CN103789221B

CN103789221B - 具有广谱抑菌活性的放线菌及其筛选方法

Info

Publication number: CN103789221B
Application number: CN201310157315.2A
Authority: CN
Inventors: 刘志民; 马焕普; 薛红燕
Original assignee: Beijing University of Agriculture
Current assignee: Beijing University of Agriculture
Priority date: 2013-04-28
Filing date: 2013-04-28
Publication date: 2016-05-04
Anticipated expiration: 2033-04-28
Also published as: CN103789221A

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体而言，特别涉及具有广谱抑菌活性的放线菌及其筛选方法。一种具有广谱抑菌活性的放线菌，该菌属于链霉菌属(Streptomyces？sp.),其保藏编号为：CGMCC？No.7278。一种具有广谱抑菌活性的放线菌的筛选方法，包括：从待分离的土壤样品中得到培养的放线菌；利用平板对峙法、抑菌圈法或十字交叉法从所述培养的放线菌中筛选得到拮抗靶标菌的放线菌。本发明所提供的具有广谱抑菌活性的放线菌及其筛选方法，通过抑制病原菌生长繁殖的作用对植物病害起到防治的作用，该方法较传统的化学农药防治植物病害的防线相比，其防治效果显著，对土壤无污染，利于无公害、绿色产品的生产。

Description

具有广谱抑菌活性的放线菌及其筛选方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体而言，特别涉及具有广谱抑菌活性的放线菌及其筛选方法。

背景技术

植物的病害是由多种病原菌导致的，例如，桃树根癌病(亦称冠瘿病)是由根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)引起的一种世界范围的植物细菌肿瘤病害，我国各地桃树栽培区均有发生，在有的地区，发病率高达100％；植株一旦染病，很难治愈，轻则衰弱黄叶，重则死树；李干腐病是危害枝干和果实的重要病害，是李栽植成活率低和幼树死亡的重要原因，该病原菌为李干腐病菌(Polvporushirsutus)，除危害李树外，还危害梨、柑橘、核果类果树、一部分干果树种，以及杨、柳、刺槐等多种林木；草莓灰霉病是由灰霉病病菌(Botrytiscinerea)导致的，常造成花及果实腐烂，感病品种的病果率在30％左右，严重的可达60％以上，对草霉产量、品质影响很大。

目前，对植物病害最常用措施化学农药防治，例如，利用涂抹石硫合剂或70％甲基硫菌灵可湿性粉剂100倍液等于树干的方法防治李干腐病；利用在移栽或育苗整地前用65％甲霉灵可湿性粉剂400倍液，或50％多霉灵可湿性粉剂600倍液，或50％敌菌灵可湿性粉剂400倍液，或45％特克多悬乳剂600倍液，对棚膜、土壤及墙壁等表面喷雾，进行消毒灭菌预防草莓灰霉病等。

但是，目前，这些用化学农药防治植物病害的方法，防治效果不理想，并且使用化学农药防治植物病害会污染土壤环境，不利于无公害和绿色果品生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有广谱抑菌活性的放线菌及其筛选方法，以解决上述的问题。

本发明的实施例中提供了一种具有广谱抑菌活性的放线菌及其筛选方法，该菌为Streptomycessp.,其保藏编号为：CGMCCNo.7278；保藏地点为：中国，北京；中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为：2013年3月5号；该菌属于链霉菌属；该菌的筛选方法包括，A)从待分离的样品中得到培养的放线菌；B)利用平板对峙法、抑菌圈法或十字交叉法从所述培养的放线菌中筛选得到拮抗靶标菌的放线菌。

本发明上述实施例的具有广谱抑菌活性的放线菌及其筛选方法，该菌为Streptomycessp.,其保藏编号为：CGMCCNo.7278；是从桃根癌病树根土中，筛选出的具有抗氰作用的放线菌，该菌属于链霉菌属，在实验室条件下，对于多种导致植物病害的病原菌，例如，根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、李干腐病菌(Polvporushirsutus)、灰霉病病菌(Botrytiscinerea)，有明显的抑制效果；可以作为一种很好的抑菌微生物，用于杀死或者抑制导致植物发生病害的多种病原菌；进而对植物起到防护病害的作用，在具体的操作中，可将筛选得到的放线菌的发酵液喷撒在植株的病害部位；或者可以放线菌活体菌株或发酵液为有效成分制成抑菌肥料，并将抑菌肥料施加到植株的根部土壤中，进而形成以病原菌为靶标，通过抑制病原菌生长繁殖的作用对植物病害起到防治的作用，该方法较传统的化学农药防治植物病害的防线相比，其防治效果显著，对土壤无污染，利于无公害、绿色产品的生产。

