JP6318239B2 - 真菌核酸の抽出方法 - Google Patents
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Description
本発明は、生体試料中に存在する真菌の核酸抽出方法に関する。
Ｃａｎｄｉｄａ（カンジダ）属真菌は、ヒトの消化管、上気道、膣などの粘膜や皮膚に常在菌として定着しているが、免疫能が低下した場合において、侵襲性カンジダ感染症発症の原因となる。その中でも、カンジダ血症は、最も発症頻度が高く、その死亡率も非常に高いものとなっている。
カンジダ血症の原因菌種として、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ及びｎｏｎ-ａｌｂｉｃａｎｓ Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ.に属する４菌種（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ及びＣ．ｋｒｕｓｅｉ）が広く知られており、原因菌の約９０％を占めている。また、これらのＣａｎｄｉｄａ属真菌は、菌種間で抗真菌薬への感受性が大きく異なっており、原因菌種を迅速に同定することが重要な課題となっている。
従来、血液検体からのＣａｎｄｉｄａ属真菌の定量は、（１→３）−β−Ｄ−グルカン測定法、病理組織学的検査法、血液培養法、及び血液培養法の補助的な検査法としてＰＣＲ法が使用されている。しかしながら、（１→３）−β−Ｄ−グルカン測定法、病理組織学的検査法では、菌種の同定が困難であり、培養検査法では培養工程に時間がかかるため、Ｃａｎｄｉｄａ血症の診断に時間を要するという問題がある。また、血液検体から直接真菌のＤＮＡを抽出してｑＰＣＲにより真菌を検出・定量する方法も知られている。この場合、酵素処理を用いてＤＮＡの抽出が行われる（非特許文献１）が、当該酵素処理は一般に処理や精製に時間がかかるほか、後述するビーズ法に比べ高価である。
一方、血液検体中のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓやＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａといった細菌を検出・定量する方法として、血液検体に０．１ｍｍのガラスビーズを入れ、血液中の細菌の菌体を破砕（ビーズ法）し、ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ｑＰＣＲを用いて、検出・定量する方法が既に知られている（非特許文献２）。また、真菌の一種である酵母については、その形質転換体を培地にて培養し、その後、０．４５−０．５５ｍｍ程度のガラスビーズで菌体破砕する方法が知られている（特許文献１及び特許文献２）。
しかしながら、生体試料から、ビーズを用いて真菌細胞を破砕し、その核酸を抽出して、真菌を検出・定量する方法はこれまでに知られていない。
Anna Olchawa, et. al., Polish Journal of Microbiology, 2013, Vol. 62, No.1, 81-84
kazunori Matsuda, et. al., Applied and Environmental Microbiology, Jan., 2007, p32-39
本発明は、真菌を含む生体試料から真菌核酸を効率的に抽出する方法を提供することに関する。
本発明者らは、血液等の生体試料から真菌の核酸を抽出する際に、従来、真菌や細菌の菌体破砕に用いられていた直径０．１〜０．５ｍｍ程度のビーズを用いた場合には、生体試料中の真菌核酸を十分に抽出することができず、このため真菌を検出・定量できないが、直径が０．８ｍｍ〜３ｍｍのビーズを使用した場合に、核酸が効率よく抽出され、真菌を正確に検出・定量できることを見い出した。
すなわち、本発明は、以下の１）〜１０）に係るものである。
１）真菌を含む生体試料から真菌核酸を抽出する方法であって、真菌を含む試料溶液を直径０．８ｍｍ〜３ｍｍのビーズと接触させて撹拌した後、核酸を分離することを特徴とする、真菌核酸の抽出方法。
２）真菌がカンジダ属真菌である、１）の方法。
３）カンジダ属真菌が、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・トロピカリス及びカンジダ・クルーセイから選ばれる１以上である、２）の方法。
４）ビーズがガラスビーズ又はジルコニア／シリカビーズである、１）〜３）のいずれかの方法。
５）ビーズの直径が１ｍｍ〜２．５ｍｍである、１）〜４）のいずれかの方法。
６）生体試料がヒト血液である、１）〜５）のいずれかの方法。
７）１）〜６）のいずれかの方法により抽出された核酸に特異的にハイブリダイズし得る核酸断片を用いて核酸増幅反応を行う、生体試料中の真菌の検出及び／又は定量方法。
８）核酸断片が、配列番号１〜１２で示される塩基配列からなる核酸断片又はそれと相補的な塩基配列からなる核酸断片である、７）の方法。
９）直径０．８ｍｍ〜３ｍｍのビーズ及び真菌核酸に特異的にハイブリダイズし得る核酸断片を含み、核酸抽出試薬、核酸増幅反応試薬及びプロトコールから選ばれる１種以上を含んでもよい、７）又は８）の方法を実施するためのキット。
１０）ビーズの直径が１ｍｍ〜２．５ｍｍである、９）のキット。
１）真菌を含む生体試料から真菌核酸を抽出する方法であって、真菌を含む試料溶液を直径０．８ｍｍ〜３ｍｍのビーズと接触させて撹拌した後、核酸を分離することを特徴とする、真菌核酸の抽出方法。
２）真菌がカンジダ属真菌である、１）の方法。
３）カンジダ属真菌が、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・トロピカリス及びカンジダ・クルーセイから選ばれる１以上である、２）の方法。
