CN112593008A - 一种检测真菌的引物组、试剂盒、方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测真菌的引物组、试剂盒、方法及应用，属于真菌检测技术领域，所述引物组包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。所述试剂盒包括所述的引物组和检测试剂。本发明提供的检测真菌的引物组以真菌18S rRNA部分保守区序列为模板设计，特异性好，检测范围广；所述检测方法具有快速、广泛、高灵敏度、可定量、操作方便的优势，能够实现细胞产品临床研究及应用过程中的真菌检测。

Description

一种检测真菌的引物组、试剂盒、方法及应用
技术领域
本发明属于真菌检测技术领域，尤其涉及一种检测真菌的引物组、试剂盒、方法及应用。
背景技术
真菌在自然界分布广泛、种类多，可能造成细胞污染，在临床研究和应用中危害极大。在临床应用中，致病菌一旦进入人体，会引起多种感染和传染疾病，常见的有皮肤真菌感染，如足癣、灰指甲；还有深部真菌感染，如肺部曲霉感染、消化道毛霉感染。抗生素能够预防污染和感染，但并不能完全阻止真菌生长，因此对于真菌的实时检测在临床研究中尤为重要。
在《中国药典》中无菌检测的方法主要是培养法，培养法作为无菌检测的金标准检测方法，准确度高，但报告结果通常需要14天，对于生长缓慢的真菌培养时间更长。而临床使用的细胞对细胞的存活率和生长活性要求极高，长时间等待结果再用于临床会影响细胞疗效，尤其是干细胞临床的使用。《干细胞制剂质量控制和临床前研究指导原则》中对于干细胞检测的十大项中包括无菌试验，并指放行检验项目应能在相对短的时间内，反映细胞制剂的质量及安全信息。因此探索能快速检测细胞产品中真菌的方法是临床研究亟待解决的问题。目前有用全自动微生物生化鉴定系统例如梅里埃等检测真菌，是根据生物孔中的生长变化和呈色反应得到结果，该方法操作简单，但仪器成本高，报告结果通常也需要5天。目前还有商业化的快速检测试纸片法，只需培养24小时，但该方法易出现假阴性的结果。特异酶的使用、质谱技术、免疫传感器和免疫磁性分离技术特异性高，针对特定的真菌灵敏度高，但广泛性差，对于未知的真菌检测不适用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测真菌的引物组、试剂盒、方法及应用；所述引物组以真菌18S rRNA的保守区为模板设计获得，具有检测范围广、灵敏度高的优势，能够检测的菌种包括常见细胞污染真菌烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌等以及常见致病真菌表皮藓菌，新型隐球菌、假丝酵母菌等。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种检测真菌的引物组，包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明提供了一种检测真菌的试剂盒，包括所述的引物组和检测试剂。
优选的，所述引物组中正向引物和反向引物的使用浓度独立为100~400nmol/L。
优选的，所述试剂盒还包括阳性标准品，所述阳性标准品为包括18S rRNA保守区序列的pUC57质粒。
优选的，所述18S rRNA保守区序列如SEQ ID No.3所示。
优选的，所述阳性标准品的使用浓度为100~150ng/μl。
本发明提供了一种非疾病诊断目的的真菌检测方法，包括以下步骤：
1）将待检测样本置于90~110℃处理8~12min获得待检测模板；
2）将所述待检测模板、所述的引物组和检测试剂混合制备qPCR扩增体系；
3）进行qPCR扩增，当所述待检测样本的Ct值<32，溶解曲线为单峰且TM值为82~84℃时，检测结果为阳性，存在真菌；否则结果为阴性，不存在真菌。
优选的，以不同浓度的阳性标准品为待检测模板，分别进行qPCR获得不同浓度的阳性标准品qPCR的Ct值，用不同浓度的阳性标准品中pUC57质粒的拷贝数和Ct值进行线性拟合获得标准曲线，将待检测样本qPCR获得的Ct值代入标准曲线，计算获得待检测样本中真菌的拷贝数。
优选的，所述qPCR扩增程序如下：95℃ 10min；95℃ 20s，58℃ 30s，72℃ 30s，40个循环；95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s，60℃ 15s。