附图说明

图1示出了本发明实施例1的放线菌的筛选方法；

图2-图5示出了本发明实施例2的放线菌对于李干腐病病菌的抑制效果图；

其中，图2表示用Streptomycessp.发酵液浸泡李枝条；图3表示用水浸泡李枝条；图4表示用Streptomycessp.浸泡后接病原菌李枝条；图5表示用水浸泡后接病原菌李枝条；

图6-图9示出了本发明实施例2的放线菌对于草莓灰霉病菌的抑制效果图；

其中，图6表示用Streptomycessp.发酵液浸泡草莓；图7表示用Streptomycessp.发酵液浸泡草莓后接灰霉孢子悬浮液；图8表示用水浸泡草莓；图9表示用水泡草莓后接灰霉孢子悬浮液。

具体实施方式

下面通过具体的实施例子并结合附图对本发明做进一步的详细描述。

本发明实施例一提供的一种具有广谱抑菌活性的放线菌，该菌为Streptomycessp.，已于2013年3月5号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位的地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏编号为CGMCCNo.7278；其分类命名为：链霉菌(Streptomycessp.)。通过实验数据表明，Streptomycessp.对李干腐病病菌Polvporushirsutus、灰霉病病菌Botrytiscinerea茄褐纹拟茎点霉Phomopsisvexans、黑根霉Rhizopusnigricans、马铃薯干腐病病菌Fusariumcaerulem(Libert)Sacc.、白菜黑斑病菌Alternariabrassicae、大丽轮枝菌Verticilliumdahlia、银杏叶枯病病菌AlternariatenuisNess、胶孢炭疽菌ColletotrichumgloeosporioidesPenz.、金银木假尾孢叶斑病菌Pseudocercosporalonicericola(Yamam.)Deighton、桃褐腐病菌Moniliniafructicola、棉花红点病病菌Fusariummonihforme、葡萄痂圆孢菌SphacelomaampelinumdeBary、菜豆炭疽病病菌Colletotrichumlindemuthianum、尖孢镰刀菌Fusariumoxysporium、巴西毛壳菌Chaetomiumbrasiliense、枝孢芽枝菌Cladosporiumcladosporioides、丁香假单胞菌流泪致病变种Pseudomonassyringaepv.lachrymans、大肠杆菌EscherichaiColi、油菜黄单胞菌疤斑致病变种X.campestrispv.vesicatoria、胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种Erwiniacarotovorasupsp.Carolovora、油菜黄单胞菌油菜致病变种X.campestrispv.Campestris、丁香假单胞菌番茄致病变种Pseudomonassyringaepv.tomato、根癌农杆菌Agrobacteriumtumefacien/或发根农杆菌Agrobacteriumrhizogene均有明显的抑制作用。

本发明实施例一还提供了放线菌的筛选方法，请参考图1，包括，步骤101：从待分离的土壤样品中得到培养的放线菌；步骤102：利用平板对峙法、抑菌圈法或十字交叉法从所述培养的放线菌中筛选得到拮抗靶标菌的放线菌。

病原真菌和细菌均可以作为筛选放线菌的靶标菌，根据使用目的的不同，可以选取不同的靶标菌，例如，可以选取根癌农杆菌作为靶标菌。

Streptomycessp.作为一种很好的抑菌微生物，其可以杀死或者抑制导致植物发生病害的多种病原菌；进而对植物起到防护病害的作用，在具体操作中，可将筛选得到的放线菌的发酵液喷撒在植株的病害部位；或者可以放线菌活体菌株或发酵液为有效成分制成抑菌肥料，并将抑菌肥料施加到植株的根部土壤中，进而形成以病原菌为靶标，通过抑制病原菌生长繁殖的作用对植物病害起到防治的作用，该方法较传统的化学农药防治植物病害的方法相比，其防治效果显著，对土壤无污染，利于无公害、绿色产品的生产。

为了使得本发明实施例一提供的放线菌能够顺利的筛选和分离，本发明实施例二还提供对于实施例一提供的放线菌的筛选方法做出了进一步的限定，并通过以下内容详细阐述：

进一步的，在所述从待分离的土壤样品中得到培养放线菌的步骤中，所述待分离的土壤样品为桃树根部土壤；在筛选的过程中，靶标菌选择为根癌农杆菌，根据根癌农杆菌的生长情况筛选得到具有较好拮抗作用的放线菌。

