CN102344891B - 一种抗水稻稻曲病的青霉菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗水稻稻曲病的青霉菌及应用，其步骤：A、稻曲病菌分离：采集稻曲病病穗，采用厚垣孢子悬液法分离稻曲病菌。B、稻曲病菌拮抗菌分离与培养：土壤样品碾细，置于无菌培养皿中，倒入PDA培养基，培养分离真菌单菌落；将分离获得的真菌菌株接种于PSA培养液中振荡培养。发酵液过滤除菌，得无菌上清液样品。C、稻曲病菌拮抗菌筛选：取稻曲病菌分生孢子悬液涂布在PSA平板上，于平板中放置无菌牛津杯并加入无菌上清液样品，培养后获得青霉菌。一种拮抗青霉菌AF-25在制备防治或预防水稻稻曲病的生物农药中的应用。该青霉菌对水稻稻曲病菌具有拮抗作用。该青霉菌能抑制稻曲病菌孢子的萌发和菌丝生长，其发酵液对稻曲病具有较强的抑制活性。

Description

一种抗水稻稻曲病的青霉菌及应用

技术领域

本发明涉及水稻稻曲病菌[Ustilaginoidea virens(Cke)Tak]的微生物防治，更具体涉及一株对水稻稻曲病菌具有拮抗作用的产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)，同时还涉及该菌的制备方法，还涉及该菌的用途。该株青霉菌属真菌，能抑制稻曲病菌孢子的萌发和菌丝生长，其抑菌活性物主要是分子量小于3500Da的小分子多肽或其衍生物。该菌株的发酵液对稻曲病菌具有较强的抑制活性，且具有较好的贮存稳定性、酸碱和温度耐受性，动物毒性实验表明，该菌发酵上清液对实验大鼠不具有明显毒性，属于微毒级，因此该菌株可以用于生产防治水稻稻曲病的微生物杀菌剂。

背景技术

微生物杀菌剂是指微生物及其代谢产物以及由它们加工而成的具有抑制植物病害的生物活性物质。微生物杀菌剂主要抑制病原菌生长繁殖、干扰生物合成和破坏细胞结构。微生物杀菌剂主要有农用抗生素、细菌杀菌剂、真菌杀菌剂、病毒杀菌剂等类型(干旱环境监测，2008，22(4)：236-242；生物农药[M].北京：化学工业出版社，2000；世界农药，2001，23(1)：1-6)。

长期以来，我国农作物的病虫害防治主要依赖化学农药，导致农药污染成为世界上最严重的国家之一，食品中农药检出率高达90％以上，严重危害广大消费者的生命健康，同时也使我国农产品出口频频遭遇国外的″绿色堡垒″，严重影响我国现代农业产业的发展，农药污染成为粮食安全生产中急需解决的难题。相比化学农药，微生物农药具有安全、环保、长效、无残留等优点，注重低毒、高效、选择性强，成为当前的研究热点之一。

水稻稻曲病是由稻曲病菌[Ustilaginoidea virens(Cke)Tak]引起的水稻穗部真菌性病害，该病害在世界水稻产区都有发生，亚洲、欧洲、美洲和非洲都有稻曲病严重爆发的报道(Plant Protection，1989，43：311-314)。近年来，随着优质杂交水稻的推广和大面积种植，生产上常用的水稻品种普遍生育期延长，对肥水要求提高，在产量提高的同时，也为稻曲病的发生流行创造了有利条件，稻曲病的发生也逐年加重，已成为水稻主产区影响产量和品质的重要因素。

水稻稻曲病的发生和分布较为广泛，早在1972年，在中国、日本、菲律宾、美国、巴西、澳大利亚、埃及、英国等五大洲40多个国家报道有稻曲病的发生。Chib.H.和Sing.S(1992)报道了印度发生稻曲病的情况(Indian J Mycol.PI.Patbol，1992，22(3)：278-280)。20世纪50、60年代，稻曲病在我国局部稻区零星或严重发生，70年代以后，随着杂交稻大面积推广和施用氮肥水平的提高，导致该病较大面积的流行。1982年湖南省稻曲病严重发生，发病面积达666666.7hm²，1984年辽宁省稻曲病发病面积超过20万hm²，占全省种植面积的43％，病穗率一般为5％-10％。2004年，湖南省中晚稻稻曲病情比较严重，尤以中稻发生最为严重，发生面积达63.3hm²，损失稻谷1.37亿kg，直接经济损失约2亿元(中国植保导刊，2005，25(8)：14-15)。

