CN108018242B - 一种粘质沙雷氏菌及其分离方法和应用 - Google Patents

一种粘质沙雷氏菌及其分离方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种粘质沙雷氏菌及其分离方法和应用。本发明的一种粘质沙雷氏菌菌株，该菌株为粘质沙雷氏菌；保藏名称为粘质沙雷氏菌LS‑1；保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学，保藏日期2017年11月13日，保藏编号CCTCC NO：M2017686。本发明粘质沙雷氏菌对植物害虫有致病性，作为杀虫剂杀虫效果好。

Description

一种粘质沙雷氏菌及其分离方法和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种专门对杀灭樟巢螟及水稻二化螟的粘质沙雷氏菌LS-1及其分离方法和在杀虫剂上的应用。
背景技术
香樟不仅作为园林美化植物，也是江西省香精香料的重要来源植物，其防治也遵循绿色环保、少污染、少残留的方法。有害生物控制作为需求导向的重大科学问题研究，通过寻找新型的杀虫细菌作为微生物农药，以克服昆虫抗药性，扩大杀虫谱，稳定生态环境。
樟巢螟Orthaga achatina Warre(Bulter)(学名橄绿瘤丛螟Orthaga olivacea(Warren))鳞翅目，螟蛾科，常几条或几十条群集为害，并能吐丝缀叶，枝条上挂着少数干枯的残叶、网巢及黏附虫粪。作为重要的绿色环保美化树木：香樟(Cinnamomum camphoraL.Presl)，在外观上可见嫩枝和叶片结织成虫巢的现象，严重影响了园林绿化及用途。
水稻是我国主要粮食作物之一，也是受虫害侵袭最为严重的粮食作物之一。在粮食安全生产中，水稻占有极其重要的地位。然而，全国稻区病虫害常年发生，每年可造成稻谷损失约60万吨。因此，有效地控制水稻害虫对水稻增产具有重要意义。
二化螟(Chilo sμppressalis Walker)属鳞翅目，螟蛾科，是我国水稻上危害最为严重的常发性害虫之一，在分蘖期受害造成枯鞘、枯心苗，在穗期受害造成虫伤株和白穗，一般年份减产3％～5％，严重时减产在3成以上造成的经济损失约为115亿元，二化螟除危害水稻外，还能危害茭白、玉米、高粱、甘蔗、油菜、蚕豆、麦类以及芦苇、等。目前我国防治水稻二化螟的主要药剂为沙蚕毒素类的杀虫单，杀虫双，三唑磷以及进口农药氟虫晴，锐劲特等化学农药。纯生物农药也得到了逐步推广。进口农药氟虫晴对二化螟防效较好但存在着防治成本高，对水生动物不安全等缺点。因此，开发选用新型高效农药新品种有效防治二化螟显得十分迫切。
微生物源农药(microbial insecticide)是指利用微生物活体及其代谢产物，用来杀虫、灭鼠、灭菌、除草等的制剂，主要包括真菌源、细菌源、病毒源、线虫源及抗生素类农药。微生物源杀虫剂具有低毒、污染轻、部分药物选择性高等优点，符合农药从传统的有机化学物质向“环境和谐农药”或“生物合理性农药”转化的发展趋势，受到国内外研究者及使用者的青睐。
粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)是一种重要的昆虫致病菌，并作为害虫的病原微生物受到生物防治工作者的高度关注。人们已从为害植物体器官上的多种有害昆虫体内分离获得了具有杀虫活性的粘质沙雷氏菌。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供第一目的在于提供一种粘质沙雷氏菌LS-1Serratia marcescens.LS-1。
本发明的第二目的还在于提供一种粘质氏菌的分离方法。
本发明的第三目的还在于提供一种粘质沙雷氏菌的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明的一种粘质沙雷氏菌菌株，该菌株为粘质沙雷氏菌LS-1 Serratia marcescens.LS-1；保藏名称为粘质沙雷氏菌LS-1Serratia marcescens.LS-1；保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学，保藏日期2017年11月13日，保藏编号CCTCC NO：M2017686。