本发明还提供了所述检测真菌的引物组、试剂盒在细胞产品真菌污染检测中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供的检测真菌的引物组以真菌18S rRNA部分保守区序列为模板设计，特异性好，所述引物组扩增的目的序列不与哺乳动物基因同源，能很好的区分检测非真菌种属如人源基因和细菌；所述引物组还具有检测范围广的优势，能检测含有所述引物组扩增的目的序列的所有菌种，包括常见污染菌真菌烟曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌等以及常见致病真菌表皮藓菌、新型隐球菌和假丝酵母菌等。
本发明提供的检测方法，具有快速、广泛、高灵敏度、可定量、操作方便的优势，能够实现细胞产品临床研究及应用过程中的真菌检测。进一步的，本发明提供的试剂盒中包括含有18S rRNA保守区部分序列的阳性标准品，通过倍比稀释所述阳性标准品制作标准曲线，能够对真菌进行定量检测。本发明能检测的真菌拷贝数限度为3.6×102copies。本发明提供的方法，待检测样本不需抽提RNA和反转录，加热处理后直接进行PCR扩增，步骤简单。本发明提供的引物组，既可用于普通PCR扩增，又可用于荧光定量PCR扩增。
附图说明
图1为CT值和拷贝数线性拟合后获得的标准曲线；
图2为实施例3中普通PCR法检测细菌、真菌的结果。
具体实施方式
本发明提供了一种检测真菌的引物组，包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；具体如下：
正向引物：5`-aattgacggaagggcaccac-3`（SEQ ID No.1）；
反向引物：5`-aagracggccatgcaccacca-3`（SEQ ID No.2）；
其中R=A或G。
在本发明中，所述引物组以18S rRNA保守区的部分序列为模板设计，所述18SrRNA保守区的部分序列优选的如SEQ ID No.3所示，具体如下：aggaattgacggaagggcaccaccaggagtgggactgcggcttaatttgactcaacacggggaaactcaccaggtccagacacaataaggattgacagattgagagctctttcttgattttgtgggtggtggtgcatggccgtccttagt（SEQ ID No.3）；所述18S rRNA保守区部分序列具有高度保守性，本发明所述的18S rRNA保守区部分序列通过BLAST和BioEdit软件对比分析获得。
本发明对所述引物组的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的人工合成方法即可，在本发明具体实施过程中，所述引物组委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。
本发明还提供了一种检测真菌的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物组和检测试剂。在本发明中，所述引物组中正向引物和反向引物的使用浓度优选独立为100~400nmol/L，更优选为300nmol/L。在上述范围内，所述正向引物和反向引物的使用浓度越高，扩增效率越好，但特异性稍差。
在本发明中，所述试剂盒优选的还包括阳性标准品，所述阳性标准品为包括18SrRNA保守区序列的pUC57质粒；所述18S rRNA保守区序列如SEQ ID No.3所示。在本发明中，所述阳性标准品的使用浓度优选为100~150ng/μl，更优选为120~130ng/μl，最优选为125ng/μl。本发明对所述18S rRNA保守区序列在所述pUC57质粒中的插入位置没有特殊限定，所述18S rRNA保守区序列插入pUC57质粒的任意位置，能够实现扩增即可。在本发明具体实施过程中，所述阳性标准品委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。本发明对所述试剂盒中阳性标准品的储存浓度没有特殊限定，在使用时，采用1×TE buffer调整所述阳性标准品至使用浓度即可。
在本发明中，所述试剂盒包括检测试剂，所述检测试剂优选的包括PCR扩增缓冲液。本发明对所述PCR扩增缓冲液的具体组成没有特殊限定，采用本领域市售的常规PCR扩增缓冲液即可。
本发明提供了一种非疾病诊断目的的真菌检测方法，包括以下步骤：1）将待检测样本置于90~110℃处理8~12min获得待检测模板；2）将所述待检测模板、所述的引物组和检测试剂混合制备qPCR扩增体系；3）进行qPCR扩增，当所述待检测样本的Ct值<32，溶解曲线为单峰且TM值为82~84℃时，检测结果为阳性，存在真菌；否则结果为阴性，不存在真菌。