土壤中富含有多种微生物，放线菌只是其中的一大类，在放线菌的筛选中，土壤是主要筛选源，在本实施例中，选取桃树根部土壤作为待分离的样品；因为桃树根部土壤中含有较多氰氢酸，氰氢酸是一种毒性物质，除抑制植物根系的生长外，也能抑制多数微生物的生长和繁殖，因此选取桃树根部土壤作为放线菌的筛选源，并在培养基中加入不同浓度的氰化钾，目的就是筛选出能够耐氰化物的拮抗放线菌。

进一步的，取待分离的土壤样品10g置于磷酸缓冲液中，并得到上清液；将所述上清液分成多份，分别稀释至10^-8、10^-4和10^-2梯度，得到不同浓度的样品悬液；将所述不同浓度的样品悬液分别涂在氰化钾浓度为10mg/L、20mg/L和40mg/L的高氏培养基上，28℃恒温培养，得到培养的放线菌。

放线菌的分离过程主要通过上述步骤实现，将土壤置于磷酸缓冲液之后，土壤中的微生物就会溶解到缓冲液中，由于土壤中的微生物数量巨大，因此需要将上清液稀释成不同的浓度梯度，得到不同浓度的悬液，将不同浓度的悬液涂在氰化钾浓度为10mg/L、20mg/L和40mg/L的高氏培养基上28℃恒温培养，得到单菌落，此时，除放线菌之外的多数微生物可被氰化钾杀死，通过重复培养之后即会得到放线菌的单菌落。

可选的，在得到所述拮抗靶标菌的放线菌之后，进一步的可对筛选得到的放线菌进行抑菌实验，包括：将所述具有拮抗靶标菌的放线菌接种到高氏液体培养基后，在28℃下，以180转/分钟摇床，震荡培养7-10天，得到放线菌发酵液；分别将多种供试菌接种到培养基上培养，待干后，在接有所述供试菌的培养基上打孔；将所述放线菌发酵液注入所述培养基上的孔，恒温培养，并检测抑菌圈直径；抑菌圈直径大于15毫米的供试菌即为所述放线菌对其有抑制作用；该种所述供试菌为病原引起的病害可作为放线菌的防治对象。

上述步骤为得到放线菌菌株之后将其制成放线菌发酵液，在得到放线菌发酵液的过程中，培养时间优选为8天，培养8天的放线菌其处于生长繁殖的旺盛期，因此，可以此时的放线菌发酵液作为后续的抑菌实验；得到放线菌发酵液之后对多种供试菌进行抑菌实验，检测放线菌发酵液对每种供试菌的抑菌圈直径，通过抑菌圈的直径进而得到放线菌对供试菌的抑制效果，进而将具有较好抑制效果(优选抑菌圈直径大于15毫米)放线菌发酵液应用到供试菌引起的病害植物病害的防治中。

具体的，在所述分别将多种供试菌接到培养基上培养，待干后，在接有所述供试菌的培养基上打孔的步骤中；

所述供试菌包括：李干腐病病菌Polvporushirsutus、灰霉病病菌Botrytiscinerea茄褐纹拟茎点霉Phomopsisvexans、黑根霉Rhizopusnigricans、马铃薯干腐病病菌Fusariumcaerulem(Libert)Sacc.、白菜黑斑病菌Alternariabrassicae、大丽轮枝菌Verticilliumdahlia、银杏叶枯病病菌AlternariatenuisNess、胶孢炭疽菌ColletotrichumgloeosporioidesPenz.、金银木假尾孢叶斑病菌Pseudocercosporalonicericola(Yamam.)Deighton、桃褐腐病菌Moniliniafructicola、棉花红点病病菌Fusariummonihforme、葡萄痂圆孢菌SphacelomaampelinumdeBary、菜豆炭疽病病菌Colletotrichumlindemuthianum、尖孢镰刀菌Fusariumoxysporium、巴西毛壳菌Chaetomiumbrasiliense、枝孢芽枝菌Cladosporiumcladosporioides、丁香假单胞菌流泪致病变种Pseudomonassyringaepv.lachrymans、大肠杆菌EscherichaiColi、油菜黄单胞菌疤斑致病变种X.campestrispv.vesicatoria、胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种Erwiniacarotovorasupsp.Carolovora、油菜黄单胞菌油菜致病变种X.campestrispv.Campestris、丁香假单胞菌番茄致病变种Pseudomonassyringaepv.tomato和根癌农杆菌Agrobacteriumtumefacien/或发根农杆菌Agrobacteriumrhizogene中的一种或多种；