本发明所述的粘质沙雷氏菌制备的粘质沙雷氏菌菌剂。
进一步地，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)权利要求1所述的粘质沙雷氏菌的发酵培养物；
(b)权利要求1所得粘质沙雷氏菌细胞的超声裂解上清；
(c)权利要求1所得粘质沙雷氏菌细胞的超声裂解沉淀。
本发明所述的粘质沙雷氏菌，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明所述的粘质沙雷氏菌LS-1 Serratia marcescens.LS-1的分离方法，包括如下步骤：采集自公园自然死亡的枫香丛螟浸入75％乙醇10s，进行虫体表面消毒，在无菌条件下，取其腔体内组织为材料，将其研磨成匀浆，加无菌ddH2O 5ml，取100μl涂布于LB固体培养基平板上，37℃培养12-16h，挑取单菌落纯化获得粘质沙雷氏菌菌株LS-1。
进一步地，所述的LB固体培养基组成为：氯化钠10.0g，蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml。
本发明所述的粘质沙雷氏菌LS-1 Serratia marcescens.LS-1作为生物杀虫剂中的应用。
进一步地，所述的粘质沙雷氏菌LS-1 Serratia marcescens.LS-1作为樟巢螟及水稻二化螟杀虫剂的应用。
本发明所述的粘质沙雷氏菌LS-1 Serratia marcescens.LS-1作为种子包衣剂中的应用。
有益效果：本发明粘质沙雷氏菌对植物害虫有致病性，作为杀虫剂杀虫效果好。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)菌株LS-1对樟巢螟和水稻二化螟有明显的毒性，当浓度达3.38×108cfu/ml时，4d对水稻二化螟死亡率达90.67％，菌株LS-1具有杀螟蛾科活性，5d樟巢螟的致死率达71.67％；3d樟巢螟的致死率达50％；说明菌株LS-1可以防止螟蛾科害虫对植物的损害。
(2)本发明粘质沙雷氏菌作为专门杀樟巢螟及水稻二化螟杀虫剂、种子包衣剂和肥料添加剂使用，减少农业生产中农药残留、靶生物抗药性及面源污染等问题。
附图说明
图1为本发明菌株LS-1的扫描电镜图；
图2为本发明菌株LS-1在固体LB培养基上培养基14h的菌落图；
图3为本发明菌株LS-1的16S rDNA序列PCR扩增电泳图；
图4为本发明菌株LS-1感染试验后的樟巢螟图；A:茧内感染死亡的樟巢螟；B：茧外感染死亡的樟巢螟；
图5为本发明菌株LS-1二化螟的感染试验，A:指形管中感染二化螟；B：感染死亡的二化螟。
具体实施方式
以下实施例仅处于说明性目的，而不是想要限制本发明的范围。
本发明的一种粘质沙雷氏菌菌株，该菌株为粘质沙雷氏菌；保藏名称为粘质沙雷氏菌LS-1 Serratia marcescens.LS-1；保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学，保藏日期2017年11月13日，保藏编号CCTCC NO：M2017686。
本发明所述的粘质沙雷氏菌LS-1 Serratia marcescens.LS-1制备的粘质沙雷氏菌菌剂。
其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)权利要求1所述的粘质沙雷氏菌LS-1 Serratia marcescens.LS-1的发酵培养物；
(b)权利要求1所得粘质沙雷氏菌细胞的超声裂解上清；
(c)权利要求1所得粘质沙雷氏菌细胞的超声裂解沉淀。
本发明所述的粘质沙雷氏菌LS-1 Serratia marcescens.LS-1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明所述的粘质沙雷氏菌LS-1 Serratia marcescens.LS-1的分离方法，包括如下步骤：采集自公园自然死亡的枫香丛螟浸入75％乙醇10s，进行虫体表面消毒，在无菌条件下，取其腔体内组织为材料，将其研磨成匀浆，加无菌ddH2O 5ml，取100μl涂布于LB固体培养基平板上，37℃培养12-16h，挑取单菌落纯化获得粘质沙雷氏菌菌株LS-1。