在本发明中，将待检测样本置于90~110℃处理8~12min获得待检测模板。在本发明中，所述处理的温度优选为95~105℃，更优选为100℃；所述处理的时间优选为9~11min，更优选为10min。本发明中，所述待检测样本优选为临床使用前的细胞终产品。在本发明中，所述处理的目的为裂解真菌。
本发明在获得所述待检测模板后，将所述待检测模板、所述的引物组和检测试剂混合制备qPCR扩增体系。在本发明中，所述qPCR扩增体系优选的包括以下组分：Taq聚合酶、Mg2+、dNTP、荧光染料、正向引物、反向引物、缓冲液和DNA模板。在本发明具体实施过程中，所述qPCR扩增体系以20μl计，优选的包括正向引物、反向引物各300nmol/L；待检测模板2μl和余量的Go Taq® qPCR Master Mix(2×) (Promega ) 10μl，。在本发明中，所述qPCR扩增程序优选的如下：95℃ 10min；95℃ 20s，58℃ 30s，72℃ 30s，40个循环；95℃ 15s，60℃1min，95℃ 15s，60℃ 15s。
本发明在所述qPCR结束后，根据qPCR的结果确定待检测样本中是否存在真菌：当所述待检测样本的Ct值<32，溶解曲线为单峰且TM值为82~84℃时，检测结果为阳性，存在真菌；否则结果为阴性，不存在真菌。
在本发明中，优选的以不同浓度的阳性标准品为待检测模板，分别进行qPCR获得不同浓度的阳性标准品qPCR的Ct值，用不同浓度的阳性标准品中pUC57质粒的拷贝数和Ct值进行线性拟合获得标准曲线，将待检测样本qPCR获得的Ct值代入标准曲线，计算获得待检测样本中真菌的拷贝数。在本发明中，优选的对所述阳性标准品进行倍比稀释，所述阳性标准品的拷贝数分别为3.6×100、3.6×101、3.6×102、3.6×103、3.6×104……3.6×1010copies。在本发明具体实施过程中，线性拟合后获得的标准曲线如下：y = -1.426ln(x)+ 43.516，R2 = 0.9969，其中X为拷贝数，Y为CT值。
本发明还提供了所述检测真菌的引物组、试剂盒在细胞产品真菌污染检测中的应用。在本发明中，所述细胞产品包括商品化的实验研究应用的细胞和临床治疗应用的细胞，在本发明实施例中，以人脐带间充质干细胞产品为例进行说明。在具体检测过程中，将上述真菌检测方法中的所述待检测样本替换为细胞产品即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
引物和阳性标准品的制备
正向引物：5`-AATTGACGGAAGGGCACCAC-3`（SEQ ID No.1）；
反向引物：5`-AAGRACGGCCATGCACCACCA-3`（SEQ ID No.2）。
由上海捷瑞生物工程有限公司合成，12000g离心1min，正向引物、反向引物各加水溶解至浓度为100μmol/L，取2μl正向引物加入18μl水中稀释至10μmol/L，剩余正向引物放入-20℃保存；取2μl反向引物加入18μl水中稀释至10μmol/L，剩余反向引物放入-20℃保存。
阳性标准品是含有18S rRNA保守区部分序列的pUC57质粒，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。pUC57碱基数为2710bp。
18S rRNA部分保守区序列为：
aggaattgacggaagggcaccaccaggagtgggactgcggcttaatttgactcaacacggggaaactcaccaggtccagacacaataaggattgacagattgagagctctttcttgattttgtgggtggtggtgcatggccgtccttagt（SEQ ID No.3），碱基数为151bp。
阳性标准品用1×TE buffer溶解，得到浓度为125ng/μl，计算出拷贝数为3.6×1010copies/μl。
标准曲线制备及灵敏限度检测
1、阳性标准品稀释：取200μl PCR小管，其中加入1×TE buffer稀释阳性标准品。阳性标准品从原液开始10倍梯度稀释12个浓度。
2、qPCR体系配制：反应体系总体积为20μl，其中正向引物300nmol/L，反向引物300nmol/L，阳性标准品2μl，余量的Go Taq® qPCR Master Mix(2×) (Promega )。
3、反应条件分为三个阶段，第一阶段为预变性阶段，95℃ 10min；第二阶段为PCR反应阶段，95℃ 20s，58℃ 30s，72℃ 30s，40个循环；第三阶段扩增产物熔解阶段，95℃15s，60℃ 1min，95℃ 15s，60℃ 15s。
4、根据表1中质粒不同拷贝数的Ct值结果，得出标准曲线，如表1、图1所示，y = -1.426ln(x) + 43.516，R2 = 0.9969，根据结果的稳定性，本发明能检测的DNA拷贝数限度为3.6×102copies。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实施例2