稻曲病不仅严重影响水稻产量，更严重的是稻曲病菌可以产生一类环肽类毒素——稻曲菌素，直接影响水稻的食用安全性。稻曲菌素能够抑制真核生物微管蛋白的组装与细胞骨架的形成，继而抑制细胞有丝分裂，从而表现出明显的细胞毒性，对动物和植物产生毒害作用(J Antibiot(Tokyo)，1994，47(7)：765-773)。稻曲病菌可以产生至少6种毒素(Ustiloxin A-F)，目前，这6种毒素的结构已经被分析出来，它们都是含有13个环心和一个手性的叔-烷基-芳香基-乙醚键结构的多肽(JAm Chem Soc，2008，130(7)：2351-2364；Biochemical pharmacology，1995，49(10)：1367-1372)。Nakamurak等报道，稻曲病谷粒对老鼠有毒性，可引起其心脏、肾脏的病变(Proceedings of the Japanese Association of Mycotoxicology，1992，35：41-43)。据黄世文研究报道，用稻曲病粒拌饲料喂家兔、白洛克小公鸡和当地母鸡，经35-84天喂饲，可引起实验动物的死亡和心、肝、肺等内脏器官病变，致死量为每克体重每日进食稻曲病谷0.14-0.17粒。用带稻曲病菌的谷糠喂猪，母猪出现产死胎、干尸胎和畸形胎等(江西农业学报，2002，14(2)：45-51)。季宏平报道，水稻稻曲病随着每穗稻曲球数增加，每穗实粒数、实粒重下降，而秕谷率逐渐上升，此病不仅毁掉有病子粒，而且还消耗整个病穗及植株的营养，使病穗上的其它子粒不饱满，造成水稻产量严重损失(黑龙江收业科学，2000，(4)：18-19)。

水稻稻曲病的发生和病情与多种因素有关，其中主要包括水稻品种、施肥水平、栽培技术管理技术及气候条件等。在农业生产中，人们针对这些方面有计划地采取相关措施，以减轻稻曲病的危害。例如，铲除菌源，将病残体清除出稻田；选用相对抗病性强的水稻品种；合理密植，这样不但能起到防病增产的作用，而且便于施药施肥等栽培管理；选用恰当的施肥技术，合理配方施肥，不过多使用氮肥，避免后期氮肥用量过多造成水稻贪青晚熟；加强水浆管理，采取浅水勤灌。

选用适量的化学农药是目前最主要的防治措施。目前生产中使用的药剂很多，例如20％瘟曲克星、30％爱苗、30％稻病宁、35％苯乙锡酮、28％酮氧亚铜WP等。使用化学药剂喷洒，用药时间的选择非常关键。根据天气预报情况，如果破口期前后阴雨天气多，一般于水稻破口前1～10d，在无雨的天气，孕穗中期和孕穗末期各施1次药剂(农业装备技术，2002，106(4)：17-18)。化学农药的使用在一定程度上减轻了稻曲病的病情，但由于目前还没有研发出专一性强的特效化学药剂，所以稻曲病的危害依然非常严重。同时，化学农药对生态环境污染严重，易残留在谷物中，对人类生命健康也有极大的威胁，许多国家纷纷禁止一些剧毒化学农药的使用，这就呼吁人们寻找更高效，更环保的防治方式。

采用对稻曲病菌有拮抗作用的拮抗微生物制剂防治稻曲病，是目前的研究热点之一，目前已开发出相应剂型应用于实际生产中，如纹曲宁(四川农业科技，2006(5)：39)。纹曲宁是由枯草芽孢杆菌与井冈霉素进行复配而成的微生物农药，这种复配农药不仅能发挥井冈霉素杀菌速度快，防效稳定地优势，同时保持了枯草芽孢杆菌能定植于水稻根周围，分泌抗生素及诱导水稻产生抗病性等特点，达到两药优势互补、用量减少、防效提高的目的。纹曲宁杀菌剂持续期长、无毒无残留，不污染环境，是理想的农药品种。虽然目前使用纹曲宁防治稻曲病取得了一定的经济效益和生态效益，但纹曲宁中的井冈霉素只是水稻纹枯病菌的高效杀菌剂，对稻曲病菌的防效欠佳；而枯草芽孢杆菌虽然对多种植物病原菌有抑制作用，同样对稻曲病菌杀菌效果不强。鉴于生物农药多方面的优点，迫切需要寻找更加高效的对稻曲病菌具有防治作用的生物农药。