所述的LB固体培养基组成为：氯化钠10.0g，蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml。
本发明所述的粘质沙雷氏菌LS-1 Serratia marcescens.LS-1作为生物杀虫剂中的应用。
所述的粘质沙雷氏菌LS-1 Serratia marcescens.LS-1作为樟巢螟及水稻二化螟杀虫剂的应用。
本发明所述的粘质沙雷氏菌LS-1 Serratia marcescens.LS-1作为种子包衣剂中的应用。
实施例1
粘质沙雷氏菌LS-1 Serratia marcescens.LS-1的分离及回归感染实验
采集自公园自然死亡的枫香丛螟浸入75％乙醇10s，进行虫体表面消毒，在无菌条件下，取其腔体内组织为材料，将其研磨成匀浆，加无菌ddH2O 5ml，取100μl涂布于LB固体培养基平板上，37℃培养12-16h，挑取单菌落纯化获得粘质沙雷氏菌菌株LS-1；
所述的LB固体培养基组成为：氯化钠10.0g，蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml；
将菌株LS-1接种到LB培养基中，在37℃180rpm下摇床培养2d，获得菌株LS-1细菌悬浮液，将细菌悬浮液浓度调至108cfu/ml，分别对健康的二化螟幼虫、香樟巢螟进行回归感染实验。细菌悬浮液涂抹香樟叶片后试虫；使试虫自然采食(相当于通过消化道途径接种感染)；二化螟幼虫感染试验：菌液浸泡2-5min刚发芽的ZH11水稻种子后试虫。观察并收集死虫，对死虫进行病原菌的再分离，方法同步骤(1)所述；
结果分析：根据科赫氏法则，用分离的病原菌株LS-1纯培养物回归感染樟巢螟，樟巢螟与菌体接触24h后开始死亡，72h达到死亡高峰，幼虫感病后行动迟缓不活跃，基本停食，樟巢螟死亡后体表变红，身体逐渐软化。从感病而死的樟巢螟体中重新分离培养，所得的再分离细菌在培养性状等方面都与原接种的菌株LS-1一致，据此确认樟巢螟为菌株LS-1感染致死。
实施例2
菌株LS-1的鉴定
菌株LS-1的形态分析：菌株LS-1接种于LB固体培养基上于37℃恒温培养14h，观察单菌落形态、大小、色泽：菌株LS-1呈短杆状，无芽孢，有荧光，革兰氏染色阴性，周生鞭毛，具有运动性参见图1)。在LB固体培养基上14h后菌落呈圆形，光滑湿润，边沿整齐，表面隆起(参见图2)，28℃与37℃恒温培养无差别颜色；
16S rDNA序列测定：将菌株LS-1接种到LB液体培养基中，在37℃180rpm下摇床培养2d，获得菌株LS-1细菌悬浮液，1000rpm离心10min，取上清，进行DNA提取，采用通用引物F27和R1492对菌株LS-1的基因组DNA进行16S rDNA的PCR扩增。
50μL扩增反应体系所加试剂：模板为细菌基因组DNA 2μL，rTaq酶0.5μL，10×Buffer 5μL，4×dNTP 4μL，引物0.5μL，ddH2O 38μL；95℃预变性5min，95℃变性30S，58℃复性30S，72℃延伸1min 30S，30个循环后72℃温育8min，25℃1S。扩增的PCR产物，经过0.8％琼脂糖凝胶验证，条带在1.5Kb左右的PCR产物送样到上海生物工程有限公司测序。
菌株LS-1的生理生化测定：对菌株Ls-1进行乳糖、木胶糖、阿拉伯糖、棉籽糖、蜜二糖、山梨醇、西蒙氏枸橼酸盐、胆汁七叶苷、丙二酸盐、苯丙氨酸脱氨酸、侧金盏花醇、鸟氨酸、赖氨酸脱羧酶、赖氨酸、精氨酸脱羧酶、甲基红、硫化氢、尿素等28种生理生化指标测定。
测定方法：按杭州天和微生物试剂有限公司生产的肠杆菌科细菌生化试剂盒说明书进行测定及结果判定。
