CN102907458B - 生物灭蚊剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生物灭蚊剂及其制备方法，由灭蚊真菌与灭蚊细菌复配制得，以1g湿菌丝的灭蚊真菌计，配以灭蚊细菌苏云金杆菌以色列变种（Bacillus thuringiensis var. israelensis）的个数为1.4×104～1.4×1018或配以灭蚊细菌球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericu）的个数为2.5×104～2.5×1020。灭蚊真菌为贵阳腐霉（Pythium guiyangense Su）或卡地腐霉（Pythium caronlinianum Matthews）。本发明具有既快速灭蚊、又持久制蚊的效果。

Description

生物灭蚊剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一种生物灭蚊剂，同时还涉及该生物灭蚊剂的制备方法。
背景技术
农业害虫和林业害虫每年给人类的农业、林业生产带来严重的损失。同时，蚊虫不但骚扰人群，而且可以传播20多种疾病，威胁人类健康。由于化学农药的发明，人们从虫口里夺回了粮食，也控制了媒介昆虫的数量，减少了虫媒传染病的流行。
然而长期大量使用化学杀虫剂带来了严重问题。1）环境污染，对人及生物的健康造成危害。农药中的重金属残留在土壤中，造成土壤变质，农业减产；农产品残毒含量高，出口受阻；2）生态平衡被破坏：化学农药把害虫和益虫全杀死，使自然界控制害虫的天敌大大减少，害虫数量反弹，造成更大的危害；3）害虫产生抗药性：昆虫极易产生抵抗农药毒性的能力，使农药施用的剂量越来越大，甚至农药完全失效。而开发新的化学杀虫剂要花大量资金和时间（据统计，约1亿美元和10年时间开发一种新农药）。
生物防治是采用害虫天敌或可对害虫致病的微生物来控制或杀灭害虫。其所采用的“杀虫剂”有对害虫高度特异性，对非靶生物无毒无害，不污染环境，不破坏生态平衡，不易诱导害虫的抗药性的优点，所以是很理想的害虫防治方法。但无论国际国内，农业害虫的生物防治较之医学昆虫的生物防治要发达很多，医学昆虫的生物防治是薄弱环节。
到目前为止，用得最广的生物灭蚊剂为苏云金杆菌以色列变种（Bacillus thuringiensis var. israelensis, 简称Bti）。它是胃毒型灭蚊剂。它芽孢囊内的伴孢晶体含有毒素蛋白。该伴孢晶体被蚊幼虫吃进消化道即被肠内分泌物分解，释放δ-内毒素，作用于肠上皮细胞，使其溶解。肠壁损坏，大量细菌进入血体腔引起败血症。蚊虫在细菌毒素和败血症的作用下很快死亡。Bti的优点是灭蚊能力强，灭蚊速度快，但是它在环境中生存时间比较短，持效期不长。实验证明它在阳光照射下灭蚊能力急剧下降。加上自然环境中水质、水温，以及淤泥吸附等因素的影响，它的持效时间一般为1-10天，特别是目前市场上比较多用的菌液和可湿性粉剂，持效性比较低。加上悬浮剂后，持效期可延长10多天，只有少数情况（如加大剂量）下可延长达1个多月。另外，由于Bti的杀蚊机理比较简单，有可能诱导蚊虫针对其毒素产生抗性。
另一种灭蚊细菌球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericu, 简称Bs），它与Bti一样，也属于胃毒类杀虫剂。Bs是一种普通的革兰氏阳性菌。其杀虫毒素是二元毒素蛋白质，主要位于芽孢和细胞壁，有些位于伴孢晶体。菌株产生分子量为51.4kD和41.9kD的两种毒素原蛋白，被蚊虫吞食后，在蚊幼虫肠道中活化成毒素，并发挥作用，使幼虫死亡。Bs的灭蚊作用较Bti慢，持效期较Bti稍长，但在室外也一般为1个月左右。Bti和Bs是胃毒型杀蚊剂，必须被蚊虫吃进去才能把蚊虫杀死，当它们被淤泥掩盖或包裹则不起作用。