微生物杀菌剂主要包括农用抗生素、活体杀菌剂以及以微生物代谢产物为基础，由此衍生而出的化学杀菌剂。

农用抗生素是微生物在代谢过程中产生的次级代谢产物，在一定浓度时能够抑制或杀灭病原微生物。目前，有许多种类的农用抗生素已应用于水稻、蔬菜、水果的真菌病害防治。在农用抗生素研制方面，日本走在世界的前列。1961年，日本最先将杀稻瘟菌素S应用于水稻稻瘟病的防治，取代了以往依靠有机汞防治稻瘟病方法。继杀稻瘟菌素S之后，日本又相继研发出了春雷霉素、多氧霉素、有效霉素等一系列的农用抗菌剂。据统计，1988年总计发现了约8000种抗生素，其中约43％是由日本学者发现的。杀稻瘟菌素(Blasticidin S)是第一个用于防治水稻稻瘟病的微生物杀菌剂，它是一种核苷类抗生素，是链霉菌在代谢过程中产生的次级代谢产物，能够显著地抑制病原菌菌丝生长和孢子萌发。据报道，每公顷稻田喷洒10-30克杀稻瘟菌素，能够有效地抑制稻瘟病害(Crop Protection Agents fromNature：Natural Products and Analogues，Cambridge，UK，Royal Soc Chem，1996，27)。由于杀稻瘟菌素中含有苄氨基磺酸结构，其对一些种类的农作物，例如葡萄、西红柿、马铃薯具有一定的毒害性，但该结构的存在与否对杀稻瘟菌素的杀菌活性并没有影响，因此，在工业生产中，常制成灭瘟素的硫酯盐和月桂酸硫酸盐，可以在一定程度上减小其对植物的毒害性。由于杀稻瘟菌素对植物的毒性及对哺乳动物具有一定的副作用，这种杀菌剂在市场上逐渐被其它产品，如春雷霉素所取代。春雷霉素(Kasugamycin)是一种从Streptomyces kasugaensisa和Streptomyceskasugaspinus的代谢产物中分离得到的氨基-糖类化合物(Journal of Antibiot，1965，18：104)。春雷霉素可以显著地抑制稻瘟病菌菌丝的生长，在田问试验中，使用低于20ug/ml的有效浓度可以较好的防治稻瘟病；使用2％春雷霉素水溶液浸泡水稻种子，可以有效地较少稻瘟病的发生(Journal of Antibiot，1965，18：115-119；British Crop Protection Council，1994)。Umezawa等报道，春雷霉素对植株无毒害作用，并且对哺乳动物和鱼类毒性也较小，因此是一种良好的抗菌剂(Journalof Antibiot，1965，18：101-103)。但是，春雷霉素最大的缺点是其导致病原菌抗性问题非常严重，在稻田中使用数年后，会导致许多抗性菌株的产生(Pest ManagSci，2000，56：651-676)。为了解决这一问题，目前农业生产中将春雷霉素与化学合成的杀菌剂制成复配试剂后再喷洒于农田。多氧霉素(Polyoxins)是由Streptomyces cacaoi var.asoensis发酵产生的一类肽嘧啶核苷类抗生素，对小麦白粉病、黄瓜霜霉病、甜菜褐斑病、水稻纹枯病等多种植物真菌性病害具有良好的防治效果，并且能够刺激植物的生长。多氧霉素可以选择性抑制敏感病原真菌几丁质细胞壁的形成，而对不含有几丁质壁的生物没有作用，因此其对植物、牲畜及鱼类不表现出明显的毒性(Biochem Biophys Res Commun，1969，37：718-722)。多氧霉素包含A-N14种不同的同系物，不同的同系物作用于特异的对象，其中的polyoxin B和polyoxin L对梨黑斑病和由链格孢霉菌导致的苹果木栓样斑病具有良好的防治效果，而polyoxin D常用来防治由立枯丝核菌引起的水稻纹枯病。有效霉素(Validamycin A)是由Streptomyces hygroscopicus产生的一种氨基糖苷类抗生素，具有较强的内吸性，已被敏感菌体细胞吸收并在其内迅速传导。有效霉素能强烈抑制菌体细胞内海藻糖酶的活性，因此可导致某些种类菌体细胞的生长和发育受到抑制，而哺乳动物细胞的生长、发育并不依赖海藻糖的水解，故其对人类是安全的。实验证明，有效霉素对立枯丝核菌具有良好的抑制作用，而不能很好抑制其它种类的真菌和细菌的生长，因此在生产中，主要用来防治水稻纹枯病(Rev PlantProtec Res，1975，8：81-92)。有效霉素可以被土壤中假单孢菌属的一些细菌分解为葡萄糖和井冈胺(Journal of Antibiot，1975，28：298-306)，同时也可以被动物肠道内的一些细菌分解，从而排除体外，因此有效霉素被认为是比较理想的环境友好型杀菌剂。

由于农用抗生素在植物病菌防治方面的良好应用前景，我国在20世纪50年代，国家开始重视此类研究，20世纪70年代以后，随着经济的发展，国家的投入也大幅增长，农用抗生素的研制取得了较大的突破，目前我国研制成功并在生产中大规模推广应用的主要产品有井冈霉素、武夷霉素、庆丰霉素、多氧霉素、农抗120等品种。其中，商品化应用最为成功的是井冈霉素，近10年来，我国井冈霉素年产量不断增长，对我国的水稻生产做出了较大的贡献。