登录NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），选择Primer-BLAST功能，将实施例1中的正向引物和反向引物分别输入在“Primer Parameters”中，将“fungus”输入在“Organism”中，点击搜索，获得BLAST的相关信息。结果说明实施例1中的正向引物和反向引物能检测出多种真菌种类，包括常见污染菌真菌烟曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌等；常见致病真菌表皮藓菌，新型隐球菌、假丝酵母菌等。
实施例3
qPCR法检测细菌真菌
检测对象为黑曲霉菌（CMCC 98003）、白色念珠菌（CMCC98001）、金黄色葡萄球菌（CMCC26003）、大肠埃希氏菌（CMCC44102），菌液涂于平板上，37℃过夜培养，挑单克隆悬于100μl生理盐水中，100℃处理10min，检测方法如下：
qPCR体系配制：反应体系总体积为20μl，其中正向引物300nmol/L，反向引物300nmol/L，阳性标准品2μl，余量的Go Taq® qPCR Master Mix(2×) (Promega )。
反应条件分为三个阶段，第一阶段为预变性阶段，95℃ 10min；第二阶段为PCR反应阶段，95℃ 20s，58℃ 30s，72℃ 30s，40个循环；第三阶段扩增产物熔解阶段，95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s，60℃ 15s。
检测结果见表2。
Figure 738293DEST_PATH_IMAGE002
由表2可以看出，用本发明的引物组对细菌扩增，检测结果为阴性，真菌检测为阳性，根据本发明判断标准，真菌检测受细菌影响较小。
普通PCR法检测细菌真菌
检测对象为大肠埃希氏菌（CMCC44102）、金黄色葡萄球菌（CMCC26003）、黑曲霉菌（CMCC 98003）、白色念珠菌（CMCC98001）。菌液涂于平板上，37℃过夜培养，挑单克隆悬于100μl生理盐水中，100℃处理10min，检测方法如下：
PCR体系配制：反应体系总体积为20μl，其中正向引物300nmol/L，反向引物300nmol/L，阳性标准品2μl，余量的Go Taq® qPCR Master Mix(2×) (Promega )。
反应条件分为三个阶段，第一阶段为预变性阶段，95℃ 10min；第二阶段为PCR反应阶段，95℃ 20s，58℃ 30s，72℃ 30s，40个循环；第三阶段扩增产物熔解阶段，95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s，60℃ 15s。
检测结果如图2所示，其中条带从左到右依次为：大肠埃希氏菌；金黄色葡萄球菌；黑曲霉菌；白色念珠菌；阴性对照；标准质粒3.6×1010copies和MARK。
由图2可以得出，用本发明的引物组对细菌扩增，扩增产物在151bp无条带，用本发明的引物组对真菌扩增，扩增产物在151bp有条带，可见真菌检测受细菌影响较小。
qPCR法检测人源基因
在细胞临床应用中为了避免人源细胞干扰，用本发明的引物组进行人源细胞的DNA检测，取冻存的人源细胞再抽提RNA反转成cDNA后，用本发明的引物组检测，检测方法如下：
qPCR体系配制：反应体系总体积为20μl，其中正向引物300nmol/L，反向引物300nmol/L，阳性标准品2μl，余量的Go Taq® qPCR Master Mix(2×) (Promega )。
反应条件分为三个阶段，第一阶段为预变性阶段，95℃ 10min；第二阶段为PCR反应阶段，95℃ 20s，58℃ 30s，72℃ 30s，40个循环；第三阶段扩增产物熔解阶段，95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s，60℃ 15s。
检测结果见表3。
Figure 186592DEST_PATH_IMAGE003
由表3可以得出，用本发明的引物组扩增人源基因，结果均为阴性，根据本发明判断标准，在细胞检测中受细胞基因影响较小。
实施例4
采用实施例1的方法检测人脐带间充质干细胞放行样本
人脐带来源的间充质干细胞在培养皿中生长至80%汇合后，加入2ml胰酶，室温消化3min后，加入培养基终止消化。100g离心5min后弃去上清，加入5ml生理盐水混匀清洗三遍，最后一遍加入的生理盐水离心后取100μl作为待检测样本。
