CN101463332B - 抗生链霉菌 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗生链霉菌，其发酵产物可抑制广谱真菌、原虫，大田实验能防治作物真菌病害和根结线虫。效果好，不产生公害、无残留。本菌制剂对人的危害性非常低，做医用和农用都具有良好的性能和开发前景。本发明命名为SIM001的抗生链霉菌是西安保藏变异种的亚种(Streptomycesantibioticus subspecies xi’an)，该菌种已在国家知识产权局专利局指定的保藏单位进行了专利保藏，保藏日期为2005年4月14日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1349。

Description

抗生链霉菌

一、技术领域：

本发明涉及一种菌种及其用途，尤其是涉及抗生链霉菌的诱变种及其用途。

二、背景技术：

目前，设施农业包括大棚蔬菜等经济作物常常由于温室内空气不流通和较高的温湿环境而易发生霉菌病害和根结线虫病。这些病害在温室、大棚得以孳生和蔓延，不仅成为大棚温室经济作物的头号杀手，而且还蔓延到露天田地的栽培作物。它们能独自形成危害，还可与其它病原物一起造成复合侵染，加重土壤传播性病害的发生，形成疫病。这些病害的发生一般造成作物减产，严重时还可能使作物绝产。

对于这些植物病害的防治，历来以化学药剂为主。化学农药的长期使用，又使得这些病害生物产生抗药性。为能达到抑病保产的目的，农民在使用化学农药时加大了农药剂量，造成了农药残留，不但使土壤板结，作物毒化，影响农产品出口，而且直接危害着人体健康。

微生物药剂是由微生物本身或它的次生代谢产物制成的。它具有：

1).易被分解，对环境污染小；

2).高效，针对性强，一般只对特定有害病菌和害虫的特定器官发生作用，对人、畜和益鸟无害；

3).由于易被分解，半衰期短，不易使目标物产生抗药性，产品生命周期相对较长；

4).使用微生物技术及生物工程技术还可开发新品种、增加新剂型、提高效价，形成规模化生产等。

使用微生物药剂防治植物病害，对非目标生物无害，可使土壤中原有的有益生物群体得以生息，恢复害虫天敌的杀虫效力，其后期效果更好。有益于保护自然界生物多样性和持续生态农业的发展，不仅具有显著的经济效益，而且还具有明显的社会效益。因此是一项社会公益性事业。

另外，具有抗真菌作用的抗生素药物也可以用于临床。现有的抗生素药剂使用时间长了以后也同样需要新的换代产品来替代或交叉使用，以减轻病害生物抗药性的产生。

三、发明内容：

本发明的目的在于提供一种抗生链霉菌，由其生产的菌剂具有抗广谱真菌的效果。能较好地防治农作物真菌病害和根结线虫的感染，不产生公害、无残留。本菌剂对人的危害性非常低，做医用药和微生物农药都具有良好的性能和开发前景。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种抗生链霉菌，其特征在于命名为SIM001的抗生链霉菌是西安保藏变异种的亚种(Streptomyces antibioticus subspecies xi’an)，该菌种已在国家知识产权局专利局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2005年4月14日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1349。

该菌的全细胞水解液含有L，L-DAP(二氨基庚二酸Diaminopimelic acid)，无特征性糖；细胞壁属于I型；糖型C；主要抑菌物质之一是多烯大环内酯类，为广谱型抗真菌类物质。该菌种16S rDNA序列图谱为：

1      TGCAAGTCGA ACGATGAACC GCTTTCGGGC GGGGATTAGT GGCGAACGGG TGAGTAACAC

61     GTGGGCAATC TGCCCTGCAC TCTGGGACAA GCCCTGGAAA CGGGGTCTAA TACCGGATAT

121    GACCGTCTGC CGCATGGTGG ATGGTGTAAA GCTCCGGCGG TGCAGGATGA GCCCGCGGCC

181    TATCAGCTTG TTGGTGAGGT AGTGGCTCAC CAAGGCGACG ACGGGTAGCC GGCCTGAGAG

241    GGCGACCGGC CACACTGGGA CTGAGACACG GCCCAGACTC CTACGGGAGG CAGCAGTGGG

301    GAATATTGCA CAATGGGCGA AAGCCTGATG CAGCGACGCC GCGTGAGGGA TGACGGCCTT

361    CGGGTTGTAA ACCTCTTTCA GCAGGGAAGA AGCGAAAGTG ACGGTACCTG CAGAAGAAGC

421    GGGGGCTAAC TACGTGCCAG CAGCCGCGGT AATACGTAGG GCGCAAGCGT TGTCCGGAAT

481    TATTGGGCGT AAAGAGCTCG TAGGCGGCTT GTCACGTCGG TTGTGAAAGC CCGGGGCTTA

541    ACCCCGGGTC TGCAGTCGAT ACGGGCAGGC TAGAGTTCGG TAGGGGAGAT CGGAATTCCT

601    GGTGTAGCGG TGAAATGCGC AGATATCAGG AGGAACACCG GTGGCGAAGG CGGATCTCTG

661    GGCGGATACT GACGCTGAGG AGCGAAAGCG TGGGGAGCGA ACAGGATTAG ATACCCTGGT

721    AGTCCACGCC GTAAACGGTG GGCACTAGGT GTGGGCAACA TTCCACGTTG TCCGTGCCGC

781    AGCTAACGCA TTAAGTGCCC CGCCTGGGGA GTACGGCCGC AAGGCTAAAA CTCAAAGGAA

841    TTGACGGGGG CCCGCACAAG CGGCGGAGCA TGTGGCTTAA TTCGACGCAA CGCGAAGAAC

901    CTTACCAAGG CTTGACATAC ACCGGAAACG TCTGGAGACA GGCGCCCCCT TGTGGTCGGT

961    GTACAGGTGG TGCATGGCTG TCGTCAGCTC GTGTCGTGAG ATGTTGGGTT AAGTCCCGCA

1021   ACGAGCGCAA CCCTTGTCCC GTGTTGCCAG CAGGGCCTTG TGGTGGTGGG GACTCACGGG

1081   AGACCGCCGG GGTCAACTCG GAGGAAGGTG GGGACGACGT CAAGTCATCA TGCCCCTTAT

1141   GTCTTGGGCT GCACACGTGC TACAATGGCC GGTACAATGA GCTGCGATAC CGTGAGGTGG

1201   AGCGAATCTC AAAAAGCCGG TCTCAGTTCG GATTGGGGTC TGCAACTCGA CCCCATGAAG

1261   TCGGAGTCGC TAGTAATCGC AGATCAGCAT TGCTGCGGTG AATACGTTCC CGGGCCTTGT

1321   ACACACCGCC CGTCACGTCA CGAAAGTCGG TAACACCCGA AGCCGGTGGC CCAACCCCTT

1381   GTGGGAGGGA GCTGTC

菌种培养及发酵条件为：

斜面培养基：该菌种斜面培养基为PDA培养基或普通放线菌用培养基。培养温度为26℃--45℃。

液体发酵：液体发酵用培养基经正交试验选择，确定摇床用发酵培养基的主要成分为：可溶性淀粉0.5--6％，葡萄糖0.5--6％，MgSO₄ 0.05％，Fe₂SO₄0.001％，K₂HPO₄ 0.05％，酵母膏0.5％，豆饼粉0.2％-4％，鱼粉0.2％--4％；水100ml；PH控制在4-10。将培养基灭菌后，接入菌种，置摇床，26℃--45℃培养。