生理生化鉴定结果表明(见下表1)：菌株LS-1兼性好氧；甲基红试验、尿素、硫化氢及氧化酶反应阴性；精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱酸酶、苯丙氨酸脱羧酶及赖氨酸脱酸酶反应呈阳性；该菌能利用甘露醇、山梨醇、木糖、葡萄糖、蔗糖产酸，不能利用蜜二糖、乳糖、阿拉伯糖作为唯一碳源；能利用侧金盏花醇、西蒙氏枸橼酸盐、胆汁七叶苷，可使明胶水解。菌株LS-1的生理生化特性如表1所示，
表1
检测项目 反应 检测项目 反应
革兰氏染色 - 精氨酸脱羧酶 +
氧化酶 - 鸟氨酸脱酸酶 +
运动性 + 苯丙氨酸脱羧酶 +
硫化氢 - 赖氨酸脱酸酶 +
甘露醇 + 胆汁七叶苷 -
尿素 - 甲基红试验 -
吲哚试剂 + 葡萄糖产酸 +
蜜二糖 - 蔗糖 +
DNase + 棉籽糖 -
山梨醇 + 葡萄糖磷酸盐胨 -
乳糖 - 阿拉伯糖 -
木糖 + 明胶液化 +
侧金盏花醇 + 西蒙氏枸橼酸盐 +
注：+阳性；-阴性。
结果表明：测得菌株LS-1的16S rDNA为1500bp左右(参见图3)，进行16S rRNA基因序列测定与系统发育学分析，将此菌株的16SrRNA基因序列在NCBI上进行同源性检索，发现该菌株与粘质沙雷氏菌属细菌的16S rRNA基因序列自然聚类，在检索出的粘质沙雷氏菌属细菌序列中，此菌株与它们的同源性达99％-98％，与之序列同源性最高的菌株序列号：FJ530951.1，同源性为99％。根据16S rDNA同源性比较解，结合菌株的形态学观察和生理学特征，将菌株LS-1鉴定为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。
实施例3
对樟巢螟的毒力测定
将鉴定后的代表菌株，接种于5mL普通LB肉汤培养基，在37℃下摇床(180rpm)培养12h进行菌种活化，从活化菌体悬浮液中取1ml接种到250ml LB液体培养基中，28℃摇床(180rpm)培养16h后，采用菌落计数法确定菌液浓度为3.38×108cfu/ml浓度后备用。
樟巢螟感染试验：阴性对照的虫体用普通LB肉汤培养基喂养，分别对健康的香樟巢螟进行人工感染实验并将试验重复3次。取同批香樟巢螟分组养殖于实验室中，经过三天以后，依旧健康作为供试虫体。处理香樟叶片后试虫；使试虫自然采食(相当于通过消化道途径接种感染)。接种后每天定时观察记录发病或死亡情况，以被感染发病、死亡，呈现出同自然病(死)香樟巢螟的发病特征、并能从死亡虫体重新分离回收到原感染菌作为致病作用的判定指标，同时设立仅接种无菌普通LB肉汤培养基的实验对照。根据不同批次试虫存活情况共检查7～10次，记录死亡虫数，结果见表2。
死亡率(％)＝死亡虫数/供试虫数×100；菌株LS-1对樟巢螟及二化螟的毒力樟巢螟感染试验结果表如表2所示，
表2Table 2Test results of infection Orthaga olivacea Warre
由表2可知：菌株Ls-1对樟巢螟有明显的毒性。当浓度达3.38×108cfu/ml时，三天死亡率达50％，五天死亡率达71.67％。
实施例3对二化螟的毒力测定
将鉴定后的代表菌株，接种于5mL普通LB肉汤培养基，在37℃下摇床(180rpm)培养12h进行菌种活化，从活化菌体悬浮液中取1ml接种到250ml LB液体培养基中，28℃摇床(180rpm)培养16h后，采用菌落计数法确定菌液浓度为3.38×108cfu/ml浓度后备用。
二化螟幼虫感染试验：阴性对照的虫体用普通LB肉汤培养基喂养，分别对健康的二化螟幼虫进行人工感染实验并将试验重复3次。取同批二化螟幼虫分组养殖于实验室中，经过三天以后，依旧健康作为供试虫体。1.是菌液浸泡2-5min刚发芽的ZH11水稻种子后试虫；2.人工饲料添加菌液试虫；将处理好的食物放入消毒后的平底玻璃管中(直径2.5cm，高7.0cm)，管底放入湿润的滤纸(滤纸不要太湿，以免淹死幼虫)每管接入二化螟初孵幼虫15头，放入3粒种子即可，并在管口用己灭菌好的黑色布双层加橡皮筋封好，每个处理5个重复，置于温度(27±1)℃，相对湿度70％-80％，光照时间16L-8D的养虫室内饲养。根据不同批次试虫存活情况共检查5～7次，记录死亡虫数，结果见表表3。二化螟幼虫感染试验结果表如表3所示：
表3Table 3Test results of infection Chilo suppressalis(Walker)larvae
