CN115287371B

CN115287371B - 一种检测产黄青霉菌基因组dna的方法

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Publication number: CN115287371B
Application number: CN202210138666.8A
Authority: CN
Inventors: 许明哲; 王琰; 宗伟英; 吴晓双; 李进; 张培培; 姚尚辰; 尹利辉; 王兰; 朱伟宏; 吴怡
Original assignee: Huzhou Shenke Biotechnology Co ltd; National Institutes for Food and Drug Control
Current assignee: Huzhou Shenke Biotechnology Co ltd; National Institutes for Food and Drug Control
Priority date: 2022-02-15
Filing date: 2022-02-15
Publication date: 2023-12-01
Anticipated expiration: 2042-02-15
Also published as: CN115287371A

Abstract

本发明提供了检测产黄青霉菌基因组DNA的引物对、包含本发明引物对的检测试剂或试剂盒以及利用所述引物对检测产黄青霉菌基因组DNA的方法，所述引物对特异性结合于SEQ ID NO:1所示序列。利用所述引物对的PCR检测方法操作简便快捷、灵敏度高、能区分CHO细胞、Vero细胞、大肠杆菌、毕赤酵母、293T细胞、NS0细胞、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌以及铜绿假单胞菌等干扰性DNA。

Description

一种检测产黄青霉菌基因组DNA的方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域。具体地说，本发明涉及产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)DNA的检测引物及检测方法。

背景技术

抗生素是由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。现临床常用的抗生素有微生物培养液中提取物以及用化学方法合成或半合成的化合物，目前已知天然抗生素不下万种。

β-内酰胺类抗生素是现有的抗生素中临床应用最多、最广泛的一类，用于革兰阳性菌、革兰阴性球菌等所致的多种感染治疗，最常用为青霉素类，是临床中最重要的一类抗菌药物，在世界抗生素市场上占据主导地位。

青霉素类抗生素主要通过微生物发酵而成，生产过程涉及到工业微生物，其质量控制需要考虑来自于宿主菌来源的生物杂质。与采用工程化细胞生产抗体、疫苗等生物制剂相比，发酵类抗生素也会面临类似的宿主细胞来源DNA残留所带来的潜在风险。产黄青霉菌是一种广泛存在于自然界中的霉菌，是通过发酵大量生产青霉素的重要工业菌种。

理论上，存在于抗生素中的微量DNA杂质，都有可能传递与肿瘤或病毒相关的基因，并导致癌变或其它病理变化。当一定量的残留DNA与制品一同进入人体后，含有致癌基因的DNA片段就可能诱发肿瘤的产生；如果抗生素中含有某些可以整合病毒的DNA，则这种DNA通过表达后具备感染性，从而导致一系列的不良后果。因此检测宿主细胞残留DNA的含量关系到抗生素的质量与纯度，是产品质量的一个重要指标，更是一个安全性问题。世界各国及国际组织对生物制品的宿主细胞来源的残留物有限量要求，其检测方法的法规标准也在逐步完善。

新颁布的2020版《中国药典》中，针对不同品种的生物制剂中残留宿主DNA 的限量要求为100pg～10ng/剂，EP、USP以及WHO也都对采用细胞生产的生物制剂中宿主残留物检测技术和限量标准作出明确规定。此外，rHCD的限量和风险与给药方式密切相关，静脉注射剂的限量标准最高，限值为100pg/剂。

关于宿主细胞残余DNA的限量检测，过去比较普遍的采用分子杂交的半定量方法。该方法基于传统的分子基因杂交技术，需要的检测条件相对简单，检测限在 10pg左右基本能够满足一些疫苗和治疗性生物制品的检测需求。但由于该方法存在时间长、操作繁琐、稳定性、敏感性、特异性较差等缺点，已经不能满足日益严苛的检测要求，在一些发达国家已经淘汰。