所述培养基包括：低盐液体培养基和牛肉膏蛋白胨固体培养基。

在所述将所述放线菌发酵液注入所述培养基上的孔，恒温培养，并检测抑菌圈直径的步骤中；

所述放线菌发酵液的体积为100微升；所述恒温培养的温度为28℃，培养时间为1天。

温度和时间的控制对抑菌实验的结果非常重要，因此，优选的，恒温培养的温度为28℃，培养时间为1天。

进一步的，在所述将所述放线菌发酵液注入所述培养基上的孔，恒温培养，并检测抑菌圈直径的步骤中；抑菌圈直径通过游标卡尺检测。

一般情况下，通过肉眼观察抑菌圈的直径即可以初步的判定抑菌效果，但是为了得到准确的抑菌圈直径，通常采用游标卡尺对每个抑菌圈进行精准的测量，进而准确的了解放线菌对多种供试菌的抑菌效果。

其中，请参考表1、表2和图2-图9，实验数据表明，菌株Streptomycessp.发酵液对17菌株对供试的17种病原真菌和7种病原细菌都有不同程度的抑菌效果，抑菌谱较广。整体而言，对真菌的抑菌效果高于对细菌的抑菌效果，尤其对李干腐病病菌(Polvporushirsutus)抑菌圈直径最大为41.24mm，草灰霉病菌(Botrytiscinerea)次之为40.08mm，对枝孢芽枝菌(Cladosporiumcladosporioides)最小为23.23mm。因此，在实际的使用中，菌株Streptomycessp.发酵液可重点用于防治植株的李干腐病和草莓灰霉病。

表1菌株Streptomycessp.发酵液对17种病原真菌的抑制作用

其中，小写字母表示5％水平上有差异，大写字母表示1％水平上有差异。抑菌圈直径为三次重复的平均值。

表2菌株Streptomycessp.发酵液对8种病原细菌的抑制活性

此外，图2-图5示出了放线菌Streptomycessp.发酵液对李干腐病的防治效果；其中，图2表示用Streptomycessp.发酵液浸泡李枝条；图3表示用水浸泡李枝条；图4表示用Streptomycessp.浸泡后接病原菌李枝条；图5表示用水浸泡后接病原菌李枝条。

对比图2-图5的抑制效果，图2(用Streptomycessp.发酵液浸泡)和图3(用水浸泡)中的李枝条都没有染菌，图4(用Streptomycessp.发酵液浸泡后接病原菌)的枝条仅有一处染菌，而图5(用水浸泡后接病原菌)的枝条12个伤口全部染菌。因此，实验表明Streptomycessp.发酵液对预防李干腐病原菌对李枝条的侵染有一定作用。

图6-图9示出了放线菌Streptomycessp.发酵液对草莓灰霉病的防治效果；其中，图6表示用Streptomycessp.发酵液浸泡草莓；图7表示用Streptomycessp.发酵液浸泡草莓后接灰霉孢子悬浮液；图8表示用水浸泡草莓；图9表示用水泡草莓后接灰霉孢子悬浮液；

对比图6-图9的抑制效果，可以看出，图6(只用发酵液浸泡草莓)处理的草莓果实表面光亮，且只有一个草莓受到局部染菌。其次为图7(用发酵液浸泡草莓后接灰霉孢子悬浮液)的处理，有三个草莓受到部分染菌。图8(用水浸泡)处理的草莓腐烂很严重，经菌种鉴定，有4枚还感染了黑根霉菌，图9中，用水泡后接灰霉孢子悬浮液)的处理全部严重感染灰霉菌。说明F3发酵液具有延缓草莓果实染菌的效果，对草莓的存储保鲜有一定作用。

Streptomycessp.，属于链霉菌属；其基因序列如下：

CAAGTCGAACGATGAAGCCCTTCGGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAACACCGGCTTCCGCATGGAAGCTGGTTAAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGAGGCTTAACCTCGGGTCTGCATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATTAGAGATAGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAACTCTTCGGAGGTTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCAAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTG

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内

Claims

1.一种具有广谱抑菌活性的放线菌，其特征在于，该菌属于链霉菌属,其保藏编号为：CGMCCNo.7278。

2.供试菌的拮抗剂，其活性成份为保藏编号为：CGMCCNo.7278的链霉菌，其特征在于，所述供试菌为：

巴西毛壳菌Chaetomiumbrasiliense、枝孢芽枝菌Cladosporiumcladosporioides或根癌农杆菌Agrobacteriumtumefacien中的一种或多种。

3.权利要求1所述的具有广谱抑菌活性的放线菌在防治植物病害中的应用。