毒害，大量接触以及误食后会造成急性中毒和死亡。据世界卫生组织报道，发展中国家的农民由于缺乏科学知识和安全措施，每年有200万人农药中毒，其中有4万人死亡，平均每10分钟有28人中毒，每17分钟有1人死亡！而这还不包括因农药污染而导致死胎、致癌、流产的受害者。根据对68个国家的调查，急性中毒的人有93％是由有机氯、有机磷和汞制剂等农药所引起。
农药污染已在许多国家造成公害。许多国家已禁止使用DDT、狄氏剂、氯制剂等农药，并积极研制和生产低毒高效农药，同时讲究农药使用的科学性，大力提倡生物防治，保护益鸟、益虫，做到“以鸟治虫”、“以虫治虫”。
专利申请号：201711426327.5，名为：一株枯草芽孢杆菌及其应用的发明专利，公开了一种枯草芽孢杆菌，可以作用于花生根部，有效防止花生病原菌。但是在生物防虫方面，相关技术还没有涉及。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足而提供一种具有防虫功能的枯草芽孢杆菌及其制备方法和应用，枯草芽孢杆菌发酵后可作为微生物杀虫剂使用，并可添加到肥料中制成具有防虫功能的肥料产品进行使用，杀虫效果好，广谱性强，不需多次多品种施药，节约成本，提高经济效益。
为达到上述目的，本发明通过以下技术方案来实现。
一种具有防虫功能的枯草芽孢杆菌，编号为WSWFJ-15，其保藏登记号为CGMCCNo.15855，由云南省微生物发酵工程研究中心有限公司进行筛选并保藏。
一种具有防虫功能的枯草芽孢杆菌的制备方法和应用，它包括以下步骤：
第一步，菌种活化：将-80℃下保存的芽孢杆菌菌株WSWFJ-15在LB固体培养基上活化12～16h，挑取单菌落在LB固体培养基上，在35℃培养1～2天，得活化的菌株；
第二步，种子液制备：用无菌接种环刮取一环第一步中活化的菌株接种到50ml LB液体培养基中，在温度为35℃、转速为160rpm条件下培养24h，得种子液；
第三步，发酵液制备：按照菌种种子液、培养液体积比为1：120的比例将步骤(2)所得的种子液接入到车间发酵料培养基中，在温度为36.5℃～37.5℃，转速为120rpm/min条件下培养25～30h，得发酵液，即为具有防虫功能的枯草芽孢杆菌菌液；对发酵液进行喷粉干燥，即为具有防虫功能的枯草芽孢杆菌菌粉；
所述菌液、菌粉的有效活菌数均大于2.0×1010cfu/g；
第四步，微生物杀虫剂制备：将第三步中所得的菌液中按照重量比加入0.05％～0.15％的吐温80和0.005％～0.015％的氮酮，混合均匀，即得微生物杀虫剂；
第五步，防虫功能肥料制备：将第三步中所得的菌液或菌粉按照重量比1％～5％加入到肥料中，混合均匀即得具有防虫功能的肥料。
进一步的，所述LB液体培养基的组成成分及其配比为：细菌学蛋白胨10g，酵母提取粉5g，氯化钠10g，水1L，即得液体培养基。
进一步的，所述LB固体培养基的组成成分及其配比为：细菌学蛋白胨10g，酵母提取粉5g，氯化钠10g，水1L，琼脂粉7.5g。
进一步的，所述车间发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：黄豆粉1.0～1.6％、蔗糖0.1～0.5％、蛋白胨0.2～0.6％、玉米粉0.2～0.6％、碳酸钙0.3～0.9％、鱼粉0.1～0.3％、硫酸铵0.01～0.08％、硫酸镁0.02～0.05％、磷酸二氢钾0.01～0.04％、磷酸氢二钾0.02～0.05％、硫酸锰0.01～0.04％、氢氧化钠0.01～0.04％、氯化钠0.02～0.03％、消泡剂0.5～1.5％。
进一步的，所述车间发酵培养基用盐酸、氢氧化钠调节pH至6.8～7.5。
进一步的，所述微生物杀虫剂使用时需用水稀释使有效活菌数为1×107cfu/mL。
本发明的一种具有防虫功能的枯草芽孢杆菌及其制备方法和应用，枯草芽孢杆菌发酵后可作为微生物杀虫剂使用，并可添加到肥料中制成具有防虫功能的肥料产品进行使用，杀虫效果好，广谱性强，不需多次多品种施药，节约成本，提高经济效益。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不局限于说明书上的内容。