固体培养；固体培养基可用各种农副产品及其下脚料作培养基的主要成分。包括稻、谷、玉米、麦类、高梁、豆类的面粉及其加工下脚料等；麸皮、玉米蛋白粉、玉米面、稻壳、豆皮等；各种榨油后的餅粕，如豆饼、花生餅等；各种含蛋白质和碳水化合物的动物材料，如鱼粉、蚕蛹粉、蛋白粉等都可以作为菌种培养基的组合物。按照蛋白质∶碳水化合物＝1-7∶9-3的比例配制培养基物料，添加基料量50％-300％的水混合，拌匀即可。要注意的是基料中要添加合适比例的皮、壳类物质，以利基料中空气的存在和流通，一般为1-10％左右。将培养基灭菌后，接入菌种，置26℃--45℃培养。

该菌种经液体发酵72h-170h，由发酵原液制成的生物防霉剂水剂对包括稻瘟病蚀脉孢霉Fusarium vasinfetum Atkin son、稻梨孢霉Piricularia oryzaeCavara和立枯丝核菌Rhizoctonia solani Kiihn在内的多种真菌有抑制作用；对苹果褐斑病、番茄叶霉病、日光温室黄瓜黄霉病、灰霉病等多种植物真菌病有防治作用；使用带有培养代谢成分的菌剂还有促植物生长作用。

该菌由液体、固体发酵制成的菌剂及其提取物可用于防治大棚温室根结线虫病害。

该菌剂及其生长代谢提取物可制成医用、农用用途的抗生制剂、促生长制剂。

与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：

1)、本发明使用了菌种诱变技术。

2)、本发明产生的生物防霉剂水剂的初期样品(即发酵液)显示出该菌剂是一个能抑制多种真菌和根结线虫的菌剂。其抑制线虫的能力可能来自于其对线虫帮凶真菌的抑制，但不排除它对线虫的直接作用。实验中发酵原液即有较高活性，经适当地处理、提取或浓缩、加入助剂后，其功能会更好。

四、附图说明：

图1和图2为原菌种SIM-fs孢子形态电镜扫描图(6000x、20000x)；

图3和图4为SIM001诱变菌种孢子形态电镜扫描图(3500x、30000x)。

五、具体实施方式：

(一).菌种

抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus)实验编号为SIM-fs。于距离在130cm，吸收剂量为600Gy(xMrad)，的⁶⁰Co-r射线照射下诱变，经筛选获得抗真菌活力提高较大的菌种，经五代转接培养，性能稳定。实验编号为：SIM001

SIM001菌种描述特征如下：

测定方法：

形态特征：参照《放线菌的分类和鉴定》一书中有关内容进行实验。于高氏合成一号琼脂、ISP4琼脂、甘油天门冬素琼脂、GYM琼脂和JCM42^#培养基琼脂上，28℃插片培养14天后，取片，用常规方法观察菌体的形态特征。

培养特征：在高氏合成一号琼脂、ISP4琼脂、甘油天门冬素琼脂、GYM琼脂和JCM42^#培养基琼脂上，28℃培养7-14天后观察菌体的颜色及可溶色素。

细胞壁化学组分分析：按Hasegawa照薄板层析法(Thin LayerChromatography，TLC)对菌株进行全细胞水解液的氨基酸和糖型分析。

生理生化：参照《放线菌的分类和鉴定》和《Bergey’s Manual of SystematicBacteriology》Vol.4有关内容进行生理生化鉴定。

16S rDNA序列分析：采用溶菌酶法改进的Pitcher法(Pitcher et al.1989)从新鲜菌体提取基因DNA，用通用引物进行16S rDNA扩增，PCR产物经纯化后直接用Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing KIt测序，电泳及数据收集用Applied Biosystems DNA sequencer(model 377)自动进行，将所测得16S rDNA序列与GenBank数据库中相关种属的序列进行比较(北微所测)。

电镜扫描：在PDA培养基上，28℃培养3-7天，用水制成孢子悬液，1％磷钨酸复染后，用HITACHI H-600电镜观察。

测定结果：

形态特征：

革兰氏染色阳性；ISP4琼脂和GYM等琼脂上生长14天后，基内菌丝发育良好，无横隔，不断裂；气生菌丝生长良好，丛生，多分支，孢子丝直或柔曲。

培养特征：

培养基	气生菌丝	基内菌丝	可溶色素
				高氏合成一号琼脂ISP4琼脂甘油天门冬素琼脂GYM琼脂JCM42#培养基琼脂	灰黄灰黄浅褐灰黄灰黄色	褐黄黄褐浅褐褐黄橙黄	无无无无无