荧光探针检测属于实时定量PCR技术，是一种快速的高通量检测方法，它在 PCR扩增过程中加入一个特异性的荧光探针，通过荧光信号的变化反映产物的增加情况，从而能够定量分析样本中的初始模板。近年来，由于荧光探针技术在特异性、灵敏性、准确性方面的独特优势，其在检测基因突变、基因定量等疾病相关检测领域得到广泛的承认及应用。然而，该方法仍然存在样本需要预处理、各实验室引物探针设计不同、没有统一标准物质等等问题，对以上问题仍需要进一步研究、解决。

综上所述，本领域急需检测抗生素中产黄青霉菌DNA的方法，该方法应具备特异性、灵敏性、操作简便、标准统一等优点，从而能用于抗生素质量控制或溯源分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种高灵敏度，并能区分产黄青霉菌DNA与其它真核宿主细胞DNA的检测产黄青霉菌基因组DNA的引物对，以及包含所述引物对的检测试剂或PCR试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种利用本发明提供的引物对或检测试剂检测产黄青霉菌基因组DNA的方法或PCR方法。

在第一方面，本发明提供一种检测产黄青霉菌基因组DNA的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物和反向引物结合于产黄青霉菌基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列。

在具体的实施方式中，所述正向引物结合于产黄青霉菌基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第522-1600位，优选第1582-1600位；其中的反向引物结合于产黄青霉菌基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第653-1683位，优选第1664-1683位；并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为100-155bp。

在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为18-25bp；优选20bp。

在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为58-59℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤1℃。

在具体的实施方式中，所述引物对中，所述正向引物如SEQ ID NO:2所示，所述反向引物如SEQ ID NO:3所示；或者，

所述正向引物如SEQ ID NO:6所示，所述反向引物如SEQ ID NO:7所示；或者，

所述正向引物如SEQ ID NO:10所示，所述反向引物如SEQ ID NO:11所示；

优选地，所述正向引物如SEQ ID NO:2所示，所述反向引物如SEQ ID NO:3 所示。

在第二方面，本发明提供一种检测试剂，所述检测试剂包含第一方面所述的引物对。

在具体的实施方式中，所述检测试剂还包含探针。

在优选的实施方式中，所述探针如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO: 12或所示。

在具体的实施方式中，所述检测试剂包含的引物对中，所述正向引物如SEQ IDNO:2所示，所述反向引物如SEQ ID NO:3所示，所述探针如SEQ ID NO:4所示；或者，

所述正向引物如SEQ ID NO:6所示，所述反向引物如SEQ ID NO:7所示，所述探针如SEQ ID NO:8所示；或者

所述正向引物如SEQ ID NO:10所示，所述反向引物如SEQ ID NO:11所示，所述探针如SEQ ID NO:12所示。

在优选的实施方式中，所述检测试剂的检测灵敏度为0.3fg/μl。

在第三方面，本发明提供一种检测产黄青霉菌基因组DNA的方法，所述方法包括：利用第一方面所述的引物对或第二方面所述的检测试剂，对待测样品进行 PCR，并检测PCR扩增产物。

在第四方面，本发明提供一种PCR试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于所述容器中的第一方面所述的引物对。