本发明的枯草芽孢杆菌编号为WSWFJ-15，其保藏登记号为CGMCC No.15855，由云南省微生物发酵工程研究中心有限公司进行筛选并保藏。
枯草芽孢杆菌WSWFJ-15形态特征：在PDA培养基上淡乳黄色圆形菌落，表面及边缘光滑，无隔膜，菌落半透明，较为浓稠。
枯草芽孢杆菌WSWFJ-15的制备方法按以下步骤进行：
(1)菌种活化：将-80℃下保存的芽孢杆菌菌株WSWFJ-15在LB固体培养基上活化12～16h，挑取单菌落在LB固体培养基上，在35℃培养1～2天，得活化的菌株。
(2)种子液制备：用无菌接种环刮取一环步骤(1)中活化的菌株接种到50ml LB液体培养基中，在温度为35℃、转速为160rpm条件下培养24h，得种子液。
(3)发酵液制备：按照菌种、培养液体积比为1：120左右的比例将步骤(2)所得的种子液接入到车间发酵料培养基中，在温度为37℃(可上下浮动0.5℃)，转速为120rpm条件下培养25～30h，得发酵液，即为具有防虫功能的枯草芽孢杆菌菌液；对发酵液进行喷粉干燥，即为具有防虫功能的枯草芽孢杆菌菌粉；
所述菌液、菌粉的有效活菌数大于2.0×1010cfu/g；
(4)微生物杀虫剂制备：在步骤(3)所得的菌液中按照重量比加入0.05％～0.15％的吐温80及0.005％～0.015％的氮酮，与发酵液混合均匀，即得微生物杀虫剂。
(5)防虫功能肥料产品制备：将步骤(3)所得的菌液或菌粉按照重量比1％～5％加入到肥料中，混合均匀即得具有防虫功能的肥料产品。
LB培养基的组成成分及其配比为：细菌学蛋白胨10g，酵母提取粉5g，氯化钠10g，水1L，即得液体培养基；在以上物质中再加入琼脂粉7.5g即得固体培养基。
车间发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：黄豆粉1.0～1.6％、蔗糖0.1～0.5％、蛋白胨0.2～0.6％、玉米粉0.2～0.6％、碳酸钙0.3～0.9％、鱼粉0.1～0.3％、硫酸铵0.01～0.08％、硫酸镁0.02～0.05％、磷酸二氢钾0.01～0.04％、磷酸氢二钾0.02～0.05％、硫酸锰0.01～0.04％、氢氧化钠0.01～0.04％、氯化钠0.02～0.03％、消泡剂0.5～1.5％，用盐酸及氢氧化钠调节pH至6.8～7.5；消泡剂为市售产品，例如烟台恒鑫化工的THIX-298型产品。
微生物杀虫剂使用时需用水稀释至1×107cfu/mL，具有最佳杀虫效果。
枯草芽孢杆菌WSWFJ-15杀虫效果为：菌种可产生小分子环肽类化合物，对大部分鳞翅目、同翅目、鞘翅目、双翅目害虫及蝽类、螳螂、竹节虫、蚂蚁、白蚁及其他多种害虫都具有杀伤力。对蛾类害虫的成虫和幼虫均在1分钟之内击毙，对蛴螬的低龄幼虫在10秒左右杀灭，高龄幼虫在10分钟至2小时杀灭。
下面结合本枯草芽孢杆菌制剂的实际使用效果来做说明。
实施例1：利用WSWFJ-15制备微生物杀虫剂对蝶类害虫的杀灭效果试验
(1)试验目的
通过对安宁青龙镇行道树斑蝶幼虫进行喷淋试验，验证枯草芽孢杆菌WSWFJ-15的杀虫效果及确定有效杀虫成分。
(2)试验方法
现利用WSWFJ-15微生物杀虫剂对不同种类害虫进行喷雾试验，统计各害虫死亡率及死亡时间。试验共设3个处理：微生物杀虫剂200倍液、微生物杀虫剂500倍液、微生物杀虫剂750倍液、微生物杀虫剂1000倍液及清水对照。每处理重复3次，随机区组排列，各处理喷用量一致。
(3)调查与统计
施药前调查虫口基数。每个处理随机选择3棵树进行标记，调查并记树上虫口数。施药后5min、30min、60min分别调查每个标记点的残虫量。
(4)试验结果及分析
表1 WSWFJ-15生物杀虫菌剂对安宁青龙镇行道树斑蝶成虫的防治效果
注：同一列中均值±标准差标以小写字母的值表示在P＝0.05水平上差异显著(Duncan法)，字母相同差异不显著，字母不同差异显著。下同。