细胞型化学组分分析：

菌株的全细胞水解液含有L，L-DAP(L，L-二氨基庚二酸Diaminopimelicacid)，无特征性糖；细胞壁属于I型；糖型C。

生理生化特征：

特征

结果

特征

结果

淀粉水解木聚糖45℃生长NaN3(0.01％)酚(0.1％)Nacl  3％5％7％吐温20406080乙酸盐丁二酸盐

++--+++++++++-

D-葡萄糖D-果糖蔗糖L-鼠李糖D-甘露醇肌醇L-阿拉伯糖棉籽糖半乳糖山梨糖菊糖柠檬酸盐丙二酸盐丙酸盐

+++-+-+++--+++

16S rDNA序列分析：

诱变菌株SIM001 16S rDNA序列图谱：

1     TGCAAGTCGA ACGATGAACC GCTTTCGGGC GGGGATTAGT GGCGAACGGG TGAGTAACAC

61    GTGGGCAATC TGCCCTGCAC TCTGGGACAA GCCCTGGAAA CGGGGTCTAA TACCGGATAT

121   GACCGTCTGC CGCATGGTGG ATGGTGTAAA GCTCCGGCGG TGCAGGATGA GCCCCGCGCC

181   TATCAGCTTG TTGGTGAGGT AGTGGCTCAC CAAGGCGACG ACGGGTAGCC GGCCTGAGAG

241   GGCGACCGGC CACACTGGGA CTGAGACACG GCCCAGACTC CTACGGGAGG CAGCAGTGGG

301   GAATATTGCA CAATGGGCGA AAGCCTGATG CAGCGACGCC GCGTGAGGGA TGACGGCCTT

361   CGGGTTGTAA ACCTCTTTCA GCAGGGAAGA AGCGAAAGTG ACGGTACCTG CAGAAGAAGC

421   GCCGGCTAAC TACGTGCCAG CAGCCGCGGT AATACGTAGG GCGCAAGCGT TGTCCGGAAT

481   TATTGGGCGT AAAGAGCTCG TAGGCGGCTT GTCACGTCGG TTGTGAAAGC CCGGGGCTTA

541   ACCCCGGGTC TGCAGTCGAT ACGGGCAGGC TAGAGTTCGG TAGGGGAGAT CGGAATTCCT

601   GGTGTAGCGG TGAAATGCGC AGATATCAGC AGGAACACCG GTGGCGAAGG CGGATCTCTG

661   GGCCGATACT GACGCTGAGG AGCGAAAGCG TGGGGAGCGA ACAGGATTAG ATACCCTGGT

721   AGTCCACGCC GTAAACGGTG GGCACTAGGT GTGGGCAACA TTCCACGTTG TCCGTGCCGC

781   AGCTAACGCA TTAAGTGCCC CGCCTGGGGA GTACGGCCGC AAGGCTAAAA CTCAAAGGAA

841   TTGACGGGGG CCCGCACAAG CGGCGGAGCA TGTGGCTTAA TTCGACGCAA CGCGAAGAAC

901   CTTACCAAGG CTTGACATAC ACCGGAAACG TCTGGAGACA GGCGCCCCCT TGTGGTCGGT

961   GTACAGGTGG TGCATGGCTG TCGTCAGCTC GTGTCGTGAG ATGTTGGGTT AAGTCCCGCA

1021  ACGAGCGCAA CCCTTGTCCC GTGTTGCCAG CAGGGTCTTG TGGTGCTGGG GACTCACGGG

1081  AGACCGCCGG GGTCAACTCG GAGGAAGGTG GGGACGACGT CAAGTCATCA TGCCCCTTAT

1141  GTCTTGGGCT GCACACGTGC TACAATGGCC GGTACAATGA GCTGCGATAC CGTGAGGTGG

1201  AGCGAATCTC AAAAAGCCGG TCTCAGTTCG GATTGGGGTC TGCAACTCGA CCCCATGAAG

1261  TCGGAGTCGC TAGTAATCGC AGATCAGCAT TGGTGCGGTG AATACGTTCC CGGGCCTTGT

1321  ACACACCGCC CGTCACGTCA CGAAAGTCGG TAACACCCGA AGCCGGTGGC CCAACCCCTT

1381  GTGGGAGGGA GCTGTC

诱变菌种SIM00l 16S rDNA序列分析与Genbank中相关序列Blast比较的结果表明菌株属于链霉菌属；与目前发表的相关菌株相比，本菌株的16S rDNA序列与Streptomyces griseus的序列相似性很高，达到99.9％的相似性。

原始菌株SIM-fs 16S rDNA序列图谱：

1    ggtcggcgtg cttacacatg caagtcgaac gatgaaccgg tttcggccgg ggtattagtg

61   gcgaacgggt gagtaacacg tgggcaatct gccctgcact ctgggataag cccgggaaac

121  tgggtctaat accggatacg acactccgag gcatcttggg gtgtggaaag ttccggcggt

181  gcaggatgag cccgcggcct atcagcttgt tggtggggta atggcctacc aaggcgacga

241  cgggtagccg gcctgagagg gtgaccggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc

301  tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac aatgggcgaa agcctgatgc agcgacgccg

361  cgtgagggat gacggccttc gggttgtaaa cctctttcag cagggaagaa gcgaaagtga

421  cggtacctgc agaagaagca ccggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg

481  tgcgagcgtt gtccggaatt attgggcgta aagagctcgt aggcggtttg tcgcgtcgat

541  tgtgaaagcc cggggcttaa ccctgggtct gcagtcgata cgggcaggct agagttcggc

601  aggggagact ggaattcctg gtgtagcggt gaaatgcgca gatatcagga ggaacaccgg

661  tggcgaaggc gggtctctgg gccgatactg acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa

721  caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacggtgg gcactaggtg tgggcaacat

781  tccacgttgt ccgtgccgca gctaacgcat taagtgcccc gcctggggag tacggccgca

841  aggctaaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggcggagcat gtggcttaat

901  tcgacgcaac gcgaagaacc ttaccaaggc ttgacataca tcggaaacgg ccagagatgg

961  tcgccccctt gtggtcggtg tacaggtggt gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga

1021 tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgtcctg tgttgccagc aacctcttcg

1081 gagggttggg gactcacggg agactgccgg ggtcaactcg gaggaaggtg gggacgacgt

1141 caagtcatca tgccccttat gtcttgggct gcacacgtgc tacaatggcc ggtacaatga

1201 gctgcgatgc cgtgaggtgg agcgaatctc aaaaagccgg tctcagttcg gattggggtc

1261 tgcaactcga ccccatgaag tcggagtcgc tagtaatcgc agatcagcat tgctgcggtg

1321 aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacgtca tgaaagtcgg taacacccga

1381 agccggtggc ctaacccctt gtgggaggga g

结果显示：原菌株SIM-fs 16S rDNA序列分析表明该菌株属于链霉菌属。与非正式发表的链霉菌Streptomyces sp.050642(海南热带作物生物技术国家重点实验室提交GenBank号AY660018)的16S rDNA序列相似性达99.6％，而与目前正式发表的链霉菌的16S rDNA序列相似性均低于97％。与诱变后的变异株、灰色链霉菌Streptomyces griseus和抗生链霉菌Streptomyces antibioticus的16S rDNA序列相似性分别为96.07％、96。05％和94.82％。

原始菌株SIM-fs的16S rDNA序列分析测定中显示它与抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus)相似性只有94.82％，低于95％。说明它在保藏过程中已经发生变异。经⁶⁰Co-r射线照射诱变后产生的诱变菌种SIM001的16SrDNA序列变得非常接近灰色链霉菌(Streptomyces griseus)。符合度达99.9％。

菌种比较：

16S rDNA在生物体内很稳定，常用于种的鉴定和比较。在诱变中能使其改变如此之大，说明其变异幅度的大小和易变异的程度。尽管它的16S rDNA序列接近灰色链霉菌，但是我们认为它仍然有可能存在与灰色链霉菌Streptomycesgriseus不完全相同的地方。

根据文献《链霉菌鉴定手册》(中国科学院微生物研究所放线菌分类组编著，1975)中记载灰色链霉菌Streptomyces griseus分类归属于链霉菌第三类，即球孢Globisporus类群.该类群的主要特征之一是“孢子通常球形、椭圆型、有时柱形，孢子表面都是光滑的”。而抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus)的分类归属于十二类群，金色Aureus类群，该类群特征之一是孢子表面多种多样。为此，我们对原菌种SIM-fs孢子和诱变菌种SIM001的孢子进行了电镜扫描观察。

电镜扫描结果：

原菌种SIM-fs孢子形态电镜扫描图(6000x、20000x)：(见图1和图2)

SIM001诱变菌种孢子形态电镜扫描图(3500x、30000x)：(见图3和图4)

图片显示该菌种孢子表面有刺突，不同于灰色链霉菌(S.griseus)，应属抗生链霉菌(S.antibioticus)。同时，图片还显示诱变菌株SIM001孢子表面的刺突较之原始菌种SIM-fs孢子表面的刺突稠密一些，但孢子却没有原始菌株的孢子圆。