在优选的实施方式中，所述引物对中，所述正向引物如SEQ ID NO:2所示，所述反向引物如SEQ ID NO:3所示；或者，

在优选的实施方式中，所述试剂盒中还装有探针。

在优选的实施方式中，所述引物对中的正向引物如SEQ ID NO:2所示，反向引物如SEQ ID NO:3所示，所述探针如SEQ ID NO:4所示；或者，

所述正向引物如SEQ ID NO:10所示，所述反向引物如SEQ ID NO:11所示，所述探针如SEQ ID NO:12所示；

优选地，所述引物对中的正向引物如SEQ ID NO:2所示，反向引物如SEQ ID NO:3所示，所述探针如SEQ ID NO:4所示。

在优选的实施方式中，所述试剂盒中还装有标准品对照。

在第五方面，本发明提供一种PCR方法，包括步骤：

在一PCR检测体系中，利用第一方面所述的引物对扩增目标产物。

在优选的实施方式中，所述PCR检测体系还包括探针。

在优选的实施方式中，所述引物对中的正向引物如SEQ ID NO:2所示，反向引物如SEQ ID NO:3所示，而所述探针如SEQ ID NO:4所示；或者，

在第六方面，本发明提供第一方面所述的引物对或第二方面所述的检测试剂的用途，用于检测待测对象中是否存在产黄青霉菌DNA。

在优选的实施方式中，所述待测对象是抗生素制品。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1-图3显示了各引物对的参数信息。

图4显示了参考品的扩增曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:2和3所示。

图5显示了参考品的标准曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:2和3所示。

图6显示了参考品的扩增曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:6和7所示。

图7显示了参考品的标准曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:6和7所示。

图8显示了参考品的扩增曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:10和11所示。

图9显示了参考品的标准曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:10和11所示。

图10显示了灵敏度测试的扩增曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:2和3所示。

图11显示了定量限测试的扩增曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:2和3所示。

图12显示了干扰实验参考品的扩增曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:2 和3所示。

图13显示了干扰实验CHO细胞、Vero细胞、毕赤酵母、大肠杆菌、293T细胞、 NS0细胞的扩增曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:2和3所示。

图14显示了干扰实验参考品的扩增曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:2 和3所示。

图15显示了白色念珠菌、金黄色葡萄球菌以及铜绿假单胞菌的扩增曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:2和3所示。

具体实施方式

经过深入而广泛的研究，本发明人出乎意料地发现针对产黄青霉菌基因组 DNA的SEQ ID NO:1所示区段设计的引物，不仅能够高度灵敏地检测产黄青霉菌基因组DNA，还能区分CHO细胞、Vero细胞、毕赤酵母、大肠杆菌、293T细胞、 NS0细胞、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌以及铜绿假单胞菌等干扰性DNA。本发明方法操作简便快捷、特异性和灵敏性高。在此基础上完成了本发明。

本发明的引物对

本文所用的术语“引物”具有本领域技术人员常规理解的意义。本发明的产黄青霉菌基因组DNA特异性引物不是针对外源基因本身或病毒载体本身设计，而是针对产黄青霉菌基因组DNA上SEQ ID NO:1所示区段设计的。换言之，本发明的引物可以特异性结合于产黄青霉菌基因组DNA上SEQ ID NO:1所示区段。

鉴于本发明的教导和本领域的公知常识，本领域技术人员应该理解，针对SEQ IDNO:1所示区段可以设计多种引物对。因此，本发明的引物对不限于实施例中具体得到的引物对。

在具体的实施方式中，本发明的正向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第 522-1600位，优选第1582-1600位；其中的反向引物结合于产黄青霉菌基因组DNA 上SEQ ID NO:1所示序列的第653-1683位，优选第1664-1683位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为100-155bp。

在具体的实施方式中，本发明的引物对中，所述正向引物如SEQ ID NO:2所示，所述反向引物如SEQ ID NO:3所示；或者，

所述正向引物如SEQ ID NO:10所示，所述反向引物如SEQ ID NO:11所示。

在最优选的实施方式中，本发明的正向引物如SEQ ID NO:2所示，反向引物如SEQID NO:3所示。

探针

本文所用的术语“引物”具有本领域技术人员常规理解的意义，即，一小段单链DNA或者RNA片段，用于检测与其互补的核酸序列。

鉴于本发明的教导和本领域的公知常识，本领域技术人员应该理解，在知晓引物对的前提下，本领域技术人员可以根据正向引物和反向引物结合位点之间的模板序列自主设计探针，并检测该探针与引物对的技术效果。在具体的实施方式中，本领域普通技术人员可根据需要具体设计探针，所述探针可以处于液相中，也可以固定于固相上；可以在扩增前结合，也可以在扩增后结合。因此，本发明的探针并不限于实施例中具体公开的探针。本发明的引物对也不限于与实施例中具体公开的探针配对使用。