贵阳腐霉（Pythium guiyangense Su, 简称Pg）是一种灭蚊真菌。其无性繁殖阶段游动孢子可以在水中主动搜寻蚊幼虫，在幼虫体壁囊化，发出芽管，伸入后者体内，生长繁殖，夺取营养，破坏组织，使蚊幼虫死亡。其菌丝再从蚊尸中伸出体表，释放游动孢子进一步感染新的蚊幼虫，从而在蚊群中造成流行病，产生长期制约蚊虫种群的效果。同时，由于Pg的灭蚊机理复杂，涉及很多环节，蚊虫不易产生抗药性。但是，Pg的灭蚊过程比较慢，在刚施用时杀蚊作用不明显，因而不易被大家接受，其应用由此受限。
另一种灭蚊真菌卡地腐霉（Pythium caronlinianum Matthews）的灭蚊效果与Pg类似。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种既快速灭蚊、又持久制蚊的生物灭蚊剂。
本发明的另一目的在于提供该生物灭蚊剂的制备方法。
本发明的一种生物灭蚊剂，由灭蚊真菌与灭蚊细菌复配制得，以1g湿菌丝的灭蚊真菌计，配以灭蚊细菌苏云金杆菌以色列变种（Bti）个数为1.4×104～1.4×1018或配以灭蚊细菌球形芽孢杆菌（Bs）的个数为2.5×104～2.5×1020。
其中：灭蚊真菌为贵阳腐霉（Pg）或卡地腐霉。
一种生物灭蚊剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）采用SFE或KPYG2液体培养基摇床培养灭蚊真菌 5天，培养温度25℃±1℃，摇床转速120rpm；滤出菌丝，无菌水洗涤3次，加水至原体积，粉碎机高速粉碎10秒，备用；
（2）配制1%～3%（W/V）海藻酸钠溶液；
（3）将灭蚊真菌菌丝悬液与海藻酸钠溶液按1:4比例混合，拌匀；
（4）将上述混合液缓慢滴入1%～5%（W/V）氯化钙溶液,微胶囊颗粒形成，沉淀，0.5～3小时后滤出微胶囊，清水冲洗备用；
（5）接种灭蚊细菌于灭蚊细菌液体培养基, 摇床培养，转速120rpm, 温度30℃±1℃；48小时后，离心收集芽孢，用时稀释至以下密度：1.4×104～1.4×1019，得芽孢悬液；
（6）按1～10ml细菌芽孢悬液/100g微胶囊的比例将芽孢悬液与微胶囊混匀，包装。
一种生物灭蚊剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）采用SFE或KPYG2液体培养基摇床培养灭蚊真菌5天，培养温度25℃±1℃，摇床转速120rpm；滤出菌丝，无菌水洗涤3次，加水至原体积，粉碎机高速粉碎10秒，备用；
（2）将准备好的灭蚊真菌菌液在无菌条件下加入BF培养基，每100克（湿重）培养基加菌液15ml,拌匀，静置培养，培养温度25℃±1℃；
（3）采用灭蚊细菌液体培养基，接种灭蚊细菌，摇床培养48小时，摇床速度：120rmp, 培养温度30℃±1℃；将培养好的菌液在无菌条件下加入HF培养基，每100克（湿重）培养基加菌液15ml，拌匀，静置培养，培养温度30℃±1℃；
（4）5天后，将上述培养物按灭蚊真菌培养物:灭蚊细菌培养物=1:3的比例均匀拌在一起，包装。
上述的生物灭蚊剂的制备方法，其中KPYG2培养基的制备方法为：将1.5克蛋白胨、1.5克酵母粉 、3.0克葡萄糖、0.025克胆固醇、0.11克无水氯化钙、1.0克玉米油混合，加水至1000毫升，121℃灭菌30min；
上述的生物灭蚊剂的制备方法，其中SFE（葵花籽培养基）的制备方法为：生葵花籽100克加水1000毫升，粉碎，6层纱布过滤，滤液再加水至2000毫升；分装冷冻于-20℃。用时，取出解冻，121℃灭菌30min；
上述的生物灭蚊剂的制备方法，其中灭蚊细菌液体培养基为苏云金杆菌以色列变种液体培养基，其制备方法为：将0.7g酵母膏、0.2g硫酸镁（MgSO4·7H2O）、1g蛋白胨、1g磷酸氢二钾、1g葡萄糖、和0.2g硫酸铵混合，加蒸馏水至1000ml，pH值为7.0-7.2，121℃灭菌30min。（固体培养基加琼脂1.5%-2%）；