此外，与原始菌种比较，固体培养时的黑色素的产生有所改变。SIM001菌种在PDA营养琼脂斜面固体培养时较SIM-fs菌种PDA营养琼脂斜面固体培养时的表面颜色深，呈绿灰色；菌落背面几乎无可溶性黑色素产生，而SIM-fs菌种有比较明显的黑色素产生，所以我们将它命名为抗生链霉菌西安保藏变种的亚种(Streptomyces antibioticus subspecies xi’an)。该菌种在“中国普通微生物菌种保藏管理中心”(CGMCC)进行了鉴定，保藏编号是AS4.2006。我们又将该菌种进行了专利保藏。专利保藏号：CGMCC No.1349。

(二).菌种特性和作用

该菌种产生多种抗生素，其菌体提取物和发酵原液纸层析均显示能抑制多种真菌(由大棚植物病害株分离获得的致病菌为目标菌的测试模式中)的活性成分主要有两种，一种在层析中偏非极性端，另一种在层析中偏极性端，均对细菌无抑制作用。由发酵液经乙醇沉淀去蛋白浓缩后，用硅胶吸附，溶剂梯度洗脱，再经柱层析分离获得含活性成分的提取物。其中在层析中偏极性端的活性物质呈两性性质，其官能团反应如下：

反应名称	反应特征	可能的官能团
			a-萘酚反应	两夜面间出现紫环(+)	糖类
高锰酸钾试验	退色(+)	不饱和键
			茚三酮反应	不变色(-)	氨基酸或肽
三氯化铁反应	无变化(-)	酚类

肽键测定	无反应(-)	肽键
			2，4二硝基苯肼	黄至红色(+)	羰基

所以据此推断，该物质含不饱和键，可能含有糖苷类，无氨基酸或肽键，无酚类活性，含有羰基。红外吸收检测中显示在1727nm处有吸收峰，表示其为一酯类化合物。在紫外吸收检测中该物质显示在365、381、406处有吸收峰，在有吐温80存在时其活性明显减弱，这些均为多烯大环内酯类抗生素的表现特征。由此我们断定该物质是多烯大环内酯类物质，可能是七烯大环内酯类。其PK值约在3-4。该活性成分物质混合在发酵液中时，100℃时15min不失活，但对光敏感。据有关资料记载，七烯大环内酯类抗生素不易被人肠道吸收。所以，作为内服药效果不好，可以作外用药，开发为农药则对人畜安全。

(三).菌种培养及发酵条件

斜面培养基：该菌种斜面培养基为PDA或普通放线菌用培养基：

液体发酵培养：经正交试验选择摇床用发酵培养基为：可溶性淀粉0.5-6％，葡萄糖0.5-6％，MgSO₄ 0.05％，Fe₂SO₄ 0.001％，K₂HPO₄ 0.05％，酵母膏0.5％，豆饼粉0.2％-4％，鱼粉0.2％--4％；水100ml；PH控制在4-10。将培养基灭菌后，接入菌种，置摇床，26℃-45℃培养。

固体培养：固体培养基可以使用农副产品及其下脚料作基本原材料。植物类如稻、谷、玉米、麦类、高梁、豆类麸皮、玉米蛋白粉、玉米面、稻壳、豆皮等；各种榨取食用油后的餅粕，如豆饼、花生餅等；动物类材料可以是各种含蛋白质和碳水化合物的材料，如鱼粉、蚕蛹粉、蛋白粉等，都可以作为菌种培养基的组合物。按照蛋白质∶碳水化合物＝1-7∶9-3的比例配制培养基物料，添加培养基物料量的50％-300％的水混合，拌匀即可。要注意的是基料中要添加合适比例的皮、壳类物质，以利于基料中空气的存在和流通，一般为1％-10％左右。将培养基灭菌后，接入菌种，置26℃-45℃培养。

(四).抑菌试验

4.1.实验室抑菌谱测试试验

4.1.1、试验目的

明确SIM 001菌产生的代谢物抑菌范围，为安全合理使用及推广提供理论和技术依据。

4.1.2、材料与方法

4.1.2.1.材料

抑菌剂：SIM 001菌发酵原液离心得发酵液和菌泥，菌泥用丙酮提取，提取液浓缩去丙酮后与发酵液合并，用于抑菌能力的测定。

供试菌：其中稻瘟病蚀脉孢霉Fusarium vasinfetum Atkin son、稻梨孢霉Piricularia oryzae Cavara和立枯丝核菌Rhizoctonia solani Kiihn购自北京微生物研究所，其余菌种均分离自阳光温室染病经济作物的根、茎、叶明确病灶处。

4.1.2.2.方法

抑菌测试采用平皿滤纸圆片改良法。在无菌条件下，将供试菌均匀涂布在含有1％蛋白胨的PDA固体营养琼脂表面，静置2hr，使其充分附着。将Ф为1cm的滤纸圆片浸入发酵液中2min，用无菌镊子夹出，于杯壁上尽量刮去多余的液体，然后置于涂布有供试菌的平皿表面，压实，不要留有气泡，以免测试不准。

将抑菌测试平皿倒置于26-45℃培养箱中保温培养，培养24hr-72hr，观察滤纸圆片周围形成的抑菌圈，测量抑菌圈的大小，记录并比较之。

4.1.3、结果

表1，SIM 001菌发酵液抑菌范围测试

供试菌	抑菌圈直径(mm)	备注
			刀孢霉菌CLasteroporium Schw	43	原菌液
镰刀霉菌Fasarium LK exir	22	原菌液
			串珠霉菌Moiliu Persrer Fr	53	原菌液
灰葡萄孢霉菌B.cinerea Perg ex Fr	21	原菌液
			茄菌核病菌Rhizoctonia Solani Kuehu	39	原菌液
苹果落叶病的交链孢霉菌Altemaria Nees ex Wallr	47	原菌液
			粉红聚端孢霉菌Troseum Lk	36	原菌液
稻瘟病蚀脉孢霉Fusarium vasinfetum Atkin son	39	提取液
			稻梨孢霉Piricularia oryzae Cavara	47	提取液
立枯丝核菌Rhizoctonia solani Kiihn，	44	提取液
			红酵母菌Rhodotorula rubra(Demme)Lodder	32	原菌液
枯草杆菌Bacillus subtilis	-	原菌液
			金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus	-	原菌液

4.1.4、讨论

该菌剂的抑制真菌谱较广，但是对细菌无效。实验室条件下能程度不同地抑制多种大棚蔬菜病害真菌，所以该菌剂应为抗真菌的广谱抑菌剂。若能适当地浓缩，提高浓度或提取纯的有效物质来使用则效果会更好。

4.2、大田实验

4.2.1.例1、SIM 001菌发酵液作为生物防霉剂水剂防治苹果褐斑病药效试验

4.2.1.1.试验目的

有一些抑菌物质在实验室的检测中，表现非常好，但是一到田间，与植物结合后，却变得无效或效果不明显。而有一些抑菌物质在实验室的检测中，表现平平，但是一到田间，与植物结合后，却变得非常有效或效果非常明显。这是多因素影响的结果。为明确SIM 001菌发酵液田间抑菌能力，用其对苹果褐斑病进行防治效果实验，以检测其与植物结合后的抗菌效果，为它安全合理使用及推广提供技术、理论依据。