在具体的实施方式中，本发明的探针如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:12所示。

本发明的检测试剂

本发明还提供一种检测产黄青霉菌基因组DNA的检测试剂，所述检测试剂包含本发明的引物对以及探针等实施PCR所需的其它成分，例如Taq酶、dNTP、Mg²⁺等等。

在具体的实施方式中，本发明的检测试剂包含SEQ ID NO:2所示正向引物、 SEQID NO:3所示反向引物、SEQ ID NO:4所示探针；或者，SEQ ID NO:6所示正向引物、SEQ IDNO:7所示反向引物、SEQ ID NO:8所示探针；或者，SEQ ID NO:10所示正向引物、SEQ ID NO:11所示反向引物、SEQ ID NO:12所示探针。

在优选的实施方式中，本发明的检测试剂包含SEQ ID NO:2所示正向引物、 SEQID NO:3所示反向引物、SEQ ID NO:4所示探针。

在具体的实施方式中，本发明检测试剂的检测灵敏度达到0.3fg/μL。

在本发明的引物对或检测试剂的基础上，本发明进一步提供一种检测产黄青霉菌基因组DNA的方法，所述方法包括：利用本发明的引物对或检测试剂，对待测样品进行PCR，并检测PCR扩增产物。

在本发明的引物对的基础上，本发明还提供一种PCR试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于所述容器中的上述本发明引物对。

在具体的实施方式中，本发明的PCR试剂盒还装有用于实施PCR的其它所需成分以及使用该试剂盒作PCR检测的使用说明书。在优选的实施方式中，所述试剂盒中还装有标准品对照。

在本发明的引物对的基础上，本发明提供利用本发明的引物对扩增目标产物的PCR方法。

本发明的优点包括:

1.本发明的引物对或检测试剂能够高度灵敏地检测产黄青霉菌基因组DNA；

2.本发明的引物对或检测试剂能够区分CHO细胞、Vero细胞、毕赤酵母、大肠杆菌、293T细胞、NS0细胞、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌以及铜绿假单胞菌等干扰性DNA；

4.本发明的检测方法操作简便快捷、特异性和灵敏性高。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

材料与方法

1.DNA检测体系：

2×Taqman mix：含有Taq酶、dNTP、Mg²⁺、本发明引物及探针等成分。

掺加标准品，阴性质控，DNA稀释液

2.检测仪器：博日FQD-96A，BIO-RAD CFX96。

3.检测过程

准备工作：

将购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心的产黄青霉菌用基因组提取试剂盒提取，制成产黄青霉菌基因组DNA(30ng/μL)做为参考品。用DNA稀释液将产黄青霉菌基因组DNA参考品梯度稀释成以下6个浓度梯度，分别为300pg/μL、30pg/μL、 3pg/μL、300fg/μL、30fg/μL、3fg/μL。NTC为无样本阴性质控(DNA稀释液)。

检测体系：

20μL荧光探针mix+10μL样品＝30μL

检测程序

实时荧光定量PCR反应程序优选为：95℃预变性10min；95℃15s，60℃1min， 40个循环。

实施例1.本发明引物对的设计及其标曲参数验证

发明人根据SEQ ID NO:1所示序列，设计了以下引物对和探针：

正向引物1：CAGCTCGTGCCGATTACGT(SEQ ID NO:2)；

反向引物1：GCCAACCCTCCTAAGCCAAT(SEQ ID NO:3)；

探针1：CCCTTTGTACACACCGCCCGTCG(SEQ ID NO:4)；

扩增产物：

CAGCTCGTGCCGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACT ACCGATTGAATGGCTCAGTGAGGCCTTGGGATTGGCTTAGGAGGGTTGGC(SEQ ID NO:5)。