上述的生物灭蚊剂的制备方法，其中灭蚊细菌液体培养基为球形芽孢杆菌液体培养基，其制备方法为：将3.0g蛋白胨、5.0g牛肉膏、5.0g酵母膏、0.01g MnCl2.4H2O、0.1g CaCl2.2H2O、0.2g MgCl2.6H2O，加蒸馏水至1000ml，pH值为7.0-7.2，121℃灭菌30min。（固体培养基加琼脂1.5%-2%）。
上述的生物灭蚊剂的制备方法，其中BF培养基的制备方法为：米糠粉加面粉按1:1-3:1混合，再加蒸馏水拌匀，比例为60ml水/100g糠面混合物，121℃灭菌30分钟；
上述的生物灭蚊剂的制备方法，其中HF培养基的制备方法为：麦麸粉加面粉按1:1-3:1混合，再加蒸馏水拌匀，比例为60ml水/100g麸面混合物，121℃灭菌30分钟。
本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：利用的灭蚊真菌Pg或卡地腐霉是兼性寄生类微生物。其菌丝和游动孢子可以在环境中适合的有机物中生长，因此，它可以在蚊虫生境中定植、循环，从而达到长期制蚊的目的。这一优点可以大大减少施药次数，降低灭蚊成本且蚊虫不易产生抗药性。真菌通过释放的游动孢子主动搜寻蚊幼虫，并从其体表入侵，因此其攻击蚊虫的机会就比较多。加之它可以在蚊虫生境中生长繁殖，特别是可以在被灭蚊细菌杀死的蚊幼虫尸体中繁殖，有利于菌株的复壮，因此其控制蚊虫种群的作用就比较稳固而持久。将其与灭蚊速度快，但是持效时间短的灭蚊细菌进行复配，通过本发明的制备方法从而获得一种新型的生物灭蚊剂。该新型生物灭蚊剂综合了二者的优点，不仅能够较快地杀灭水中蚊幼虫，还能在较长时间保持对水中蚊虫种群的抑制作用。从现代生态学的观点来考虑，治理蚊虫不是要消灭蚊虫，而是通过实现生态系统的平衡和和谐，来达到对蚊虫密度的控制的目的。从这一角度考虑，本新型生物灭蚊剂有其他灭蚊剂不可比拟的优势。
具体实施方式
实施例1：
一种生物灭蚊剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）采用SFE或KPYG2液体培养基摇床培养Pg5天，培养温度25℃±1℃，摇床转速120rpm；滤出菌丝，无菌水洗涤3次，加水至原体积，粉碎机高速粉碎10秒，备用；
（2）配制1%～3%（W/V）海藻酸钠溶液；
（3）将Pg菌丝悬液与海藻酸钠溶液按1:4比例混合，拌匀；
（4）将上述混合液缓慢滴入1%～5%（W/V）氯化钙溶液,微胶囊颗粒形成，沉淀，0.5～3小时后滤出微胶囊，清水冲洗备用；
（5）接种Bti菌于Bti液体培养基, 摇床培养，转速120rpm, 温度30℃±1℃；48小时后，离心收集芽孢，用时稀释至以下密度：1.4×105，得芽孢悬液；
（6）按1ml细菌芽孢悬液/100g微胶囊的比例将芽孢悬液与Pg微胶囊混匀，包装。
其中：KPYG2培养基的制备方法为：将1.5克蛋白胨、1.5克酵母粉 、3.0克葡萄糖、0.025克胆固醇、0.11克无水氯化钙、1.0克玉米油混合，加水至1000毫升，121℃灭菌30min；
SFE（葵花籽培养基）的制备方法为：生葵花籽100克加水1000毫升，粉碎，6层纱布过滤，滤液再加水至2000毫升；分装冷冻于-20℃。用时，取出解冻，121℃灭菌30min；
Bti 液体培养基的制备方法为：将0.7g酵母膏、0.2g硫酸镁（MgSO4·7H2O）、1g蛋白胨、1g磷酸氢二钾、1g葡萄糖、和0.2g硫酸铵混合，加蒸馏水至1000ml，pH值为7.0-7.2，121℃灭菌30min。（固体培养基加琼脂1.5%-2%）。
实施例2：
一种生物灭蚊剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）采用SFE或KPYG2液体培养基摇床培养Pg 5天，培养温度25℃±1℃，摇床转速120rpm；滤出菌丝，无菌水洗涤3次，加水至原体积，粉碎机高速粉碎10秒，备用；