井冈霉素是上海农药所在中国井冈山地区土壤中分离得到的吸水链霉菌井冈变种(S.hygroscopicus var/jinggangensis yen)产生的一种氨基糖苷类抗生素，对水稻纹枯病防治效果极佳。井冈霉素具有较强的内吸性，能迅速被立枯丝核菌菌丝吸收并在体内传导，一般每667m²用药3-5g可达到较好的防治效果，并且如果用药时间恰当，整个水稻生育期用药一次就可达到防治效果。由于井冈霉素的作用机制并不是杀死病原菌，而只是影响病原菌的致病力，因此，到目前为止基本没有发现病原菌抗性的产生。武夷霉素是由中国农科院植物保护研究所从福建省武夷山地区分离的一株不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces hygroscopicus var wuyiens)代谢产物中分离得到的一类氨基糖苷类复合物。对革兰氏阴性菌和一些种类的病原真菌具有良好的抑制作用，尤其在蔬菜的真菌病害防治中效果突出。农抗120是刺孢吸水链霉菌北京变种(Streptomyces hygrospinosus var.beijingensis)产生的一类嘧啶核苷类抗菌素，这种抗菌素抗菌谱广，对多种作物病害，如枯萎病、纹枯病、白粉病等具有很好的防效。进入植物体内后，可以阻碍病原菌蛋白质的合成，达到抗病的效果。同时，它可以提高作物的抗病能力和免疫能力，可以有效地减少病害的发生。

随着人们环保意识的不断增强，农用抗生素的应用也越来越广泛，在目前的农用抗生素研究工作中，人们除了继续筛选新的种类的农用抗生素，利用物理化学方法对产生菌进行诱变，提高其发酵产量外，还利用现代分子生物学手段，在分子水平上对产生菌进行基因改造，提高其发酵水平，降低生产成本。

活体微生物杀菌剂的研制在过去取得了极大的进展，被用作研究的活体微生物既有细菌，也有真菌和放线菌。由于细菌的种类多，数量大，繁殖速度快，因此细菌微生物杀菌剂的研究具有广泛的前景。目前用于生防的细菌以芽孢杆菌为主，主要有枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌、巨大芽孢杆菌等(Biosci Bioeng，2000，89(6)：515-521)。芽孢杆菌在自然界中广泛存在，对人畜无害，不会污染环境，同时对多种植物病原菌具有抑制效果，因此是一种比较理想的生物制剂(Plant Dis Reptr，1970，54：446-448，Can Bot，1984，62：1032-1035；Plant Disease，1985，69：770-775)。国内研制成功并在生产中投入使用的有纹曲宁、百抗等。其中微生物农药百抗(10亿个/g活枯草芽孢杆菌可湿性粉剂)是由云南农业大学和中国农业大学共同研制，并获得农业部登记注册，目前已在多个省份推广使用，主要防治水稻纹枯病、烟草黑胫病，其抑菌机制主要是营养竞争作用。从苜蓿根际周围的分离得到的蜡质芽孢杆菌UQ85，对苜蓿猝倒病防效良好，经过田间试验证明，其对大多猝倒病和根腐病有良好的防效，现已被美国登记作为生物农药，用于种子的处理(FEMS Microbiolo Lett，1999，171：1-9)。

用于防治植物病害的真菌制剂不多，木霉菌(Trichoderma spp.)是目前研究和应用最广泛的一种植病生防制剂。例如哈茨木霉(T.harzianum)对立枯病、菌核病、腐霉病、灰霉病等多种植物病害有较好的防效(European J of PlantPatholo，1999，105：177-189)。链孢粘帚霉(Gliocladium catenulatum)主要用于防治土壤里的腐霉菌和丝核菌(J Phytopatholo，2001，149：171-178.)。目前，此类制剂商品化生产的较少，其应用有待于进一步的研究。

目前已发现的抗生素中，绝大部分是从放线菌中获得的，人们对其研究也较为深入。除了利用其代谢产物进行植物病害防治外，人们也推出了相应的放线菌活体生物杀菌剂，例如1989年Kemica开发的放线菌生物杀菌剂Streptomycesgriseovirdis，商品名为Mycostop，主要用于观赏植物和温室蔬菜上的镰刀菌。

20世纪末，随着海洋生物技术及先进采样手段的发展，人们陆陆续续从海洋中筛选到一些具有抗菌活性的新型化合物。从我国深圳近海红树林上分离获得了一株海洋真菌Hypoxylon oceanicum LL215G256，其代谢产物中存在一种脂肽类抗菌物质15G256γ，能够抑制真菌细胞壁的合成，并且其作用位点与一般脂肽不同，其对子囊菌纲、担子菌纲、半知菌纲的植物病原菌具有一定的抑制作用(JAntibiot(Tokyo)，1998，51(3)：317-322)。从海洋真菌Hypoxylon oceanicum的培养液中分离得到了3种新的脂肪缩酚肽LL-15G256、γ(8)、δ(9)、ε(10)，它们均具有良好的抗真菌活性(J Antibiot(Tokyo)，1998，51(3)：303-316)。从海洋真菌Fusarium sp.FH-146中分离得到含有吡喃酮环的3个新的聚酮化合物neofusapyrone、fusapyrone、deoxyfusapyrone，对Botrytis cinerea，Aspergillusparasiticus显示较强的抗真菌活性(J Antibiot(Tokyo)，2006，59(11)：704-709)。从Kuril colonial ascidium共生的海洋真菌Humicola fuscoatra(Traaen)KMM4629中获得了1个新的属于石竹烯系列的倍半萜烯fuscoatra A，它能够抑制葡萄球菌Staphylococcus aureus和杆状菌Bacillus subtilis的生长和繁殖(Russian ChemicalBulletin，International Edition，2004，53(11)：2643-2646.)。