发明人通过QPCR实验检验了上述引物对的性能，其中，

QPCR体系为：18.2μL mix+0.6μL正向引物+0.6μL反向引物+0.6μL探针 1+10μLDNA；

QPCR标准曲线为：产黄青霉菌DNA标准品浓度为300pg/μL、30pg/μL、3pg/μL、300fg/μL、30fg/μL、3fg/μL。

实验结果如图4和图5所示。其中图4是参考品扩增曲线，扩增曲线显示出明显的指数增长期。图5是参考品标准曲线。由图5可知，当参考品浓度为300pg/μL、 30pg/μL、3pg/μL、300fg/μL、30fg/μL、3fg/μL时，绘制得到的标准曲线斜率为-3.49，相关系数(R²)＝1.000，扩增效率为93.6％。该引物对检测体系标准曲线参数均能符合2020年版《中国药典》3407章节qPCR法的要求。

实施例2.本发明引物对的设计及其标曲参数验证

发明人根据SEQ ID NO:1所示序列，设计了以下引物对和探针：

正向引物2：GGAACAATTGGAGGGCAAGTC(SEQ ID NO:6)；

反向引物2：GTCCAGCCGGACCAGTACTC(SEQ ID NO:7)；

探针2：CCAGCAGCCGCGGTAATTCCAG(SEQ ID NO:8)；

扩增产物：

GGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTC CAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGTCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGAGTACTGGTCCGGCTGGAC(SEQ ID NO:9)。

发明人通过QPCR实验检验了上述引物对的性能，其中，

QPCR体系为：18.2μL mix+0.6μL正向引物+0.6μL反向引物+0.6μL探针 +10μLDNA；

实验结果如图6和图7所示。其中图6是参考品扩增曲线，扩增曲线显示出明显的指数增长期。图7是参考品标准曲线。由图7可知，当参考品浓度为300pg/μL、 30pg/μL、3pg/μL、300fg/μL、30fg/μL、3fg/μL时，绘制得到的标准曲线斜率为-3.5，相关系数(R²)＝1.000，扩增效率为92.98％。该引物对检测体系标准曲线参数均能符合2020年版《中国药典》3407章节qPCR法的要求。

实施例3.本发明引物对的设计及其标曲参数验证

发明人根据SEQ ID NO:1所示序列，设计了以下引物对和探针：

正向引物3：GTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATA(SEQ ID NO:10)；

反向引物3：AGCCGATAGTCCCCCTAAGAAG(SEQ ID NO:11)；

探针3：CGAACGAGACCTCGGCCCTTAAATAGC(SEQ ID NO:12)；

扩增产物：

GTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTCGGCCCTTAAATAG CCCGGTCCGCATTTGCGGGCCGCTGGCTTCTTAGGGGGACTATCGGCT(SEQ ID NO:13)。

发明人通过QPCR实验检验了上述引物对的性能，其中，

QPCR体系为：18.2μL mix+0.6μL正向引物+0.6μL反向引物+0.6μL探针+ 10μLDNA；

实验结果如图8和图9所示。其中图8是参考品扩增曲线，扩增曲线显示出明显的指数增长期。图9是参考品标准曲线。由图9可知，当参考品浓度为300pg/μL、 30pg/μL、3pg/μL、300fg/μL、30fg/μL、3fg/μL时，绘制得到的标准曲线斜率为-3.61，相关系数(R²)＝0.999，扩增效率为89.27％。该引物对检测体系标准曲线参数均能符合2020年版《中国药典》3407章节qPCR法的要求。

实施例4.本发明引物对的灵敏度验证

用DNA稀释液将产黄青霉菌DNA梯度稀释成浓度为300pg/μL、30pg/μL、 3pg/μL、300fg/μL、30fg/μL、3fg/μL、0.3fg/μL七个浓度梯度，其中300pg/μL、30pg/μL、 3pg/μL、300fg/μL、30fg/μL、3fg/μL作为标准曲线浓度，0.3fg/μL作为灵敏度验证浓度。