（2）配制1%～3%（W/V）海藻酸钠溶液；
（3）将Pg菌丝悬液与海藻酸钠溶液按1:4比例混合，拌匀；
（4）将上述混合液缓慢滴入1%～5%（W/V）氯化钙溶液,微胶囊颗粒形成，沉淀，0.5～3小时后滤出微胶囊，清水冲洗备用；
（5）接种Bti菌于Bti液体培养基, 摇床培养，转速120rpm, 温度30℃±1℃；48小时后，离心收集芽孢，用时稀释至以下密度：1.4×1019，得芽孢悬液；
（6）按1.2ml细菌芽孢悬液/100g微胶囊的比例将芽孢悬液与Pg微胶囊混匀，包装。
其中：SFE或KPYG2液体培养基的制备方法同实施例1。
Bti液体培养基的制备方法同实施例1。
实施例3：
（1）采用SFE或KPYG2液体培养基摇床培养Pg5天，培养温度25℃±1℃，摇床转速120rpm；滤出菌丝，无菌水洗涤3次，加水至原体积，粉碎机高速粉碎10秒，备用；
（2）配制1%～3%（W/V）海藻酸钠溶液；
（3）将Pg菌丝悬液与海藻酸钠溶液按1:4比例混合，拌匀；
（4）将上述混合液缓慢滴入1%～5%（W/V）氯化钙溶液,微胶囊颗粒形成，沉淀，0.5～3小时后滤出微胶囊，清水冲洗备用；
（5）接种Bti菌于Bti液体培养基, 摇床培养，转速120rpm, 温度30℃±1℃；48小时后，离心收集芽孢，用时稀释至以下密度：1.4×109，得芽孢悬液；
（6）按1ml细菌芽孢悬液/100g微胶囊的比例将芽孢悬液与Pg微胶囊混匀，包装。
其中：SFE或KPYG2液体培养基的制备方法同实施例1。
Bti 液体培养基的制备方法同实施例1。
实施例4：
一种生物灭蚊剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）采用SFE或KPYG2液体培养基摇床培养Pg 5天，培养温度25℃±1℃，摇床转速120rpm；滤出菌丝，无菌水洗涤3次，加水至原体积，粉碎机高速粉碎10秒，备用；
（2）配制1%～3%（W/V）海藻酸钠溶液；
（3）将Pg菌丝悬液与海藻酸钠溶液按1:4比例混合，拌匀；
（4）将上述混合液缓慢滴入1%～5%（W/V）氯化钙溶液,微胶囊颗粒形成，沉淀，0.5～3小时后滤出微胶囊，清水冲洗备用；
（5）接种Bs菌于Bs液体培养基, 摇床培养，转速120rpm, 温度30℃±1℃；48小时后，离心收集芽孢，用时稀释至以下密度：2.5×105，得芽孢悬液；
（6）按2.2ml细菌芽孢悬液/100g微胶囊的比例将芽孢悬液与Pg微胶囊混匀，包装。
其中：SFE或KPYG2液体培养基的制备方法同实施例1。
Bs液体培养基的制备方法为：将3.0g蛋白胨、5.0g牛肉膏、5.0g酵母膏、0.01g MnCl2.4H2O、0.1g CaCl2.2H2O、0.2g MgCl2.6H2O，加蒸馏水至1000ml，pH值为7.0-7.2，121℃灭菌30min。（固体培养基加琼脂1.5%-2%）。
实施例5：
一种生物灭蚊剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）采用SFE或KPYG2液体培养基摇床培养Pg 5天，培养温度25℃±1℃，摇床转速120rpm；滤出菌丝，无菌水洗涤3次，加水至原体积，粉碎机高速粉碎10秒，备用；
（2）配制1%～3%（W/V）海藻酸钠溶液；
（3）将Pg菌丝悬液与海藻酸钠溶液按1:4比例混合，拌匀；
（4）将上述混合液缓慢滴入1%～5%（W/V）氯化钙溶液,微胶囊颗粒形成，沉淀，0.5～3小时后滤出微胶囊，清水冲洗备用；
（5）接种Bs菌于Bs液体培养基, 摇床培养，转速120rpm, 温度30℃±1℃；48小时后，离心收集芽孢，用时稀释至以下密度：2.5×1021，得芽孢悬液；
（6）按2.2ml细菌芽孢悬液/100g微胶囊的比例将芽孢悬液与Pg微胶囊混匀，包装。
其中：SFE或KPYG2液体培养基的制备方法同实施例1。
Bs液体培养基的制备方法实施例4.