中科院沈阳应用与生态研究所从海洋中分离得到一株Bacillus amyloliquefaciensSH-B10，利用酸沉淀和半制备HPLC从中分离得到两种抗真菌的脂肽类物质。通过Q-TOF质谱鉴定，两种脂肽均为C16fengycin A，这种抗菌物质是一种新类型的fengcin，在多肽链的6号位上含有一个氨基丁酸。通过琼脂扩散法生测显示，这两种脂肽对5种植物病原真菌Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum，Fusariumgraminearum，F.oxysporum f.sp.vasinfectum，F.oxysporum f.sp.cucumis melo L和F.graminearum f.sp.zea mays L具有显著的抑制效果(Bioresource Technology，2010，101：8822-8827)。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种抗水稻稻曲病的青霉菌，该青霉菌对水稻稻曲病菌具有拮抗作用。该青霉菌能抑制稻曲病菌孢子的萌发和菌丝生长，其发酵液对稻曲病具有较强的抑制活性。

本发明的另一个目的是在于提供了一种抗水稻稻曲病的青霉菌AF-25在制备防治或预防水稻稻曲病的生物农药中的应用，用该真菌的发酵液，能有效地抑制稻曲病菌孢子的萌发和菌丝生长。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

青霉菌属(Penicillium)真菌KF-25是一株由本实验室从中国土壤样品中分离、并以稻曲病菌为拮抗对象，采用琼脂扩散法中的牛津杯法(Appl MicrobiolBiotechnol，2010，86：535-543.)，经过观测抑菌圈而筛选出来的对水稻稻曲病菌具有明显抑制作用的真菌菌株。根据分离该菌株的土壤样品序列号，并加上抗真菌(Antifungus)的英文几简写AF，将该菌株命名为产黄青霉菌AF-25(Penicillium chrysogenum AF-25，CCTCC NO：M 2011309)，该菌株已保藏，保藏单位：中国典型微生物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2011年9月9日，保藏编号：CCTCC NO：M2011309，分类命名：产黄青霉AF-25Penicillium chrysogenum AF-25。基本的技术原理是：通过弹土法，在PDA培养基(马铃薯葡萄糖培养基)中分离土壤样品中的真菌，将这些分离的真菌接种在PS(马铃薯蔗糖培养液)中培养，28℃，180rpm，恒温振荡培养96h。收集发酵液，使用滤纸过滤去除菌丝，10000rpm，4℃离心20min；收集离心后上清液通过0.22μm滤膜过滤除菌，得到无菌上清液，4℃保存待用。取150μl稻曲病菌分生孢子悬液均匀涂布在PSA(马铃薯蔗糖培养基)平板(60mm)表面，在每个平板中央轻轻放置1个无菌牛津杯(6mm×8mm×10mm)，待牛津杯自然沉降10分钟后，往每个牛津杯中加入200μl上述所制备的无菌上清液样品，然后将平板置入培养箱中，28℃，黑暗培养7d后，测量各个样品的抑菌圈直径。筛选到对稻曲病菌抑制效果最好的真菌菌株AF-25。

一种抗水稻稻曲病的青霉菌的制备方法，其步骤是：

A、稻曲病菌分离：从海南省水稻田中采取患稻曲病的水稻病穗，采用厚垣孢子悬液法分离稻曲病菌。所用的培养基为含氯霉素(50μg/ml)的胁本哲式培养基(马铃薯300g、蛋白胨5g、蔗糖15g、Ca(NO₃)₂·4H₂O 0.5g、Na₂HPO₄·12H₂O2.0g、琼脂16g、蒸馏水1000ml)。具体操作步骤：用75％(质量/体积)乙醇将稻曲球消毒5-10s，用无菌水冲洗2-5次，然后置于离心管中加入无菌水振荡配置成厚垣孢子悬浮液，取100μl滴加在无菌培养皿中，待培养基冷却至44-46℃时，每100ml培养基中加入5mg氯霉素，然后倒入培养皿中，轻轻摇动使之与孢子悬浮液混合均匀。待培养基凝固后置于28℃恒温箱中，黑暗条件下培养，逐日观察分离结果。将分离的稻曲病菌接种到马铃薯蔗糖培养液(PS)中，28℃，180rpm振荡培养5天后，培养液中即可产生大量分生孢子。用2层纱布过滤去除菌丝，将过滤液5000rpm离心15min，沉淀物即为稻曲病菌分生孢子，使用无菌水洗涤分生孢子3遍，最终溶解在无菌水中，利用稀释平板计数法，调节其终浓度为10⁸孢子/ml，4℃保存待用。该马铃薯蔗糖培养液(PS)的组成为：20％马铃薯煮汁(重量/体积)，2％蔗糖(重量/体积)，pH 6.0。