2017年8～9月斑蝶成虫高峰期施用杀虫菌剂，表中防效均为对应处理3次重复的平均值，数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
由表1WSWFJ-15制备微生物杀虫菌剂对斑蝶成虫的防治效果可知：WSWFJ-15菌悬浮液均匀喷雾5min后的防治效果最佳，达到61.96％，同时和稀释500倍液和稀释1000倍液防效差异不显著；喷施30min后，500倍液的防治效果最佳达84.69％，喷施60min后，防效达86.85％，总体而言，该杀虫菌剂在喷施30min后防效达到极致，因此在施用时建议将该生物杀虫剂稀释至500倍施用效果较佳。
实施例2:应用WSWFJ-15制备生物杀虫剂对石榴灯蛾幼虫的杀灭效果试验
(1)试验目的
通过对安宁青龙镇微生物发酵工程研究中心有限公司内石榴树灯蛾幼虫进行喷淋试验，验证枯草芽孢杆菌WSWFJ-15的防虫效果。
(2)试验方法
现利用WSWFJ-15制备微生物杀虫剂对灯蛾幼虫进行喷淋试验，统计各害虫死亡率及死亡时间。试验共设3个处理：微生物杀虫剂200倍液、微生物杀虫剂500倍液、微生物杀虫剂750倍液、微生物杀虫剂1000倍液及清水对照。每处理重复3次，随机区组排列。各处理喷用量一致。
(3)调查与统计
施用前调查虫口基数。每个处理随机选择3棵树进行标记，调查并记树上虫口数。施药后5min、30min、60min分别调查每个标记点的残虫量。
(4)试验结果及分析
表2 WSWFJ-15生物杀虫菌剂对安宁青龙镇石榴树灯蛾幼虫的防治效果
2017年9月灯蛾幼虫高峰期施用杀虫菌剂，表中防效均为对应处理3次重复的平均值，数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
由表2 WSWFJ-15制备微生物杀虫剂对灯蛾幼虫的防治效果可知：将微生物杀虫剂稀释到200、500、750倍施用，其对灯蛾幼虫的防治效果差异不显著，但稀释到500倍施用后其效果最佳，其防治效果在5min、10min及15min后分别达87.16％、93.37％、97.02％，同样建议将其稀释至500倍施用。
实施例3：应用WSWFJ-15制备生物杀虫剂对黄野螟的杀灭效果试验(1)试验目的
通过对西双版纳白木香害虫黄野螟进行喷淋试验，验证枯草芽孢杆菌WSWFJ-15的防虫效果。
(2)试验方法
现利用WSWFJ-15制备微生物杀虫剂对黄野螟进行喷淋试验，统计各害虫死亡率及死亡时间。试验共设3个处理：微生物杀虫剂200倍液、微生物杀虫剂500倍液、微生物杀虫剂750倍液、微生物杀虫剂1000倍液及清水对照。每处理重复3次，随机区组排列。各处理喷用量一致。
(3)调查与统计
施用前调查虫口基数。每个处理随机选择5棵树进行标记，调查并记树上虫口数。施药后10min、120min、240min分别调查每个标记点的残虫量。
(4)试验结果及分析
表3 WSWFJ-15生物杀虫剂对白木香害虫黄野螟的防治效果
2017年10月灯蛾幼虫高峰期施用杀虫菌剂，表中防效均为对应处理3次重复的平均值,数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
由表3可知:WSWFJ-15制备的生物杀虫剂对黄野螟的防治效果表明：稀释750倍以内施用，两小时内黄野螟的幼虫死亡率达到99％以上，说明该杀虫剂对黄野螟幼虫的防效较佳，同时，对于黄野螟成虫，该杀虫剂稀释500-750倍施用，两小时后，其防效可达97％以上，同样防效较佳。总体来讲该杀虫剂在稀释500倍左右，其对黄野螟的防治效果优良，可进行防治该类害虫批量生产剂示范。
本发明与现有技术比较具有以下优点：
1、广谱性强
采用本专利中的枯草芽孢杆菌WSWFJ-15生产出的微生物杀虫剂，对大部分鳞翅目、同翅目、鞘翅目、双翅目害虫及蝽类、螳螂、竹节虫、蚂蚁、白蚁及其他多种害虫都具有杀伤力，广谱性强，不需多次多品种施药，节约成本，提高经济效益。
2、杀虫效果好