4.2.1.2.供试作物

苹果，品种为红富士。

4.2.1.3.防治对象

苹果褐斑病[Marssonina mali(P.Henn)Ito]；

4.2.1.4.供试农药

(1)、SIM 001菌产生的生物防霉剂水剂：SIM001菌液体培养72h--144h，离心除去菌体，菌体用丙酮提取，提取液浓缩去丙酮后与发酵液合并用于生防测定。

(2)50％扑海因可湿性粉剂(安万特作物科学公司，市购)；

(3)1％多氧清水剂(安徽绩溪化工总厂，市购)。

4.2.1.5.试验地概况

本试验地安排在陕西省杨凌区大寨乡东卡村3队陈民生家3亩苹果园，该园为9年生矮砧红富士与短枝新红星的混生园，株行距2×3m，本田块土壤类型为塿土，肥力状况好。本试验开始前10日未喷过其他杀菌剂，本试验开始时，田间零星可见苹果褐斑病病叶。

4.2.1.6.试验处理与实施实验

试验设SIM 001菌产生的生物防霉剂水剂200倍和400倍；对照药剂50％扑海因可湿性粉剂1000倍，1％多氧清水剂300倍和400倍；另设清水对照，共计六个处理，每处理设4个重复小区，每小区4株树，各小区随机排列。

2003年7月19日喷药，无风，施药器械为工农—16型背负式手动喷雾器，工作压力为0.3-0.4Mpa，喷孔直径1.3mm，药液喷洒量为2kg/株，施药三次，每次间隔7-10天。

4.2.1.7.调查方法与结果计算

每小区均选中间2株进行调查，每株按东、西、南、北、中五个方位各固定—个当年生枝条，调查其上的全部叶片，记录总叶数，病叶数和病斑数，每次施药前后及最后一次药后7天各调查一次，计算病情指数，病情增长率和防治效果。

1).分级标准

0级：无病斑；

1级：病斑面积占整个面积的10％以下；

3级：病斑面积占整个面积的11％-25％；

5级：病斑面积占整个面积的26-40％以下；

7级：病斑面积占整个面积的41％-65％以下；

9级：病斑面积占整个面积的65％以下。

2).防治效果计算公式

4.2.1.8.结果与分析

1).试验结果如附表1所示。可以看出，SIM 001菌产生的生物防霉剂水剂对苹果褐斑病具有较好的预防和治疗效果。第一次药后7天，由于田间病情较轻，其防效相对高，各处理均达到100％。随着时间延续和病情的发展，各处理防效开始出现一定程度的差异，第二次用药后7天，供试药剂SIM 001菌产生的生物防霉剂水剂200倍和400倍的防效分别为84.89％和75.97％。连续喷三次药后，各处理的防效较前有一定程度的提高，其200倍和400倍的防效分别为85.89％和77.05％。对照药剂1％多氧清水剂300倍和400倍对苹果褐斑病亦有较好的防治效果，且在同等剂量用量下，其效果与SIM 001菌产生的生物防霉剂水剂相当。

2).经过对第二次药后7天的防治效果进行统计分析(附表2，A)，结果表明，各处理间的差异达极显著水平。进一步地进行差异显著性比较，除SIM 001菌产生的生物防霉剂水剂400倍和1％多氧清水剂400倍以及1％多氧清水剂300倍和扑海因WP1000倍无显著差异外，其它处理间均有显著或极显著的差异。

3).田间观察表明，供试药剂在试验计量下对苹果是安全的。药剂使用后，果树叶片油绿肥厚，似有增肥效果。

4.2.1.9.结论

本试验结果表明，SIM 001菌产生的生物防霉剂水剂为防治苹果褐斑病的一种有效药剂。建议进行大面积示范推广，推荐剂量为轻度发生时，使用400倍液；中等程度发生时，可适当提高使用剂量。建议在病害初发生时开始使用，一般应连喷三次，每次间隔7-10天。

附表2生物防霉剂水剂防治苹果斑病效果调查表

附表3各小区防效及反正弦转换值

附表4变量分析表

附表2  生物防霉剂水防治苹果褐斑病效果

处理	防前病指	第一次药后7天		第二次药后7天		第三次药后7天
								病指	防效(％)	病指	防效(％)	病指	防效(％)
		生物防霉剂水剂200倍	0.00	0.00	100	0.89	84.28							1.34	85.89
生物防霉剂水剂400倍	0.00							0.00	100	1.36	75.97	2.18	77.05
		1％多氧清水剂300倍	0.00	0.00	100	1.22	78.45							1.63	82.84
1％多氧清水剂400倍	0.00							0.00	100	1.31	76.86	2.06	78.32
		50％扑海因可湿性粉剂1000倍	0.00	0.00	100	1.21	78.62							1.75	81.58
清水对照	0.00							0.09	-	5.66	-	9.50	-

附表3各小区防效及反正弦转换值(第三次药后7天)

处理	防治效果(％)				反正弦转换值
										1	2	3	4	1	2	3	4	∑
	生物防霉剂水剂200倍	86.67	85.83	85.78	85.25	68.61	67.86	67.86	67.45										271.78
生物防霉剂水剂400倍										78.40	77.14	75.96	76.97	62.31	61.41	60.67	61.34	245.73
	1％多氧清水剂300倍	83.46	83.33	80.36	82.97	66.03	65.88	63.72	65.65										261.28
1％多氧清水剂400倍										79.77	76.67	78.89	77.74	63.29	61.14	62.65	61.82	248.9
	50％扑海因可湿性粉剂1000倍	82.88	78.93	80.59	82.78	65.57	62.65	63.87	65.50										257.59
合计										-	-	-	-	325.81	318.94	318.77	321.76	1285.28

附表4变量分析表

变异来源	自由度	平方和	均方	F值	FO.05	FO.01
							处理间	4	107.43	26.86	41.97	3.26	541
重复间	3	6.51	2.17	3.39	3.49
							误差	12	7.62	0.64
总变异	19	121.56

4.2.3.例2、SIM 001菌产生的生物防霉剂水剂防治番茄叶霉病效果试验

番茄叶霉病[Clodosporium fulvum Cooke]是番茄栽培中的常发性病害之一，通常可造成减产10％-15％，严重时可达50％以上，经济损失巨大。目前生产上一般以化学药剂防治为主控制危害。SIM 001防霉剂是一种新型微生物制剂，具有无毒无公害绿色制剂特点。为了明确其杀茵防病效果，开展了该制剂防治番茄叶霉病的田间药效试验。现将结果简报如下：

4.2.2.1.材料与方法

试验在陕西省科学院渭南科技示范基地蔬菜地进行。供试药剂为SIM 001菌液体培养96h--120h，离心除去菌体产生的发酵原液作为生物防霉剂水剂；对照药剂为75％百菌清可湿性粉剂(青岛东大药业有限公司生产)；供试番茄品种为L402番茄，2002年2月14-15日定植。