QPCR体系为：18.2μL mix+0.6μL正向引物1+0.6μL反向引物1+0.6μL探针 1+10μLDNA；

实验结果如图10所示，该引物对检测体系灵敏度能达到0.3fg/μL。

实施例5.本发明引物对的定量限验证

用DNA稀释液将产黄青霉菌DNA梯度稀释成浓度为300pg/μL、30pg/μL、 3pg/μL、300fg/μL、30fg/μL、3fg/μL六个浓度梯度，其中300pg/μL、30pg/μL、3pg/μL、 300fg/μL、30fg/μL、3fg/μL作为标准曲线浓度，3fg/μL作为灵敏度验证浓度。

实验结果如图11所示，该引物对检测体系定量限能达到3fg/μL。

实施例6.本发明引物对的特异性验证

干扰实验：

步骤：

用DNA稀释液将产黄青霉菌DNA梯度稀释成浓度为300pg/μL、30pg/μL、 3pg/μL、300fg/μL、30fg/μL、3fg/μL六个浓度梯度。将CHO细胞、Vero细胞、毕赤酵母、大肠杆菌、293T细胞、NS0细胞、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌以及铜绿假单胞菌九种干扰DNA稀释成浓度为300pg/μL。(CHO、Vero、293T细胞来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；毕赤酵母来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心；大肠杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌来源于中国医学微生物菌种保藏管理中心；NS0细胞来源于美国典型菌种保藏中心，用基因组提取试剂盒提取)。

QPCR体系：

18.2μL mix+0.6μL正向引物1+0.6μL反向引物1+0.6μL探针1+10μL CHO 细胞/Vero细胞/毕赤酵母/大肠杆菌/293T细胞/NS0细胞DNA

实验结果如下表及图12-图15所示，本发明引物对的检测体系检测3ng CHO细胞、Vero细胞、毕赤酵母、大肠杆菌、293T细胞、NS0细胞、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌以及铜绿假单胞菌的Ct值均大于35，显示上述干扰DNA对引物对的检测结果明显没有造成影响。该引物对具备优异的特异性。

干扰物种DNA	Ct均值
		CHO	未检出
Vero	>35
		毕赤酵母	未检出
大肠杆菌	>35
		293T	>35
NS0	>35
		白色念珠菌	>35
金黄色葡萄球菌	未检出
		铜绿假单胞菌	未检出