４）ビーズがガラスビーズ又はジルコニア／シリカビーズである、１）〜３）のいずれかの方法。
５）ビーズの直径が１ｍｍ〜２．５ｍｍである、１）〜４）のいずれかの方法。
６）生体試料がヒト血液である、１）〜５）のいずれかの方法。
７）１）〜６）のいずれかの方法により抽出された核酸に特異的にハイブリダイズし得る核酸断片を用いて核酸増幅反応を行う、生体試料中の真菌の検出及び／又は定量方法。
８）核酸断片が、配列番号１〜１２で示される塩基配列からなる核酸断片又はそれと相補的な塩基配列からなる核酸断片である、７）の方法。
９）直径０．８ｍｍ〜３ｍｍのビーズ及び真菌核酸に特異的にハイブリダイズし得る核酸断片を含み、核酸抽出試薬、核酸増幅反応試薬及びプロトコールから選ばれる１種以上を含んでもよい、７）又は８）の方法を実施するためのキット。
１０）ビーズの直径が１ｍｍ〜２．５ｍｍである、９）のキット。
本発明の方法によれば、真菌を含む生体試料から、直接真菌核酸を効率的に抽出することができ、生体試料中に存在する真菌数を正確に測定することができる。また、本発明によれば、生体試料中に含まれる菌体を培養すること無く、生体試料から直接菌体中の核酸を正確に測定できることから、短時間でＣａｎｄｉｄａ血症等の診断が可能である。
本発明において、真菌を含む生体試料としては、真菌が存在し得る生体サンプルであれば特に限定されず、血液、尿、髄液、精液、喀痰、咽頭ぬぐい液、子宮頸管粘液、膣分泌物、腹水、組織、結膜ぬぐい液、歯石、歯垢、唾液、鼻汁、肺胞洗浄液、胸水、胃液、胃洗浄液、皮膚病巣、糞便、関節液、患部ぬぐい液等の生体試料が挙げられる。このうち、血液が好適であり、ヒト末梢血がより好適である。
本発明において、「真菌」とは、真正菌類Ｅｕｍｙｃｏｔａを意味し、酵母を含む総称である。例えば、カンジダ（Candida）属、イサチェンキア（Issatchenkia）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、ハンセヌラ（Hansenula）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、ペニシリウム（Penicillium）属、マラセチア（Malassezia）属、スポロトリックス（Sporothrix）属、アブシジア（Absidia）属、ムーコル（Mucor）属、リゾムーコル（rhizomucor）属、リゾプス（rhizopus）属、ニューモシスチス（Pneumocystis）属、コクシジオイデス（coccidioidomycosis）属、ヒストプラスマ（Histoplasma）属、パラコクシジオイデス（Paracoccidioides）属などに属する真菌が含まれ、このうちカンジダ属、イサチェンキア属、アスペルギルス属真菌が好適であり、カンジダ属真菌がより好適である。
カンジダ属真菌としては、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）、カンジダ・パラプシローシス（Candida parapsilosis）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、カンジダ・クルーセイ（Candida krusei）、カンジダ・ギリエルモンジイ（Candida guilliermondii）、カンジダ・ルシタニアエ（Clavispora lusitaniae）等が挙げられ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・クルーセイがより好ましい。
イサチェンキア属真菌としては、イサチェンキア・オリエンタリス（Issatchenkia orientalis）、イサチェンキア・テリコラ(Issatchenkia terricola)等が挙げられ、イサチェンキア・オリエンタリスがより好ましい。
なお、イサチェンキア・オリエンタリスとカンジダ・クルーセイは同一の菌であるが、有性世代をイサチェンキア・オリエンタリス、無性世代をカンジダ・クルーセイという。
アスペルギルス属真菌としては、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）等が挙げられる。
なお、イサチェンキア・オリエンタリスとカンジダ・クルーセイは同一の菌であるが、有性世代をイサチェンキア・オリエンタリス、無性世代をカンジダ・クルーセイという。
アスペルギルス属真菌としては、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）等が挙げられる。
本発明において、核酸とは、１本鎖又は２本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。
また、真菌を含む試料溶液は、生体から採取された生体試料、又は当該試料から適宜菌体を濃縮処理したサンプルを、蒸留水、緩衝液、生理食塩水等の液体に懸濁した溶液が挙げられる。ここで、緩衝液としては、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、トリス塩酸バッファー、溶菌バッファー（ＲＬＴ ｂｕｆｆｅｒ、ＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）及びβ‐Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを混合したもの）等を用いることができ、溶菌バッファーが好適である。