试验设SIM 001菌产生的生物防霉剂水剂100、200、300倍液，75％百菌清600倍液及清水对照(CK)5个处理，重复3次，随机排列，小区面积16m²共15个小区。于番茄叶霉病发生初期开始第一次用药，以后每隔7天1次，共喷3次。采用工农16型背负式喷雾器常规喷雾，以叶背叶面均匀周到，不滴药液为宜，小区用药液量均为75kg.667m^-2。

防效调查：每小区对角线5点取样，每点2株共10林。分别于每次施药前和第3次施药后7天调查每株上中下3个叶片，根据分级标准分别记录叶片发病情况，计算病情指数和防治效果。同时，每次施药后连续观察番茄植株的叶片、果实、花器等是否产生药害。

分级标准：

0级，叶片无病斑；

1级，叶片上有1-2个病斑；

2级，叶片上有3-7个病斑；

3级，叶片上有8-10个病斑，病斑交接明显；

4级，叶片上有10个以上病斑，且病斑相连，叶片萎焉。

计算公式：

4.2.2.2.结果与分析

田间试验结果表明，SIM 001菌产生的生物防霉剂水剂对番茄叶霉病具有较好的防治作用(表5)。

第2次药后7天调查，防霉剂100、200倍液防效为75.2％和74.9％。

表5 SIM 001防霉剂防治番茄叶霉病效果

药剂与处理

防前病指

第1次药后7天

第2次药后7天

第3次药后7天

病指

防效(％)

病指

防效(％)

病指

防效(％)

防霉剂100倍液防霉剂200倍液防霉剂300倍液百菌清600倍液清水对照(CK)

14.713.815.114.413.9

18.819.020.918.022.8

42.6b41.5b34.3c60.7a-

19.619.022.920.733.9

75.2a74.9a60.4c68.4b-

23.323.330.425.554.8

78.9a76.8a62.6c72.8b-

^*表中病指为3次重复平均值，显著性测验采用″DMRT″法，字母相同者为5％水平差异不显著

第3次药后7天防效分别78.9％和76.8％，效果均优于对照药剂756％百茵清600倍液。且SIM 001菌产生的生物防霉剂水剂100、200倍液防效差异不显著。但SIM 001防霉剂防治番茄叶霉病的速效性较差，第1次用药后7天防效仅为40％左右，低于对照药剂75％百茵清(防效60.7％)，这说明SIM001菌产生的生物防霉剂水剂药效作用较慢，需连续使用2次以上。

同时，试验表明喷施防霉剂后对番茄植株安全，叶片、果实、花器均无药害出现出现，证明防霉剂在番茄上使用十分安全。

4.2.2.3.结论

化学农药对蔬菜的使用污染已严重威胁着人们的生活质量和我国加入WTo后蔬菜的市场竞争力，寻求防治病虫效果良好又无毒无公害的防治新制剂使绿色食品蔬菜生产的关键所在。本试验结果初步表明，SIM 001防霉剂对番茄叶霉病具有较好的防治效果，连续使用2次以上，防效可达70％以上，且对作物十分安全，无明显药害发生。

4.2.3.例3、SIM 001菌产生的微生物农药一一防霉剂防治日光温室黄瓜黄霉病、灰霉病的效果试验

黄瓜霜霉病[Pseudoperonospora cubensis]和灰霉病[Botrytiscinerea]是保护地黄瓜栽培中两大主要病害，通常造成减产20％～50％，严重时可导致绝产。因棚室温湿条件极利于发病，目前生产上一般以化学药剂防治为主。但由于化学农药防治不仅造成环境污染，而且引起病害抗药性增长，因此，筛选开发新的高效低毒防治药剂，减轻病原菌的抗药性的产生，是目前蔬菜病害防治研究的主攻目标之一。微生物农药一SIM 001菌产生的生物防霉剂是应用微生物发酵技术研制开发的一种新型微生物农药，具有无毒无公害绿色制剂特点。为了明确防霉剂对黄瓜霜霉病、灰霉病的防治效果，评价了制剂的保产性及安全性，以期为制剂配方的完善和生产应用提供科学依据。我们于2003年3-7月开展了本项试验，现将结果总结如下：

4.2.3.1.材料与方法

4.2.3.1.1处理设计

防治黄瓜霜霉病设SIM 001菌产生的水剂微生物农药一防霉剂(菌剂发酵原液)100、200、00倍液；72％克露WP(美国杜邦公司)；600倍液及空白对照(清水)共5个处理。防治黄瓜灰霉病设SIM 001菌产生的水剂100、200、300倍液；50％速克灵(日本住友公司)600倍液及空白对照共5个处理。

4.2.3.1.2试验方法

4.2.3.1.2.1室内试验

室内试验在陕西省科学院渭南科技示范基地综合实验室进行，分别于田间黄瓜霜霉病发生初期、黄瓜灰霉病发生高峰期采集新鲜病叶(霜霉病)或花器萎焉的幼瓜(灰霉病)。霜霉病每处理5个病叶，按处理在已配制好的药液中浸渍，置于直径40cm高20cm的塑料盆中，并用蘸水棉球保湿，上盖塑料薄膜；分别于试验前及用药后3.5天按分级标准逐叶记载病情发生情况，计算分析各处理防治效果；灰霉病每处理10个幼瓜，用病瓜逐一进行常规接菌后静置12小时，再按处理在已配制好的药液中浸渍瓜条，同样置于直径40cm高20cm的塑料盆中，并用蘸水棉球保湿，上盖塑料薄膜，药后3-5天统计各处理的病瓜率，计算分析各处理防治效果。

4.2.3.1.2.2大田试验

试验在陕西省科学院渭南科技示范基地温室黄瓜棚进行。黄瓜品种为津春3号，2002年9月28日播种育苗，11月5～7日定植大田。试验设两组，1组为黄瓜霜霉病防治试验，小区面积16m²共15个处理小区，各处理3次重复。于黄瓜发病初期开始第一次喷药，以后每隔5d喷一次，共喷3次。采用工农-16型背负式喷雾器常规喷雾，以叶背叶面均匀周到，不滴药液为宜，小区喷药液量均为1125kg.hm^-2。

另1组为黄瓜灰霉病防治试验，试验方法同第1组。

4.2.3.1.3效果调查

分别于每次喷药前和第3次喷药后5d调查病情发展程度，调查时，灰霉病每小区随机调查20个瓜条，统计病瓜率并计算分析防治效果：霜霉病每小区随机取10株，每株自下而上调查全部叶片数，采用5级分级标准(以叶片为单位)记载，计算各处理病情指数和防治效果。每次采瓜时按小区单收称重，折合成hm²产量，比较各处理保产效果。试验期间注意观察记载黄瓜生长发育、黄瓜长势及是否有药害现象等。