实施例6：
（1）采用SFE或KPYG2液体培养基摇床培养Pg5天，培养温度25℃±1℃，摇床转速120rpm；滤出菌丝，无菌水洗涤3次，加水至原体积，粉碎机高速粉碎10秒，备用；
（2）配制1%～3%（W/V）海藻酸钠溶液；
（3）将Pg菌丝悬液与海藻酸钠溶液按1:4比例混合，拌匀；
（4）将上述混合液缓慢滴入1%～5%（W/V）氯化钙溶液,微胶囊颗粒形成，沉淀，0.5～3小时后滤出微胶囊，清水冲洗备用；
（5）接种Bs菌于Bs液体培养基, 摇床培养，转速120rpm, 温度30℃±1℃；48小时后，离心收集芽孢，用时稀释至以下密度：2.5×109，得芽孢悬液；
（6）按2.2ml细菌芽孢悬液/100g微胶囊的比例将芽孢悬液与Pg微胶囊混匀，包装。
其中：SFE或KPYG2液体培养基的制备方法同实施例1。
Bs 液体培养基的制备方法同实施例4。
实施例7：
一种生物灭蚊剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）采用SFE或KPYG2液体培养基摇床培养Pg 5天，培养温度25℃±1℃，摇床转速120rpm；滤出菌丝，无菌水洗涤3次，加水至原体积，粉碎机高速粉碎10秒，备用；
（2）将准备好的Pg菌液在无菌条件下加入BF培养基，每100克（湿重）培养基加菌液15ml,拌匀，静置培养，培养温度25℃±1℃；
（3）采用Bti的液体培养基，接种Bti菌，摇床培养48小时，摇床速度：120rmp, 培养温度30℃±1℃；将培养好的菌液在无菌条件下加入HF培养基，每100克（湿重）培养基加菌液15ml，拌匀，静置培养，培养温度30℃±1℃；
（4）5天后，将上述培养物按Pg培养物:细菌培养物=1:3的比例均匀拌在一起，包装。
其中：SFE或KPYG2液体培养基的制备方法同实施例1。
Bti 液体培养基的制备方法同实施例1。
BF培养基的制备方法为：米糠粉加面粉按1:1-3:1混合，再加蒸馏水拌匀，比例为60ml水/100g糠面混合物，121℃灭菌30分钟；
HF培养基的制备方法为：麦麸粉加面粉按1:1-3:1混合，再加蒸馏水拌匀，比例为60ml水/100g麸面混合物，121℃灭菌30分钟。
实施例8：
一种生物灭蚊剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）采用SFE或KPYG2液体培养基摇床培养Pg 5天，培养温度25℃±1℃，摇床转速120rpm；滤出菌丝，无菌水洗涤3次，加水至原体积，粉碎机高速粉碎10秒，备用；
（2）将准备好的Pg菌液在无菌条件下加入BF培养基，每100克（湿重）培养基加菌液15ml,拌匀，静置培养，培养温度25℃±1℃；
（3）采用Bs的液体培养基，接种Bs菌，摇床培养48小时，摇床速度：120rmp, 培养温度30℃±1℃；将培养好的菌液在无菌条件下加入HF培养基，每100克（湿重）培养基加菌液15ml，拌匀，静置培养，培养温度30℃±1℃；
（4）5天后，将上述培养物按Pg培养物:细菌培养物=1:3的比例均匀拌在一起，包装。
其中：SFE或KPYG2液体培养基的制备方法同实施例1。
Bs液体培养基的制备方法同实施例1。
BF培养基、HF培养基的制备方法同实施例7。
实施例9：
一种生物灭蚊剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）采用SFE或KPYG2液体培养基摇床培养Pg 5天，培养温度25℃±1℃，摇床转速120rpm；滤出菌丝，无菌水洗涤3次，加水至原体积，粉碎机高速粉碎10秒，备用；