菌体濃縮処理としては、例えば遠心分離、ろ過濃縮等が挙げられるが、遠心分離が好適である。また、当該処理に際しては、ＲＮＡ安定化剤（例えば、ＲＮＡｐｒｏｔｅｃｔ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（QIAGEN）、ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ambion）等）を添加して行うのが好ましい。
尚、本発明の方法において用いられる生体試料は、血液培養法のように予め培養して菌体を増殖させた試料であっても、培養せずに生体から採取した試料であってもよい。
また、真菌を含む試料溶液は、生体から採取された生体試料、又は当該試料から適宜菌体を濃縮処理したサンプルを、蒸留水、緩衝液、生理食塩水等の液体に懸濁した溶液が挙げられる。ここで、緩衝液としては、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、トリス塩酸バッファー、溶菌バッファー（ＲＬＴ ｂｕｆｆｅｒ、ＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）及びβ‐Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを混合したもの）等を用いることができ、溶菌バッファーが好適である。
菌体濃縮処理としては、例えば遠心分離、ろ過濃縮等が挙げられるが、遠心分離が好適である。また、当該処理に際しては、ＲＮＡ安定化剤（例えば、ＲＮＡｐｒｏｔｅｃｔ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（QIAGEN）、ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ambion）等）を添加して行うのが好ましい。
尚、本発明の方法において用いられる生体試料は、血液培養法のように予め培養して菌体を増殖させた試料であっても、培養せずに生体から採取した試料であってもよい。
斯かる真菌を含む試料溶液とビーズとの接触は、当該試料溶液中にビーズを添加し撹拌する（接触撹拌処理）ことにより行われる。
ここで、「ビーズ」は、直径が０．８ｍｍ以上３ｍｍ以下であるという条件を満たすものであれば、その材質は特に限定されず、無機材料でも有機材料であってもよい。また、多孔性又は非多孔性の何れでもよい。例えば、ガラス（ホウケイ酸ガラス、石灰ガラス）ビーズ、ジルコニアビーズ、シリカビーズ、ジルコニア／シリカビーズ（１ビーズ中にジルコニアとシリカの両方を成分として含むビーズ）、ステンレスビーズ、ポリスチレンビーズ等が挙げられ、このうち、ガラスビーズ、ジルコニア／シリカビーズが好ましい。斯かるビーズは市販品（例えば、株式会社トミー精工、BioSpec Products社等のビーズ）を購入して使用することができる。
ここで、「ビーズ」は、直径が０．８ｍｍ以上３ｍｍ以下であるという条件を満たすものであれば、その材質は特に限定されず、無機材料でも有機材料であってもよい。また、多孔性又は非多孔性の何れでもよい。例えば、ガラス（ホウケイ酸ガラス、石灰ガラス）ビーズ、ジルコニアビーズ、シリカビーズ、ジルコニア／シリカビーズ（１ビーズ中にジルコニアとシリカの両方を成分として含むビーズ）、ステンレスビーズ、ポリスチレンビーズ等が挙げられ、このうち、ガラスビーズ、ジルコニア／シリカビーズが好ましい。斯かるビーズは市販品（例えば、株式会社トミー精工、BioSpec Products社等のビーズ）を購入して使用することができる。
ビーズの直径は、真菌核酸の抽出効率を向上する点から、０．８ｍｍ以上であるのが好ましく、１ｍｍ以上であるのがより好ましい。また、３ｍｍ以下であるのが好ましく、２．５ｍｍ以下がより好ましい。さらに、直径の大きなビーズは、核酸抽出時に使用するサンプルチューブへのセットが困難になるため、１ｍｍ〜２．５ｍｍが好ましく、１ｍｍがより好ましい。
撹拌方法は、菌体とビーズが十分に接触できれば特に限定されず、試料溶液を入れた容器を手動で往復振動させることでも良いが、抽出効率及び再現性の点から、振とう機やビーズ破砕機を用いて攪拌することが好ましい。この場合、攪拌時間は、真菌の細胞膜が破壊されるまででよく、具体的には１〜１０分間程度が好ましく、２〜５分間程度がより好ましい。
また、ビーズによる接触撹拌処理においては、必要に応じて、核酸の抽出効率を更に向上させるために、酵素や界面活性剤を添加してもよい。この場合の酵素としては、例えばプロテアーゼＰが挙げられる。また、界面活性剤としては、例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００が挙げられる。
斯くして、上記ビーズによる接触撹拌処理によれば、真菌細胞を効率良く破砕することができ、真菌核酸を容易に遊離させることができる。
遊離した核酸の分離は、核酸の分離抽出法として知られている公知の方法、例えば、フェノール−クロロホルム法やグアニジン法等の汎用法を採用することにより行うことができる。
例えば、前記ビーズにより接触撹拌処理された試料溶液に、フェノールを加えて、反応させた後、クロロホルム／イソアミルアルコール（またはフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール）を加えて撹拌し、遠心分離後その上清を回収し、塩化ナトリウム溶液、酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸アンモニウム緩衝液等を添加して、エタノール沈殿することにより、核酸を抽出することができる。尚、ＲＮＡの抽出を主目的とする場合は、フェノールを加えた際に５０〜７０℃で５〜１５分間反応させるホットフェノール法を行うことが好ましい。また、クロロホルム／イソアミルアルコールを使用することが好ましい。さらに、エタノール沈殿させた沈殿物は、Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで溶解させることが好ましい。一方、ＤＮＡの抽出を主目的とする場合は、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを使用することが好ましく、反応は常温で行うことができる。また、エタノール沈殿させた沈殿物は、ＴＥで溶解させることが好ましい。