4.2.3.1.4病害分级标准及统计公式

霜霉病分级标准：

0级：叶片无发病；

I级：病斑占叶面积1/5以下；

II级：病斑占叶面积1/5～1/3以下；

III级：病斑占叶面积1/3～1/2以下；

IV级：病斑占叶面积1/2以上。

统计计算方法：

4.2.3.2.结果分析

4.2.3.2.1.对黄瓜霜霉病防治效果

室内测定结果表明，与清水对照相比，试验各处理对黄瓜霜霉病均有一定的防治效果，并以防霉剂100、200倍液及72％克露600倍液效果较好达75％以上，可有效控制病害蔓延发展，且防效差异不显著。

田间试验结果见表6，由表6可以看出，在黄瓜生长期，随着SIM 001菌产生的微生物农药一防霉剂使用浓度的增大，对黄瓜霜霉病防治效果也随之提高，喷施300、200、100倍液防效依次为62.7％、79.1％和78.3％，与室内试验结果一致。而防霉剂100、200倍液防效差异不显著，且与化学药剂72％克露WP600倍液防效(78.3％)相当。同时，试验发现使用防霉剂3个浓度处理区黄瓜植株发育正常，叶色浓绿，叶片平整，瓜条商品性好，无药害现象发生，证明使用防霉剂对作物安全无害。

表6.不同处理对黄瓜霜霉病防效比较与保产效果

药剂与处理	防前病情指数	防后病情指数	防治效果％	折合产量(kg/hm2)	保产率(％)
						防霉剂100倍液防霉剂200倍液防霉剂300倍液72％克露WP600倍	11.712.512.111.8	17.118.221.817.4	79.1a78.3a62.7b78.3a	63020628505792062890	23.7a23.3a13.7b23.4a

清水对照(CK)

12.2

38.2

50960

※数据为三次重复平均值，显著性测验采用“DMRT”法，表中相同字母表示5％水平无显著差异。不同。

产量测定结果证明：SIM 001菌产生的微生物农药一防霉剂100、200倍液喷雾保产效果较好，分别为23.7％和23.3％，与杀菌剂72％杜邦克露600倍液(23.4％)基本相当，多重比较结果，产量差异不显著。而SIM 001防霉剂300倍液保产效果差异明显。

综上分析，可以得出SIM 001菌产生的微生物农药——防霉剂200倍液田间喷雾对黄瓜霜霉病有良好的防治效果。

4.2.3.2.2.对黄瓜灰霉病防治效果(表7)

试验结果表明，无论是室内还是田间测定，SIM 001菌产生的微生物农药——防霉剂各处理浓度对黄瓜灰霉病均有一定的防治效果，室内测定防效仅为23.6％-43.3％，大田试验结果防治效果在16.7％-37.2％之间，但明显低于对照化学药剂50％速克灵600倍液(防治效果73.1％-88.2％)。说明SIM 001菌产生的微生物农药一防霉剂若要将其作为黄瓜灰霉病防治药剂，还需在配方上进一步改进或完善，以提高其防治应用效果。

表7.不同处理对黄瓜灰霉病防治效果比较

室内实验

大田实验

药剂与处理

药前病瓜率(％)

药后5d病瓜率(％)

防治效果(％)

药前病瓜率(％)

药后15d病瓜率(％)

防治效果(％)

防霉剂100倍浓防霉剂200倍液防霉剂300倍液50％速克灵600倍清水对照(CK)

00000

33.333.343.36.756.7

41.3b41.3b23.6c88.2a-

8.310.08.311.78.3

10.716.516.614.418.3

37.2b35.5b16.7c73.1a-

4.2.3.3.结论与建议

4.2.3.3.1.室内及田间小区试验结果表明，SIM 001菌产生的微生物农药防霉剂叶面喷雾可有效防治黄瓜霜霉病发生危害，具有防效好、安全无害的特点，适合用于已对化学农药产生抗性的黄瓜霜霉病的防治。大田使用浓度以防霉剂200倍液为宜，间隔时间5-7天，并应连续喷施2-3次，则可有效控制黄瓜霜霉病的发生危害。

4.2.3.3.2.本试验结果说明，SIM 001菌产生的水剂微生物农药防霉剂对黄瓜灰霉病防治效果不理想。建议在配方上进一步改进或完善，拓宽防治谱，提高防治效果。

4.2.4.例4、微生物农药一SIM01菌剂防治大棚温室番茄根结线虫病的效果试验

蔬菜根结线虫(为南方根结线虫Meloidogyne incognita)是一种世界性分布的威胁农业生产的主要病原物，是近年来一种重要作物根部病害，是世界各国的对外检疫对象。根结线虫病也是国内外最为严重的植物病害之一，这种病害在温室、大棚和露地等栽培的作物上都有发生，一般造成作物减产20％-30％，严重的达50％以上，已成为当前蔬菜生产的一大障碍。

对于根结线虫的防治，历来以化学药剂为主。由于化学药物残留易造成土壤板结、作物毒化，通过食物链再给人类带来危害，因此，通过不产生公害、无残留的生物防治来控制根结线虫的技术越来越受到人们重视。从微生物中寻找对根结线虫有抑杀作用的药剂成为近年来的一个研究热点。我们用SIM001菌剂对番茄根结线虫进行了防治效果及安全性评价。以期为该制剂应用范围提供科学依据。现将结果总结如下：

4.2.4.1.材料与方法：

4.2.4.1.1.供试作物：

大棚温室番茄(西安市长安区)。

4.2.4.1.2.供试对照药剂：

4.2.4.1.2.1.3％米乐尔颗粒剂(广州农药厂生产，市售)

4.2.4.1.2.2.SIM01菌剂供试菌剂的制备：

供试菌种  SIM01菌剂分成液体培养和固体培养两种。a.用液体培养液34℃摇床振荡培养4天，原发酵液含活菌菌液备用；b.用固体培养基34℃培养6天，为固体活菌菌剂直接备用。

4.2.4.1.3.试验处理：

在长安区温室蔬菜病地上，划分12个长方形小区，每小区面积为4m²(4X1)，每小区2行20株。实验共设防霉菌剂-a、防霉菌剂-b、3％米乐尔和清水空白对照四个处理，每个处理3次重复。液体菌剂按每小区1000ml灌根盖土；固体菌剂则在番茄苗根部周围挖穴，以每株50g的使用量拌土填入后盖土；对照药米乐尔施用量按45kg/ha换算，拌土根施后盖土；对照用清水拌土同法进行处理。各植株均匀洒水保持湿润。

4.2.4.1.4.试验调查；

药效调查：于施药处理后30天、处理后100天在各试验小区采样，每点采5株，把番茄苗挖出后放清水中轻轻冲掉泥土，称重后只留根系进行检查。观察番茄根部结节数，以其结节数的多少作为防效计算基数。同时测植株高度。计算防治效率和植株的增高率。用DMTR法检验各处理间的差异是否显著。

4.2.4.1.5.计算公式

(注：Pt₁为处理30天，Pt₂为处理后100天)

0级：整个根系无根结

1级：整个根系的1％-20％有根结

2级：整个根系的21％-40％有根结

3级：整个根系的41％-60％有根结

4级：整个根系的61％以上有根结

4.2.4.2.结果与分析(表8)