B、稻曲病菌拈抗菌分离与培养：将土壤样品碾细，大约5克样品置于无菌培养皿中，倒入33-37℃的PDA培养基，在28℃下培养5-7天，分离真菌单菌落。该PDA培养基的组成为：20％马铃薯煮汁(重量/体积)，2％葡萄糖(重量/体积)，pH 6.0。将分离的真菌菌株接种在PS(马铃薯蔗糖培养液)中，28℃，180rpm，恒温振荡培养96h。收集发酵液，使用滤纸过滤去除菌丝，10000rpm，4℃离心20min；收集离心后上清液通过0.22μm滤膜过滤除菌，得到无菌上清液，4℃保存待用。该PS培养基的组成为：20％马铃薯煮汁(重量/体积)，2％蔗糖(重量/体积)，pH 6.0。

C、稻曲病菌拈抗菌筛选：取150μl稻曲病菌分生孢子悬液均匀涂布在PSA(马铃薯蔗糖培养基)平板(60mm)表面，在每个平板中央轻轻放置1个无菌牛津杯(6mm×8mm×10mm)，待牛津杯自然沉降10分钟后，往每个牛津杯中加入200μl上述所制备的无菌上清液样品，然后将平板置入培养箱中，28℃，黑暗培养7d后，测量各个样品的抑菌圈直径，筛选到对稻曲病菌抑制效果最好的真菌菌株，根据分离该菌株的土壤样品序列号，并加上抗真菌(Antifungus)的英文几简写AF，将该菌株命名为产黄青霉菌AF-25(Penicillium chrysogenum AF-25，CCTCC NO：M 2011309)。该PSA培养基组成为：20％马铃薯煮汁(重量/体积)，2％蔗糖(重量/体积)，1.5％琼脂(重量/体积)，pH 6.0。获得了一种抗水稻稻曲病的青霉菌AF-25。

一种青霉菌AF-25在制备防治或预防稻曲病生物农药中的应用，其应用基本过程是：

分别在PSA培养基加入2ml，1ml，0.5ml，0.33ml，0.25ml，0.2ml青霉菌AF-25无菌上清液，定容至20ml，倒入无菌培养皿中，分别制成稀释10，20，40，60，80，100倍的平板。每个平板中央接入1片直径为8mm的稻曲病菌菌落圆片，每种稀释度重复3个平板，以没有加入无菌上清液的PSA平板作为对照。将平板置于28℃恒温培养箱中，黑暗培养，分别于3d，4d，5d，7d测量各平板菌落直径大小。

挑取培养7d后无任何生长的稻曲病菌菌落，转接到未加入拮抗菌上清液的平板中，28℃培养5d，观察其生长状况，判断菌丝是否已死亡或者仅仅被抑制生长(Biological Control，2008，44：24-31)。菌丝的生长抑制率采用如下公式计算：生长抑制率＝1-(处理菌落直径-8)/(对照菌落直径-8)×100％。

产黄青霉AF-25发酵上清液的实验浓度分别为原液、10倍稀释液，利用牛津杯法测定对意大利青霉(Pencillium italicum)，指状青霉(Pencilliumdigitacum)，棉花枯萎病菌(Fusarium oxyporium f.sp.Vasinfectum)，棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)，小麦赤霉菌(Fusarium graminearum)，水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)，胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)等植物病原菌的抑制作用。其中病原真菌以马铃薯葡萄糖培养基为生测平板，胡萝卜软腐欧文氏菌采用牛肉膏蛋白胨培养基进行生测。

发明优点和效果：

产黄青霉AF-25发酵液对稻曲病菌具有较强的抑制活性，且具有较好的贮存稳定性、酸碱和温度耐受性，动物毒性实验表明，该菌发酵液对实验大鼠不具有明显毒性，属于微毒级，因此该菌株可以用于生产防治水稻稻曲病的微生物杀菌剂，从而达到有效防治水稻稻曲病，减少化学农药对环境的污染，保证水稻稳产高产的目的，因此该菌株具有良好的应用前景。

(1)KF-25发酵液对稻曲病菌菌丝生长的抑制作用

在含有不同稀释倍数发酵上清液的PSA平板上，稻曲病菌菌丝的生长受到不同程度的抑制，随着稀释倍数的增大，抑制菌丝生长的效果越来越差，在稀释100倍的PSA平板上，培养到第5天时，菌落的直径大小与对照菌落(在不含KF-25发酵上清液的PSA平板上生长的菌落)相等。在发酵上清液10倍稀释的PSA平板上接种稻曲病菌落圆片后，一直培养到第7天，菌落直径仍为8mm，说明该菌落菌丝没有任何生长。为了判断该平板上稻曲病菌菌丝不生长的原因是因为其生长受到抑制或者菌丝已死亡，将其转移到不含发酵上清液的PSA培养基上继续培养，经过5天培养后，仍未见菌丝的生长，可初步判断菌丝已被发酵上清液中的活性物质杀死。