例えば、前記ビーズにより接触撹拌処理された試料溶液に、フェノールを加えて、反応させた後、クロロホルム／イソアミルアルコール（またはフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール）を加えて撹拌し、遠心分離後その上清を回収し、塩化ナトリウム溶液、酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸アンモニウム緩衝液等を添加して、エタノール沈殿することにより、核酸を抽出することができる。尚、ＲＮＡの抽出を主目的とする場合は、フェノールを加えた際に５０〜７０℃で５〜１５分間反応させるホットフェノール法を行うことが好ましい。また、クロロホルム／イソアミルアルコールを使用することが好ましい。さらに、エタノール沈殿させた沈殿物は、Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで溶解させることが好ましい。一方、ＤＮＡの抽出を主目的とする場合は、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを使用することが好ましく、反応は常温で行うことができる。また、エタノール沈殿させた沈殿物は、ＴＥで溶解させることが好ましい。
斯くして抽出された核酸を、目的の真菌核酸に特異的にハイブリダイズし得る核酸断片を用い、公知の核酸増幅法により増幅してその量を測定し、これに基づき生体試料中の真菌の検出及び／又は定量を行うことができる。
斯かる核酸増幅法としては、例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）、ＲＴ−ＰＣＲ（Reverse-Transcriptase PCR）、ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）、ＬＡＭＰ（Loop-mediated Isothermal Amplification of DNA）、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence Based Amplification；Nature, 1991 Mar. 7;350(6313);91-2）、ＴＭＡ（Transcription-Mediated Amplification；Advanced Biomedical Technologies. 1998; 189-201）、ＴＲＣ（Transcription Reverse Transcription Concerted Reaction；Anal Biochem, 2003 Mar. 1;314(1):77-86）等が挙げられる。
斯かる核酸増幅法としては、例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）、ＲＴ−ＰＣＲ（Reverse-Transcriptase PCR）、ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）、ＬＡＭＰ（Loop-mediated Isothermal Amplification of DNA）、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence Based Amplification；Nature, 1991 Mar. 7;350(6313);91-2）、ＴＭＡ（Transcription-Mediated Amplification；Advanced Biomedical Technologies. 1998; 189-201）、ＴＲＣ（Transcription Reverse Transcription Concerted Reaction；Anal Biochem, 2003 Mar. 1;314(1):77-86）等が挙げられる。
目的の真菌核酸に特異的にハイブリダイズし得る核酸断片の設計は、当該真菌核酸の塩基配列を参酌することにより適宜設計することができる。
例えば、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・クルーセイ及びカンジダ属のｒＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得る核酸断片としては、後述する配列番号１〜１２で示される塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列からなる核酸断片、或いは当該塩基配列のうちの１又は数個、好ましくは１乃至１０個の塩基が置換、付加又は欠失した塩基配列からなる核酸断片、或いは当該塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸断片、或いは当該塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる核酸断片が挙げられる。
尚、塩基配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ（Ｒ）のホモロジー解析プログラムを用いることにより算出される。