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国食品药品检定研究院

湖州申科生物技术有限公司

<120> 一种检测产黄青霉菌基因组DNA的方法

<130> P2021-3006

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1741

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 1

ccagcttttt ttgagtgtgt gctgctcaga tagccatgca tgtctaagta taagcaactt 60

gtactgtgaa actgcgaatg gctcattaaa tcagttatcg tttatttgat agtaccttac 120

tacatggata cctgtggtaa ttctagagct aatacatgct aaaaaccccg acttcaggaa 180

ggggtgtatt tattagataa aaaaccaacg cccttcgggg ctccttggtg aatcataata 240

acttaacgaa tcgcatggcc ttgcgccggc gatggttcat tcaaatttct gccctatcaa 300

ctttcgatgg taggatagtg gcctaccatg gtggcaacgg gtaacgggga attagggttc 360

gattccggag agggagcctg agaaacggct accacatcca aggaaggcag caggcgcgca 420

aattacccaa tcccgatacg ggaggtagtg acaataaata ctgatacggg gctcttttgg 480

gtctcgtaat tggaatgaga acaatttaaa tcccttaacg aggaacaatt ggagggcaag 540

tctggtgcca gcagccgcgg taattccagc tccaatagcg tatattaaag ttgttgcagt 600

taaaaagctc gtagttgaac cttgggtctg gctggccggt ccgcctcacc gcgagtactg 660

gtccggctgg acctttcctt ctggggaacc tcatggcctt cactggctgt ggggggaacc 720

aggactttta ctgtgaaaat tagagtgttc aaagcaggcc tttgctcgaa tacattagca 780

tggaataata gaataggacg tgtggttcta ttttgttggt ttctaggacc gccgtaatga 840

ttaataggga tagtcggggg cgtcagtatt cagctgtcag aggtgaaatt cttgggattt 900

gctgaagact aactactgcg aaagcatttc gccaaggatg ttttcattaa tcagggaacg 960

aaagttaggg gatcgaagac gatcagatac cgtcgtagtc ttaaccataa actatgccga 1020

ctagggatcg gacgggattc tataatgacc cgttcggcac cttacgagaa atcaaagttt 1080

ttgggttctg gggggagtat ggtcgcaagg ctgaaactta aagaaattga cggaagggca 1140

ccacaaggcg tggagcctgc ggcttaattt gactcaacac ggggaaactc accaggtcca 1200

gacaaaataa ggattgacag attgagagct ctttcttgat cttttggatg gtggtgcatg 1260

gccgttctta gttggtggag tgatttgtct gcttaattgc gataacgaac gagacctcgg 1320

cccttaaata gcccggtccg catttgcggg ccgctggctt cttaggggga ctatcggctc 1380

aagccgatgg aagtgcgcgg caataacagg tctgtgatgc ccttagatgt tctgggccgc 1440

acgcgcgcta cactgacagg gccagcgagt acatcacctt aaccgagagg tttgggtaat 1500

cttgttaaac cctgtcgtgc tggggataga gcattgcaat tattgctctt caacgaggaa 1560

tgcctagtag gcacgagtca tcagctcgtg ccgattacgt ccctgccctt tgtacacacc 1620

gcccgtcgct actaccgatt gaatggctca gtgaggcctt gggattggct taggagggtt 1680

ggcaacgacc ccccagagcc gaatatctgt caacgcgtct agcgacccag atcctcccag 1740

c 1741

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 2

cagctcgtgc cgattacgt 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 3

gccaaccctc ctaagccaat 20

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 4

ccctttgtac acaccgcccg tcg 23

<210> 5

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 5

cagctcgtgc cgattacgtc cctgcccttt gtacacaccg cccgtcgcta ctaccgattg 60

aatggctcag tgaggccttg ggattggctt aggagggttg gc 102

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 6

ggaacaattg gagggcaagt c 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 7

gtccagccgg accagtactc 20

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 8

ccagcagccg cggtaattcc ag 22

<210> 9

<211> 151

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 9

ggaacaattg gagggcaagt ctggtgccag cagccgcggt aattccagct ccaatagcgt 60

atattaaagt tgttgcagtt aaaaagctcg tagttgaacc ttgggtctgg ctggccggtc 120

cgcctcaccg cgagtactgg tccggctgga c 151

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 10

gtgatttgtc tgcttaattg cgata 25

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 11

agccgatagt ccccctaaga ag 22

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 12

cgaacgagac ctcggccctt aaatagc 27

<210> 13

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 13

gtgatttgtc tgcttaattg cgataacgaa cgagacctcg gcccttaaat agcccggtcc 60

gcatttgcgg gccgctggct tcttaggggg actatcggct 100

Claims

1.检测试剂在抗生素制品检测中的用途，所述检测试剂包含引物对和探针，所述引物对中的正向引物如SEQ ID NO: 2所示，反向引物如SEQ ID NO: 3所示，探针如SEQ ID NO:4所示；

所述用途为检测试剂用于区分产黄青霉菌DNA与其它宿主细胞干扰性DNA，所述其它宿主细胞是CHO细胞、Vero细胞、毕赤酵母、大肠杆菌、293T细胞、NS0细胞、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌以及铜绿假单胞菌。