（2）将准备好的卡地腐霉（Pythium caronlinianum Matthews）菌液在无菌条件下加入BF培养基，每100克（湿重）培养基加菌液15ml,拌匀，静置培养，培养温度25℃±1℃；
（3）采用Bs的液体培养基，接种Bs菌，摇床培养48小时，摇床速度：120rmp, 培养温度30℃±1℃；将培养好的菌液在无菌条件下加入HF培养基，每100克（湿重）培养基加菌液15ml，拌匀，静置培养，培养温度30℃±1℃；
（4）5天后，将上述培养物按Pg培养物:细菌培养物=1:3的比例均匀拌在一起，包装。
其中：SFE或KPYG2液体培养基的制备方法同实施例1。
以上为液体培养基，固体培养基需按1.5%加琼脂。高温高压消毒后倒在培养皿中，冷却即可；
Bs液体培养基的制备方法同实施例1。
BF培养基、HF培养基的制备方法同实施例7。
灭蚊效果实验例
一．方法
   室内实验：
白色塑料盒盛过夜自来水200ml, 致倦库蚊（Culex quinquefaciatus）2-3龄幼虫25只，4%鸡肝粉悬液6滴为基本条件，再分别加入待测灭蚊剂，定时观察蚊虫死亡数，计算死亡率。每组3个重复，设空白组做对照。
室外实验：长期实验中，待前一批蚊虫死亡或羽化后，再加入下一批蚊虫，继续观察。
   室外实验：
小型储水桶（下直径15cm, 上直径20cm, 深24cm）盛水4L, 桶底加入灭菌土壤约50g, 灭菌木屑7g。为模拟自然状况中蚊虫不断繁殖，不定期加入2-3龄实验室饲养的致倦库蚊幼虫。各实验组设空白对照组(除不加任何灭蚊细菌或真菌外，其他条件均与实验组相同)。每组3个重复。每3天一次调查蚊虫密度。
二．实验结果：
注：表中数据跟不同字母者数据差异有统计学意义。

Claims (5)

1.一种生物灭蚊剂，其特征在于：由灭蚊真菌与灭蚊细菌复配制得，以1g湿菌丝的灭蚊真菌计，配以灭蚊细菌苏云金杆菌以色列变种个数为1.4×104～1.4×1018或配以灭蚊细菌球形芽孢杆菌的个数为2.5×104～2.5×1020；所述的灭蚊真菌为贵阳腐霉或卡地腐霉；采用SFE或KPYG2液体培养基摇床培养灭蚊真菌，其中SFE的制备方法为：生葵花籽100克加水1000毫升，粉碎，6层纱布过滤，滤液再加水至2000毫升；分装冷冻于-20℃；用时，取出解冻，121℃灭菌30min；KPYG2培养基的制备方法为：将1.5克蛋白胨、1.5克酵母粉 、3.0克葡萄糖、0.025克胆固醇、0.11克无水氯化钙、1.0克玉米油混合，加水至1000毫升，用时121℃灭菌30min；其中所述的生物灭蚊剂由下述两种制备方法之一制得；
制备方法一：
（1）采用SFE或KPYG2液体培养基摇床培养灭蚊真菌 5天，培养温度25℃±1℃，摇床转速120rpm；滤出菌丝，无菌水洗涤3次，加水至原体积，粉碎机高速粉碎10秒，备用；
（2）配制1%～3%W/V海藻酸钠溶液；
（3）将灭蚊真菌菌丝悬液与海藻酸钠溶液按1:4比例混合，拌匀；
（4）将上述混合液缓慢滴入1%～5%W/V氯化钙溶液,微胶囊颗粒形成，沉淀，0.5～3小时后滤出微胶囊，清水冲洗备用；
（5）接种灭蚊细菌于灭蚊细菌液体培养基, 摇床培养，转速120rpm, 温度30℃±1℃；48小时后，离心收集芽孢，用时稀释至以下密度：1.4×104～2.5×1020，得芽孢悬液；
（6）按1～10ml细菌芽孢悬液/100g微胶囊的比例将芽孢悬液与微胶囊混匀，包装；
制备方法二：
（1）采用SFE或KPYG2液体培养基摇床培养灭蚊真菌 5天，培养温度25℃±1℃，摇床转速120rpm；滤出菌丝，无菌水洗涤3次，加水至原体积，粉碎机高速粉碎10秒，备用；