また、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液及び２５０ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡを含む溶液に４２℃で１６〜２４時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
例えば、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・クルーセイ及びカンジダ属のｒＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得る核酸断片としては、後述する配列番号１〜１２で示される塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列からなる核酸断片、或いは当該塩基配列のうちの１又は数個、好ましくは１乃至１０個の塩基が置換、付加又は欠失した塩基配列からなる核酸断片、或いは当該塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸断片、或いは当該塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる核酸断片が挙げられる。
尚、塩基配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ（Ｒ）のホモロジー解析プログラムを用いることにより算出される。
また、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液及び２５０ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡを含む溶液に４２℃で１６〜２４時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
核酸増幅法としてＰＣＲあるいはＲＴ−ＰＣＲを用いる場合、（１）上記のように試料溶液より抽出したＤＮＡ又はＲＮＡに対して、上記核酸断片の１以上を用いてＰＣＲあるいはＲＴ−ＰＣＲを行う工程、及び（２）工程（１）による増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程により行うことができる。目的の真菌由来の鋳型ＤＮＡ（鋳型がＲＮＡの場合はｃＤＮＡ）に上記核酸断片を組み合わせ、増幅反応を行うことにより、目的の真菌に特異的なＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物）を得ることができる。このようにして得られたＤＮＡを電気泳動すれば、バンドの有無から目的の真菌を特異的に検出、同定することができる。
また、鋳型のＤＮＡ又はＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を段階的に希釈しＰＣＲを行えば、目的の真菌の定量化も可能である。ＰＣＲを用いて定量を行う際は、上記方法の他、リアルタイムＰＣＲを用いる方法がより好ましい。ＰＣＲにより増幅されるＰＣＲ産物量を経時的に観察し、一定のＤＮＡ量に達した時のＰＣＲサイクル数を特定することにより、試料溶液中の目的の真菌の定量が可能となる。
また、鋳型のＤＮＡ又はＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を段階的に希釈しＰＣＲを行えば、目的の真菌の定量化も可能である。ＰＣＲを用いて定量を行う際は、上記方法の他、リアルタイムＰＣＲを用いる方法がより好ましい。ＰＣＲにより増幅されるＰＣＲ産物量を経時的に観察し、一定のＤＮＡ量に達した時のＰＣＲサイクル数を特定することにより、試料溶液中の目的の真菌の定量が可能となる。
増幅されるＰＣＲ産物の経時的な観察は、ＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ Ｉ等のインターカレーターである蛍光色素により標識し、各ＰＣＲ段階での蛍光強度を測定することにより行うことができる。インターカレーターは二本鎖核酸にインターカレーションすることで蛍光強度が増加する性質を有することから、標的真菌のＤＮＡ（ＲＮＡの場合はｃＤＮＡ）からＰＣＲ反応により生成するＰＣＲ産物を正確に測定することができ、特にＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ Ｉが好適に用いられる。任意に設定された一定の蛍光強度（ＤＮＡ量）に達した時のＰＣＲサイクル数（以下ＣＴ値とする）を特定することにより、生体試料中の標的真菌の定量、或いは検出・同定が可能となる。また、蛍光色素により標識したＴａｑＭａｎプローブやＭｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｂｅａｃｏｎ等を使用することにより行うこともできる。ＴａｑＭａｎプローブやＭｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｂｅａｃｏｎは、ＰＣＲにより増幅される領域の内部配列と相同性を有するオリゴヌクレオチドに蛍光色素とクエンチャーを結合させたプローブを用いた検出法である。プローブに結合した蛍光色素とクエンチャーの相互作用でＰＣＲ増幅反応に応じた蛍光を発するため、各ＰＣＲ段階での蛍光強度を測定することにより増幅されるＰＣＲ産物の経時的な観察を行うことができる。
生体試料中の目的の真菌の定量、或いは検出・同定は、別途計測した真菌数の対数値とＣＴ値の検量線により求めることができる。すなわち、標的とする真菌数の対数値を横軸に、ＣＴ値を縦軸にプロットした検量線を予め作成し、ＰＣＲ反応の結果得られたＣＴ値を該検量線に代入して、生体試料中の目的の真菌の定量、或いは検出・同定を行う。