实验结果表明：菌剂在田间对番茄根结线虫有一定的防治效果。其中，SIM001-b菌剂的处理效果最好。处理后30天的防效为73.37％，与对照药3％米乐尔的防效87.75％差异显著，以对照药3％米乐尔的防效为优良；处理后100天则SIM001菌剂的防效有所上升，达88.74％，与对照药米乐尔的防效73.08％差异显著，此时，以SIM001-b菌剂的处理效果好，SIM001-a处理的效果次之。从发病程度看：SIM001-b处理的田间发病最轻，其根结指数21.03％，与对照药米乐尔和SIM001-a菌剂的处理有显著差异。从植株生长情况看，以SIM001-b菌剂的处理效果最好，处理后100天番茄苗增高率达92.03％，与空白对照增高率55.10％差异非常显著。其次是SIM001-a菌剂的处理，增高率达87.12％。结果表明：SIM001菌剂对番茄生长有一定的促进作用。

表8 SIM001菌剂防治番茄根结线虫田间试验结果

处理	30天相对防效(％)	100天相对防效(％)	病情指数(％)	增高率(％)
					SIM01菌剂-a	71.04bB	80.71aA	28.1lbB	87.12abA
SIM01菌剂-b	73.37bB	88.74aA	21.03cC	92.03aA
					米乐尔3％	87.75aA	74.11aA	38.36bcBC	76.86abA
CK	------	-------	91.62aA	55.10bA

注：小写字母为0.05显著水平，大写字母为0.01显著水平。

4.2.4.3.讨论

4.2.4.3.1.SIM001菌剂菌在田间土攘中对番茄根结线虫病有较高的抑制作用。

4.2.4.3.2.SIM001菌剂在处理后100天的防效比30天的防效略有上升，而对照药米乐尔处理后100天的防效比30天的防效有所下降。表明化学药品药效随着时间推移会有所下降，但是SIM001活菌剂菌在田间的防效却随着该活菌的定植而效果持久，后效作用明显。

4.2.4.3.3.试验中还发现，SIM001菌剂对番茄苗生长有一定的促进作用，这一结果可能与施到土壤里的菌剂成分有关。即菌剂中带有其培养物和代谢物成分，这些物质可能给植物带来新的营养或生长因子，起到肥效作用，而使植株健壮，增高加快。

4.2.4.3.4.生防菌与线虫、作物和土壤各因子之间的相互作用关系以及如何创造更合适的条件才能更有利于菌种定植，缩短起始期的时间等等还有待进一步研究。但是实验表明用非化学性的微生物防治则不失为生物防治中最有前途的方法之一。

五、毒力测试

陕西省疾病预防控制中心对SIM 001菌产生的生物防霉剂水剂毒性检测报告

样品编号.农N(2003)第0017号

样品名称 生物农药(抗霉剂)

样品来源 送检

样品性状 棕色液体

检验依据 GB15670-1995《农药登记毒理学试验方法》

检验项目 大鼠经口急件毒性试验

检验类别 鉴定

样品数量 1000ml

收样日期 2003年09月19日

检验完成日期 2003年11月10日

5.1.受试物：SIM001菌剂由发酵液组成生物农药(抗霉剂)。取受试物30g加蒸溜水至50ml，充分混匀。

5.2.试验动物：由西安交通大学医学院实验动物中心提供SN大白鼠20只，雌、雄各半，体重180-220g，一级动物(医动字第08-005号)。饲料、垫料来源同上。

5.3.动物室环境：温度21-24℃，相对湿度45％-55％。动物房合格证号：医动字第08-32号。

5.4.试验方法：取禁食16h的试鼠20只，将受试物按6000mg/kg.bw的剂量(灌胃容量1.0ml/100g.bw)，一次灌胃给予，连续观察14d，记录中毒表现及死亡情况。

5.5.试验结果：观察期内未见试鼠出现任何中毒症状，体重无异常变化。故雌、雄大白鼠急性经口毒性LD50)6000mg/kg。

5.6.结果评价：按GB 15670-1995《农药登记毒理学试验方法》中评价标准，生物农药(抗霉剂)大鼠经口急性毒性属低毒级。

Claims (6)

1.一种抗生链霉菌，其特征在于命名为SIM001的抗生链霉菌是西安保藏变异种的亚种(Streptomyces antibioticus subspecies xi’an)；由⁶⁰Co-r射线诱变，经筛选获得；该菌种已在国家知识产权局专利局指定的保藏单位进行了专利保藏，保藏日期为2005年4月14日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.1349。

2.根据权利要求1所述的一种抗生链霉菌，其特征在于：菌种培养及发酵条件为：

斜面培养基：该菌种斜面培养基为PDA培养基或普通放线菌用培养基；培养温度为26℃～45℃：

液体发酵：液体发酵用培养基经正交试验选择，确定摇床用发酵培养基的主要成分为：可溶性淀粉0.5％-6％，葡萄糖0.5％-6％，MgSO₄ 0.05％，Fe₂SO₄0.001％，K₂HPO₄ 0.05％，酵母膏0.5％，豆饼粉0.2％-4％，鱼粉0.2％-4％；水100ml；PH控制在4-10；将培养基灭菌后，接入菌种，置摇床，26℃一45℃培养。

固体培养：固体培养基可用各种农副产品及其下脚料作培养基的主要成分，包括稻、谷、玉米、麦类、高梁、豆类的面粉及其加工下脚料；各种榨油后的餅粕，各种含蛋白质和碳水化合物的动物材料均可以作为菌种培养基的组合物；按照蛋白质∶碳水化合物＝1一7∶9-3的比例配制培养基物料，添加基料量50％一300％的水混合，拌匀即可；基料中添加稻、谷、玉米、麦类、高梁、豆类物质，为1-10％；将培养基灭菌后，接入菌种，置26℃一45℃培养。

3.根据权利要求1所述的一种抗生链霉菌，其特征在于：该菌种经液体发酵72h一170h，由发酵原液制成生物防霉剂水剂，生物防霉剂水剂对包括稻瘟病蚀脉孢霉Fusarium vasinfetum Atkin son、稻梨孢霉Piricularia oryzaeCavara和立枯丝核菌Rhizoctonia solani kiihn在内的多种真菌有抑制作用；对苹果褐斑病、番茄叶霉病、日光温室黄瓜黄霉病、灰霉病多种植物真菌病有防治作用；使用带有培养代谢成分的菌剂还有促植物生长作用。

4.根据权利要求1所述的一种抗生链霉菌，其特征在于：该菌剂其由液体、固体发酵制成的菌剂用于防治植物根结线虫病害。

5.根据权利要求1所述的一种抗生链霉菌，其特征在于：该菌种包括原始菌种发酵制成的液体、固体菌剂、提取物，用于防治植物根结线虫病害、真菌病害。

6.根据权利要求1所述的一种抗生链霉菌，其特征在于：该菌种发酵物、其提取物制成医用、农用用途的抗生制剂、促生长制剂。

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