(2)KF-25抗菌谱：

KF-25发酵上清液原液和10倍稀释液对意大利青霉，指状青霉，棉花枯萎病菌，棉花黄萎病菌，小麦赤霉菌，胡萝卜软腐欧文氏菌，水稻纹枯病菌均不具有抑制活性，说明该拮抗菌的抑菌谱较窄，专一性强。

具体实施方式

实施例1：

一种对水稻稻曲病菌具有拮抗作用的青霉菌的分离、筛选，其步骤如下：

a、将土壤样品碾细，大约5克样品置于无菌培养皿中，倒入33或34或35或36或37℃的PDA培养基，在28℃下培养7天，分离真菌单菌落。该PDA培养基的组成为：20％马铃薯煮汁(重量/体积)，2％葡萄糖(重量/体积)，pH6.0。将分离的真菌菌株接种在PS(马铃薯蔗糖培养液)中，28℃，180rpm，恒温振荡培养96h。收集发酵液，使用滤纸过滤去除菌丝，10000rpm，4℃离心20min；收集离心后上清液通过0.22μm滤膜过滤除菌，得到无菌上清液，4℃保存待用。该PS培养基的组成为：20％马铃薯煮汁(重量/体积)，2％蔗糖(重量/体积)，pH 6.0。

b.取150μl稻曲病菌分生孢子悬液均匀涂布在PSA(马铃薯蔗糖培养基)平板(60mm)表面，在每个平板中央轻轻放置1个无菌牛津杯(6mm×8mm×10mm)，待牛津杯自然沉降10分钟后，往每个牛津杯中加入200μl上述所制备的无菌上清液样品，然后将平板置入培养箱中，28℃，黑暗培养7d后，测量各个样品的抑菌圈直径，筛选到对稻曲病菌抑制效果最好的真菌菌株，其发酵液上清液稀释100倍，抑菌圈直径可达21.3mm。根据分离该菌株的土壤样品序列号，并加上抗真菌(Antifungus)的英文几简写AF，将该菌株命名为产黄青霉菌AF-25(Penicillium chrysogenum AF-25，CCTCC NO：M 2011309)该PSA培养基组成为：20％马铃薯煮汁(重量/体积)，2％蔗糖(重量/体积)，1.5％琼脂(重量/体积)，pH 6.0。

一种对水稻稻曲病菌具有拮抗作用的青霉菌Penicillium chrysogenum AF-25，CCTCC NO：M 2011309的鉴定：

a.一种青霉菌AF-25的培养特征和形态学特性：

在PSA培养基上，菌株AF-25生长速度较快，经过3天培养后，菌落呈絮状，菌丝致密，呈灰绿色，具有辐射状沟纹，边缘为一圈白色菌丝。菌落表面有淡黄色液滴渗出，菌落反面呈黄色，并有水溶性黄色素扩散至周围培养基中。KF-25的菌丝光滑，有横隔，部分气生菌丝特化成孢子丝，分生孢子梗顶端着生一串链状排列的分生孢子，由分生孢子梗、小梗、分生孢子等构成分生孢子穗，呈扫帚状，分生孢子外壁光滑，呈圆球形至椭球形。

b.一种青霉菌AF-25的分子生物学鉴定：

以AF-25的基因组DNA为模板，利用真菌18S rDNA的通用引物(NS1：5-GTATCATATGCTTGTCTC-3，NS8：5-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3)(内蒙古农业大学学报，2003，24(4)：41-44)，采用PCR技术按下列程序进行AF-25的18S rDNA扩增：94℃变性5分钟，然后94℃30秒，50℃1分30秒，72℃2分钟，35个循环；最后72℃延伸7分钟。PCR产物经过1％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳，用DNA胶回收试剂盒进行回收，回收的PCR产物由InvitrogenBiotechnology Co.，Ltd.测序。得到的AF-25的18S rDNA部分序列为SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。

该SEQ ID NO.1序列经NCBI BLAST生物学软件比对分析表明，AF-25的18SrDNA与青霉菌Penicillium chrysogenum strain KCTC6052的18S rDNA相似性最高，达99％。

综合拮抗菌AF-25的菌落形态特征、菌丝和孢子的显微结构及18S rDNA序列分析结果，AF-25属于产黄青霉(Penicillium chrysogenum)。

培养温度对拈抗菌AF-25抑菌活性的影响：

以PS培养液为发酵培养基，接种相同量的P.chrysogenum AF-25分生孢子悬液，不同培养温度对AF-25产生抑菌活性物质有较大影响。28℃培养时，48h内可以检测到抑菌活性的产生，培养到96h时抑菌活性最强，发酵上清液稀释10倍后抑菌圈直径可达40.7mm，此后培养到120h活性显著下降。在25℃和30℃培养条件下，分别在72h，96h内可检测到抑菌活性物质的产生，均在培养到96h发酵上清液抑菌活性达到最大值，10倍稀释液对稻曲病菌抑菌活性分别为24.7mm，17.2mm，此后继续培养至120h，抑菌活性略有下降。由以上结果可知，在以PS培养液为发酵培养基时，选用28℃进行发酵培养比较适宜。