上記核酸断片は、上記のＰＣＲ法又はＲＴ−ＰＣＲ法においてプライマーとして用いる他、単独でもプローブとして使用でき、これらは他の公知のユニバーサルプライマー、オリゴヌクレオチド等と組み合わせて用いることもできる。
上記核酸断片をプローブとして用いる分析方法としては、例えばインサイチュハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、ドットブロットハイブリダイゼーション（ｄｏｔ ｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）等が挙げられ、中でもインサイチュハイブリダイゼーションは迅速な手法として好ましく、蛍光物質により標識した核酸断片をプローブとして用いるＦＩＳＨがより好ましい。
ＦＩＳＨは、具体的には、（１）生体試料をホルムアルデヒド或いはホルマリンにより固定する工程、（２）固定した生体試料をスライドグラス又はメンブレンフィルターに塗抹する工程、（３）蛍光標識した核酸断片によりハイブリダイゼーションを行う工程、（４）ハイブリダイズ後の余分な核酸断片及び非特異的に結合した核酸断片を洗浄する工程、及び（５）ハイブリダイズ後の結果について蛍光顕微鏡を用いて肉眼的に観察、或いはＣＣＤカメラ等により画像として取得する工程により行うことができる。
生体試料中に目的の真菌が存在する場合は、用いた上記核酸断片とハイブリダイズし、上記ハイブリダイズ後の結果におけるシグナルが陽性となるので、これらの真菌を特異的に検出し、同定することができる。また、シグナル強度を測定することにより、定量化も可能となる。
上記生体試料中の真菌の検出及び／又は定量は、上述した本発明の真菌核酸の抽出方法により抽出された核酸について、これに特異的にハイブリダイズし得る核酸断片を用いて核酸増幅反応を行うためのキットにより行うことができる。ここで、斯かる方法を実施するためのキットとしては、当該方法の全部又は一部の工程を行うのに必要なものの全部又は一部を集めたものが挙げられる。ここで、「工程を行うのに必要なもの」は、本明細書の記載を参酌することにより、適宜選択することができる。例えば、（１）直径０．８ｍｍ〜３ｍｍのビーズ及び（２）真菌核酸に特異的にハイブリダイズし得る核酸断片を含み、（３）核酸抽出のための各種試薬（例えば、試料調製のための緩衝液、ＲＮＡの固定試薬、核酸分離試薬）（核酸抽出試薬）、（４）核酸増幅反応に用いる試薬（核酸増幅反応試薬）、及び（５）実施方法を記載したプロトコール（プロトコール）から選ばれる１種以上を含んでもよいキットが挙げられる。
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
［１］使用菌株
株式会社ヤクルト本社中央研究所にて保存していた、表１に示す菌株を使用した。各菌株の初発菌数は、１×１０５ｃｅｌｌｓ程度となるように調整した。
各菌株の培養条件を表１に示した。培養条件Ａ〜Ｅの詳細は以下の通りである。
条件Ａ：ＹＭブロスにて、２６℃、好気条件下で２４〜４８時間の振とう培養を行った。
条件Ｂ：１％グルコース加変法ＧＡＭブロスにて、３７℃、嫌気条件下で１８〜７２時間の静置培養を行った。
条件Ｃ：ブレインハートインフュージョンブロスにて、３７℃、好気条件下で１８時間の静置培養を行った。
条件Ｄ：ＭＲＳブロスにて、３７℃、嫌気条件下で２４時間静置培養を行った。
条件Ｅ：プレストン培地にて、３７℃、微好気条件下で２４時間静置培養を行った。
これらの菌体は、ＤＡＰＩ法により菌数を測定した後、一定の菌数となるように適宜希釈し、菌液を調製した。
株式会社ヤクルト本社中央研究所にて保存していた、表１に示す菌株を使用した。各菌株の初発菌数は、１×１０５ｃｅｌｌｓ程度となるように調整した。
各菌株の培養条件を表１に示した。培養条件Ａ〜Ｅの詳細は以下の通りである。
条件Ａ：ＹＭブロスにて、２６℃、好気条件下で２４〜４８時間の振とう培養を行った。
条件Ｂ：１％グルコース加変法ＧＡＭブロスにて、３７℃、嫌気条件下で１８〜７２時間の静置培養を行った。
条件Ｃ：ブレインハートインフュージョンブロスにて、３７℃、好気条件下で１８時間の静置培養を行った。
条件Ｄ：ＭＲＳブロスにて、３７℃、嫌気条件下で２４時間静置培養を行った。
条件Ｅ：プレストン培地にて、３７℃、微好気条件下で２４時間静置培養を行った。
これらの菌体は、ＤＡＰＩ法により菌数を測定した後、一定の菌数となるように適宜希釈し、菌液を調製した。
参考例１ Ｃａｎｄｉｄａ属５菌種特異的プライマー及びＣａｎｄｉｄａグループ特異的プライマーの調製
Ｃａｎｄｉｄａ属の検出・定量をＲＴ−ＰＣＲ法で行う際に使用するプライマーの調製を行った。
（１）使用したプライマー
使用したプライマーを表２に示す。
Ｃａｎｄｉｄａ属の検出・定量をＲＴ−ＰＣＲ法で行う際に使用するプライマーの調製を行った。
（１）使用したプライマー
使用したプライマーを表２に示す。
（２）プライマーの設計
Ｃａｎｄｉｄａ属菌種及びその近縁菌種（以下、Ｃａｎｄｉｄａグループ）の１８Ｓ又は２６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列をデータベースより入手した。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘソフトウェア（Thompson, J. D., Higgins, D. G., and Gibson, T. J. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680）を用いて得られた配列の多重整列を行い、近隣接合法による系統樹を作成した。整列配列の比較から、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ及びＣａｎｄｉｄａ属及びその近縁種にそれぞれ特異的な配列を同定し、それらの配列情報をもとに菌種特異的プライマー及びＣａｎｄｉｄａグループ特異的プライマーを設計した。