由表3可知：菌株Ls-1对二化螟幼虫有明显的毒性。当浓度达3.38×108cfu/ml时，死亡率达90.67％。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
序列表
<110> 江西省科学院微生物研究所
<120> 一种粘质沙雷氏菌及其分离方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1443
<212> DNA
<213> 人工序列的描述粘质沙雷氏菌的核苷酸序列()
<400> 1
ccttggggca gcttacacat gcagtcgagc ggtagcacag gggagcttgc tccctgggtg 60
acgagcggcg gacgggtgag taatgtctgg gaaactgcct gatggagggg gataactact 120
ggaaacggta gctaataccg cataacgtcg caagaccaaa gagggggacc ttcgggcctc 180
ttgccatcag atgtgcccag atgggattag ctagtaggtg gggtaatggc tcacctaggc 240
gacgatccct agctggtctg agaggatgac cagccacact ggaactgaga cacggtccag 300
actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcca 360
tgccgcgtgt gtgaagaagg ccttcgggtt gtaaagcact ttcagcgagg aggaaggtgg 420
tgagcttaat acgttcatca attgacgtta ctcgcagaag aagcaccggc ccagcagccg 480
ccagcagccg cggtaatacg gagggtgcaa gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg 540
cacgcaggcg gtttgttaag tcagatgtga aatccccggg ctcaacctgg gaactgcatt 600
tgaaactggc aagctagagt ctcgtagagg ggggtagaat tccaggtgta gcggtgaaat 660
gcgtagagat ctggaggaat accggtggcg aaggcggccc cctggacgaa gactgacgct 720
caggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgctgtaaac 780
gatgtcgatt tggaggttgt gcccttgagg cgtggcttcc ggagctaacg cgttaaatcg 840
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tcagaatgct acggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg 1380
agtgggttgc aaaagaagta ggtagcttaa ccttcgggag ggcgctacca ctttgatctg 1440
ggc 1443

Claims (3)

1.一种粘质沙雷氏菌菌株(Serratia marcescens)LS-1，其特征在于：该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学，保藏日期2017年11月13日，保藏编号CCTCC NO：M2017686。
2.权利要求1所述的粘质沙雷氏菌菌株LS-1制备的粘质沙雷氏菌菌剂。
3.权利要求1所述的粘质沙雷氏菌菌株LS-1作为生物杀虫剂的应用，所述杀虫剂用于杀灭樟巢螟。
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