AF-25发酵液贮存稳定性：

在贮存温度为4℃或-20℃时，AF-25发酵液的稳定性较好，存放4个月的AF-25发酵液抑菌活性基本没有变化，到第5，6个月，抑菌活性均有下降，但抑菌圈直径仍可达到29.5mm、31.7mm。由此可见，在低温(0或1或2或3或4或5或6或7℃)条件下，发酵上清液贮存稳定性较好。

温度对AF-25发酵液抑菌活性影响：

采用琼脂扩散法测定AF-25发酵上清液的热稳定性。60℃处理发酵上清液1h后，其抑菌活性基本没有变化，80℃处理1h其抑菌活性稍有下降，但抑菌圈直径仍可达31.5mm，而90℃、100℃处理1h或者121℃处理20min后，其抑菌活性完全丧失。由此可知，上清液中的抑菌活性物质在80℃处理后，仍能保持较强的抑菌活性，说明其结构比较稳定，能够耐受一定的高温。而在90℃或更高温度处理1h后，再恢复到室温(20-25℃)，其抑菌活性完全丧失，说明其结构遭到不可逆的破坏。

pH对AF-25发酵液抑菌活性影响：

使用酸碱调节AF-25发酵上清液的pH至设定值后，室温(20-25℃)放置2h，再调回到原pH，然后分别测定各处理抑菌活性的变化。在pH 3或5或7或9的范围内，上清液均保持较高的抑菌活性，pH值为11时活性有所下降，但抑菌圈直径仍可达28.8mm。将上清液pH调至1或者13时，其抑菌活性完全丧失。由此说明，过酸或过碱的条件下，上清液中抑菌活性成分的结构遭到严重破坏，导致其抑菌活性完全丧失。

金属离子对AF-25发酵液抑菌活性影响：

用浓度为200mM的Mg²⁺，Ca²⁺，Zn²⁺，Fe²⁺，K⁺，Na⁺处理AF-25发酵上清液，生物测定结果表明，AF-25发酵上清液中的活性成分对上述六种金属离子不敏感，与对照相比，其抑菌活性没有明显变化。

蛋白酶对AF-25发酵液抑菌活性影响：

使用100μg/ml的蛋白酶K于55℃水浴中处理AF-25的发酵上清液2h后，对照和处理样品产生的抑菌圈直径均为24.7mm，说明上清液中的抑菌活性成分对蛋白酶K不敏感。分别使用20mg/ml的胰蛋白酶和胃蛋白酶，37℃水浴处理上清液2h后，对照样品的抑菌圈直径为25.7mm，而处理样品抑菌活性完全丧失。胰蛋白酶能选择性地水解由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，而胃蛋白酶倾向于剪切氨基端或羧基端为芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)或亮氨酸的肽键。结果说明，上清液中的抑菌活性成分结构中含有相应的肽键，胰蛋白酶和胃蛋白酶能破坏其结构，导致其抑菌活性完全丧失。

表1胰蛋白酶和胃蛋白酶处理对发酵上清液活性影响

注：数据后标示不同字母代表各处理间具有显著性差异(P≤0.05)。

拈抗菌AF-25发酵液的急性毒性检测：

如表2所示，对Wistar雌雄性大鼠灌胃染毒后，未见明显中毒反应症状，在14天观察期内无动物死亡，实验结束后处死未死动物后大体解剖物明显异常反应，大鼠急性经口LD50＞5000mg/kg体重，根据国家《农药等级毒理学试验方法》(GB15670-1995)，KF-25发酵上清液属于微毒级(农药急性毒性最低等级)。

表2AF-25发酵上清液大鼠急性毒性实验结果

SEQUENCE LISTING

<110>  中国科学院武汉病毒研究所

<120>  一种抗水稻稻曲病的青霉菌及应用

<130>  一种抗水稻稻曲病的青霉菌及应用

<160>  1    

<170>  PatentIn version 3.1

<210>  1

<211>  1693

<212>  DNA

<213>  青霉菌

<400>  1

ggtctaagta taagcaactt gtactgtgaa actgcgaatg gctcattaaa tcagttatcg     60

tttatttgat agtaccttac tacatggata cctgtggtaa ttctagagct aatacatgct    120

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tgggattggc ttaggagggt tggcaacgac cccccagagc cgaaaacttg gtcaaactcg   1680

gtcatttaga gga                                                      1693

 

Claims (2)

1.一种青霉菌（Penicillium chrysogenum）AF-25，其特征在于：该菌株保藏号为CCTCC NO：M2011309。

2.权利要求1所述的青霉菌AF-25在制备防治或预防水稻稻曲病的生物农药中的应用。