采用本专利中的枯草芽孢杆菌WSWFJ-15生产出的微生物杀虫剂对害虫进行防控，害虫接触到微生物杀虫剂后，头部摇晃，身躯扭动，站立不稳，快速死亡。对蛾类害虫的成虫和幼虫均在1分钟之内击毙，对蛴螬的低龄幼虫在10秒左右杀灭，高龄幼虫在10分钟至2小时杀灭，害虫杀灭率可达80％-90％。
3、安全环保
本专利技术中的功能菌种WSWFJ-15是由自然界中筛选分离得到，未进行基因改造，田间使用不具有风险，其分泌的杀虫物质小分子环肽类化合物，可在土壤中自然快速分解，对作物、动物和人体均不产生危害，可实现田间、作物、水源无污染、无残留，与常规杀虫农药相比安全性大大提高，有利于有机农业的发展。
本发明的一种具有防虫功能的枯草芽孢杆菌及其制备方法和应用，枯草芽孢杆菌发酵后可作为微生物杀虫剂使用，并可添加到肥料中制成具有防虫功能的肥料产品进行使用，杀虫效果好，广谱性强，不需多次多品种施药，节约成本，提高经济效益。
显然，本发明的上述实施方式仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (7)

1.一种具有防虫功能的枯草芽孢杆菌，其特征在于：本枯草芽孢杆菌编号为WSWFJ-15，其保藏登记号为CGMCC No.15855。
2.根据权利要求1所述的一种具有防虫功能的枯草芽孢杆菌的制备方法和应用，其特征在于，它包括以下步骤：
第一步，菌种活化：将-80℃下保存的芽孢杆菌菌株WSWFJ-15在LB固体培养基上活化12～16h，挑取单菌落在LB固体培养基上，在35℃培养1～2天，得活化的菌株；
第二步，种子液制备：用无菌接种环刮取一环第一步中活化的菌株接种到50ml LB液体培养基中，在温度为35℃、转速为160rpm条件下培养24h，得种子液；
第三步，发酵液制备：按照菌种种子液、培养液体积比为1：120的比例将第二步所得的种子液接入到车间发酵料培养基中，在温度为36.5℃～37.5℃，转速为120rpm/min条件下培养25～30h，得发酵液，即为具有防虫功能的枯草芽孢杆菌菌液；对发酵液进行喷粉干燥，即为具有防虫功能的枯草芽孢杆菌菌粉；
所述菌液、菌粉的有效活菌数均大于2.0×1010cfu/g；
第四步，微生物杀虫剂制备：将第三步中所得的菌液中按照重量比加入0.05％～0.15％的吐温80和0.005％～0.015％的氮酮，混合均匀，即得微生物杀虫剂；
第五步，防虫功能肥料制备：将第三步中所得的菌粉按照重量比1％～5％加入到肥料中，混合均匀即得具有防虫功能的肥料。
3.根据权利要求2所述的一种具有防虫功能的枯草芽孢杆菌的制备方法和应用，其特征在于：所述LB液体培养基的组成成分及其配比为：细菌学蛋白胨10g，酵母提取粉5g，氯化钠10g，水1L，即得液体培养基。
4.根据权利要求2所述的一种具有防虫功能的枯草芽孢杆菌的制备方法和应用，其特征在于：所述LB固体培养基的组成成分及其配比为：细菌学蛋白胨10g，酵母提取粉5g，氯化钠10g，水1L，琼脂粉7.5g。
5.根据权利要求2所述的一种具有防虫功能的枯草芽孢杆菌的制备方法和应用，其特征在于：所述车间发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：黄豆粉1.0～1.6％、蔗糖0.1～0.5％、蛋白胨0.2～0.6％、玉米粉0.2～0.6％、碳酸钙0.3～0.9％、鱼粉0.1～0.3％、硫酸铵0.01～0.08％、硫酸镁0.02～0.05％、磷酸二氢钾0.01～0.04％、磷酸氢二钾0.02～0.05％、硫酸锰0.01～0.04％、氢氧化钠0.01～0.04％、氯化钠0.02～0.03％、消泡剂0.5～1.5％。
6.根据权利要求5所述的一种具有防虫功能的枯草芽孢杆菌的制备方法和应用，其特征在于：所述车间发酵培养基用盐酸、氢氧化钠调节pH至6.8～7.5。
7.根据权利要求2所述的一种具有防虫功能的枯草芽孢杆菌的制备方法和应用，其特征在于：所述微生物杀虫剂使用时需用水稀释使有效活菌数为1×107cfu/mL。
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