Ｃａｎｄｉｄａ属菌種及びその近縁菌種（以下、Ｃａｎｄｉｄａグループ）の１８Ｓ又は２６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列をデータベースより入手した。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘソフトウェア（Thompson, J. D., Higgins, D. G., and Gibson, T. J. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680）を用いて得られた配列の多重整列を行い、近隣接合法による系統樹を作成した。整列配列の比較から、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ及びＣａｎｄｉｄａ属及びその近縁種にそれぞれ特異的な配列を同定し、それらの配列情報をもとに菌種特異的プライマー及びＣａｎｄｉｄａグループ特異的プライマーを設計した。
（３）プライマーの検出感度の検討
表２に示した全てのプライマーセットについて、それぞれの標準菌株を純培養した菌体よりＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ｑＰＣＲにより検量線を作成した。具体的には以下の方法を行った。
１）サンプルチューブに、上記［１］使用菌株で調製した各標準菌株の菌液２００μＬ及びＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）４００μＬを添加し、５分間室温にて静置した。その後、１３，０００ｇにて５分間遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去した。上清を除去した後の残渣に溶菌バッファー ４５０μＬ（１サンプルあたり３４６．５μＬのＲＬＴ ｂｕｆｆｅｒ、１００μＬのＴＥ及び３.５μＬのβ―Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを混合して調製する）及び直径が１ｍｍ（３００ｍｇ）のガラスビーズ（ＴＯＭＹ精工）を添加した。
２）振とう機（ＳｈａｋｅＭａｓｔｅｒ）にサンプルチューブをセットした後、５分間振とうし、菌体を破砕した。
３）５００μＬ水飽和Ｐｈｅｎｏｌを加え、ボルテックスにより５〜１０秒間撹拌した。
４）６０℃のヒートブロックにサンプルチューブをセットし、１０分間反応させた（ホットフェノール法）。
５）１００μＬ Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／Ｉｓｏａｍｙｌ ａｌｃｈｏｌ（２４：１）を加え、ボルテックスにより５〜１０秒間撹拌した。
６）遠心分離後（１３，０００ｇ×５分）、上清４７０μＬを新しい蓋付マイクロチューブ（１．５ｍＬ）に移した。
７）４７０μＬ Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／Ｉｓｏａｍｙｌ ａｌｃｈｏｌ（２４：１）を加え、ボルテックスにより５〜１０秒間撹拌した。
８）遠心分離後（１３，０００ｇ×５分）、上清４００μＬを新しい蓋付マイクロチューブ（１．５ｍＬ）に移した。
９）３Ｍ 酢酸Ｎａ（ｐＨ５．４）４０μＬ及びＩｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ ４００μＬを加え、転倒混和した。
１０）遠心分離（２０，０００ｇ×１０分）を行った。
１１）デカンテーションにて上清を除いた後、８０％Ｅｔｈａｎｏｌ ５００μＬを加えた。
１２）遠心分離後（２０，０００ｇ×２分）、デカンテーションにて上清を除いた。
１３）風乾（口を上にして約２０分間）した後、ＤＡＰＩ法による菌数測定に基づき、２×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＮｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）を加えて、撹拌して均一に溶解させた。さらにＮｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒにより１０倍段階希釈を実施し、２×１０−１〜２×１０１ｃｅｌｌｓ／ｍＬの範囲の希釈したサンプルを次の１４）記載のＲＮＡサンプルとして使用し、ＲＴ−ｑＰＣＲ反応に供試した。
１４）ＲＴ−ｑＰＣＲは、ＱＩＡＧＥＮ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ-ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて実施し、反応液組成は、１ｘＱＩＡＧＥＮ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ-ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、０．５ｘＱ−Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、０．４ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ、１／２５量のＱＩＡＧＥＮ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ、１／１００，０００量のＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、１ｘＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．６０μＭの表２に示した各プライマー、及び５μＬの上記１３）で調製したＲＮＡサンプル（１０−３〜１０３ｃｅｌｌｓ）を含む反応液（総量１０μＬ）で行った。