qPCR法检测如下：
qPCR体系配制：反应体系总体积为20μl，其中正向引物300nmol/L，反向引物300nmol/L，阳性标准品2μl，余量的Go Taq® qPCR Master Mix(2×) (Promega )。
反应条件分为三个阶段，第一阶段为预变性阶段，95℃ 10min；第二阶段为PCR反应阶段，95℃ 20s，58℃ 30s，72℃ 30s，40个循环；第三阶段扩增产物熔解阶段，95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s，60℃ 15s。
培养法检测：取3ml样本液加入梅里埃需氧厌氧瓶中，培养5天后观察获取结果。结果见表4。
Figure DEST_PATH_IMAGE004
由表4可以得出，用本发明方法检测人脐带间充质干细胞放行样本与培养法检测结果一致，结果可靠准确。
由上述实施例可知，本发明提供的引物组具有检测范围广、灵敏度高的优势，能够应用于细胞产品真菌污染的检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海市东方医院（同济大学附属东方医院）
<120> 一种检测真菌的引物组、试剂盒、方法及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
aattgacgga agggcaccac 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
aagracggcc atgcaccacc a 21
<210> 3
<211> 150
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
aggaattgac ggaagggcac caccaggagt gggactgcgg cttaatttga ctcaacacgg 60
ggaaactcac caggtccaga cacaataagg attgacagat tgagagctct ttcttgattt 120
tgtgggtggt ggtgcatggc cgtccttagt 150

Claims (10)

1.一种检测真菌的引物组，其特征在于，包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种检测真菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组和检测试剂。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组中正向引物和反向引物的使用浓度独立为100~400nmol/L。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性标准品，所述阳性标准品为包括18S rRNA保守区序列的pUC57质粒。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述18S rRNA保守区序列如SEQ IDNo.3所示。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品的使用浓度为100~150ng/μl。
7.一种非疾病诊断目的的真菌检测方法，包括以下步骤：
1）将待检测样本置于90~110℃处理8~12min获得待检测模板；
2）将所述待检测模板、权利要求2中所述的引物组和检测试剂混合制备qPCR扩增体系；
3）进行qPCR扩增，当所述待检测样本的Ct值<32，溶解曲线为单峰且TM值为82~84℃时，检测结果为阳性，存在真菌；否则结果为阴性，不存在真菌。
8.根据权利要求7所述的真菌检测方法，其特征在于，以不同浓度的阳性标准品为待检测模板，分别进行qPCR获得不同浓度的阳性标准品qPCR的Ct值，用不同浓度的阳性标准品中pUC57质粒的拷贝数和Ct值进行线性拟合获得标准曲线，将待检测样本qPCR获得的Ct值代入标准曲线，计算获得待检测样本中真菌的拷贝数。
9.根据权利要求7所述的真菌检测方法，其特征在于，所述qPCR扩增的程序如下：95℃10min；95℃ 20s，58℃ 30s，72℃ 30s，40个循环；95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s，60℃15s。
10.权利要求1所述检测真菌的引物组、权利要求2~6任一项所述的试剂盒在细胞产品真菌污染检测中的应用。
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