（2）将准备好的灭蚊真菌菌液在无菌条件下加入BF培养基，每100克湿重培养基加菌液15ml,拌匀，静置培养，培养温度25℃±1℃；其中BF培养基的制备方法为：米糠粉加面粉按1:1-3:1混合，再加蒸馏水拌匀，比例为60ml水/100g糠面混合物，121℃灭菌30分钟； 
（3）采用灭蚊细菌液体培养基，接种灭蚊细菌，摇床培养48小时，摇床速度：120rmp, 培养温度30℃±1℃；将培养好的菌液在无菌条件下加入HF培养基，每100克湿重培养基加菌液15ml，拌匀，静置培养，培养温度30℃±1℃；其中HF培养基的制备方法为：麦麸粉加面粉按1:1-3:1混合，再加蒸馏水拌匀，比例为60ml水/100g麸面混合物，121℃灭菌30分钟；
（4）5天后，将上述培养物按灭蚊真菌培养物:灭蚊细菌培养物=1:3的比例均匀拌在一起，包装。
2.如权利要求1所述的一种生物灭蚊剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）采用SFE或KPYG2液体培养基摇床培养灭蚊真菌 5天，培养温度25℃±1℃，摇床转速120rpm；滤出菌丝，无菌水洗涤3次，加水至原体积，粉碎机高速粉碎10秒，备用；
（2）配制1%～3%W/V海藻酸钠溶液；
（3）将灭蚊真菌菌丝悬液与海藻酸钠溶液按1:4比例混合，拌匀；
（4）将上述混合液缓慢滴入1%～5%W/V氯化钙溶液,微胶囊颗粒形成，沉淀，0.5～3小时后滤出微胶囊，清水冲洗备用；
（5）接种灭蚊细菌于灭蚊细菌液体培养基, 摇床培养，转速120rpm, 温度30℃±1℃；48小时后，离心收集芽孢，用时稀释至以下密度：1.4×104～2.5×1020，得芽孢悬液；
（6）按1～10ml细菌芽孢悬液/100g微胶囊的比例将芽孢悬液与微胶囊混匀，包装。
3.如权利要求1所述的一种生物灭蚊剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）采用SFE或KPYG2液体培养基摇床培养灭蚊真菌 5天，培养温度25℃±1℃，摇床转速120rpm；滤出菌丝，无菌水洗涤3次，加水至原体积，粉碎机高速粉碎10秒，备用；
（2）将准备好的灭蚊真菌菌液在无菌条件下加入BF培养基，每100克湿重培养基加菌液15ml,拌匀，静置培养，培养温度25℃±1℃；（3）采用灭蚊细菌液体培养基，接种灭蚊细菌，摇床培养48小时，摇床速度：120rmp, 培养温度30℃±1℃；将培养好的菌液在无菌条件下加入HF培养基，每100克湿重培养基加菌液15ml，拌匀，静置培养，培养温度30℃±1℃；（4）5天后，将上述培养物按灭蚊真菌培养物:灭蚊细菌培养物=1:3的比例均匀拌在一起，包装。
4.如权利要求2或3所述的生物灭蚊剂的制备方法，其中灭蚊细菌液体培养基为Bti液体培养基，其制备方法为：将0.7g酵母膏、0.2g硫酸镁、1g蛋白胨、1g磷酸氢二钾、1g葡萄糖、和0.2g硫酸铵混合，加蒸馏水至1000ml，pH值为7.0-7.2，121℃灭菌30min。
5.如权利要求2或3所述的生物灭蚊剂的制备方法，其中灭蚊细菌液体培养基为Bs液体培养基，其制备方法为：将3.0g蛋白胨、5.0g牛肉膏、5.0g酵母膏、0.01g MnCl2.4H2O、0.1g CaCl2.2H2O、0.2g MgCl2.6H2O，加蒸馏水至1000ml，pH值为7.0-7.2，121℃灭菌30min。
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