１５）反応液はまず５０℃で３０分間逆転写反応を行い、その後逆転写酵素を失活させるため９５℃で１５分間加熱した。引き続いて、９４℃・２０秒、５５℃又は６０℃（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ及びＣ．ｋｒｕｓｅｉの各プライマーについては６０℃で行い、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ及びＣａｎｄｉｄａ ｇｒｏｕｐの各プライマーについては５５℃で行った）・２０秒、７２℃・５０秒を４５サイクル行い、増幅産物の量をサイクルごとにＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ Ｉの蛍光強度として測定した。引き続いてＰＣＲの特異性を検定するため、増幅産物の変性温度の測定を行った。９４℃で１５秒間反応後、６０℃から９９℃にかけて０．２℃／秒の速度で緩やかに温度を上昇させ、増幅産物の変性曲線を作製した。これらの一連の反応は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（Ｒ）７９００ＨＴシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により行った。得られたＰＣＲ曲線について、蛍光強度のベースラインおよび閾値を設定し、PCR曲線と閾値が交差するサイクル数（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ:ＣＴ値）を求めた。得られたＣＴ値を縦軸に、ＰＣＲ反応に供試したサンプル菌数を横軸にプロットした。これらの解析には、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＤＳ）ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。
１６）ＤＡＰＩ法により測定しＣａｎｄｉｄａ属５菌種の菌数をｘ軸に、それに対応するＲＴ−ｑＰＣＲにより得たＣＴ値をｙ軸にプロットし、決定係数（Ｒ２）が０．９９を上回る値が得られる範囲を決定した。
その結果を図１に示した。ＲＴ−ｑＰＣＲの結果より、ｓ−Ｃａｌｂ−Ｆ／Ｒを用いた場合、ＲＴ−ＰＣＲ一反応あたり１×１０−２から１×１０３個の範囲で高い相関が得られた。また、ｓ−Ｃｇｌａｂ−Ｆ／Ｒ、ｓ−Ｃｋｒｕ−Ｆ／Ｒ、ｓ−Ｃｔｒｐ−Ｆ／Ｒ、ｓ−Ｃｐａｒａ−Ｆ／Ｒ、及びｇ−Ｃａｎｄ−Ｆ／Ｒを用いた場合、ＲＴ−ＰＣＲ一反応あたり１×１０−３から１×１０３個の範囲で高い相関が得られた。すなわち、表２に示したプライマーセットは、いずれにおいても、ＲＴ−ＰＣＲ反応あたり１０−２cells相当のＲＮＡを検出可能であった。これは、血液１ｍＬあたりに換算すると、１個の菌体を検出可能であると推定された。
検出感度の確認に使用した図１は、前述の通り、ＲＴ−ＰＣＲ一反応あたり１×１０−２から１×１０３の範囲で、決定係数（Ｒ２）が０．９９を上回る値を示していることから、後述するプライマーの特異性検討、及び菌数の測定において標準曲線として使用した。
表２に示した全てのプライマーセットについて、それぞれの標準菌株を純培養した菌体よりＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ｑＰＣＲにより検量線を作成した。具体的には以下の方法を行った。
１）サンプルチューブに、上記［１］使用菌株で調製した各標準菌株の菌液２００μＬ及びＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）４００μＬを添加し、５分間室温にて静置した。その後、１３，０００ｇにて５分間遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去した。上清を除去した後の残渣に溶菌バッファー ４５０μＬ（１サンプルあたり３４６．５μＬのＲＬＴ ｂｕｆｆｅｒ、１００μＬのＴＥ及び３.５μＬのβ―Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを混合して調製する）及び直径が１ｍｍ（３００ｍｇ）のガラスビーズ（ＴＯＭＹ精工）を添加した。
２）振とう機（ＳｈａｋｅＭａｓｔｅｒ）にサンプルチューブをセットした後、５分間振とうし、菌体を破砕した。
３）５００μＬ水飽和Ｐｈｅｎｏｌを加え、ボルテックスにより５〜１０秒間撹拌した。
４）６０℃のヒートブロックにサンプルチューブをセットし、１０分間反応させた（ホットフェノール法）。
５）１００μＬ Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／Ｉｓｏａｍｙｌ ａｌｃｈｏｌ（２４：１）を加え、ボルテックスにより５〜１０秒間撹拌した。
６）遠心分離後（１３，０００ｇ×５分）、上清４７０μＬを新しい蓋付マイクロチューブ（１．５ｍＬ）に移した。
７）４７０μＬ Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／Ｉｓｏａｍｙｌ ａｌｃｈｏｌ（２４：１）を加え、ボルテックスにより５〜１０秒間撹拌した。
８）遠心分離後（１３，０００ｇ×５分）、上清４００μＬを新しい蓋付マイクロチューブ（１．５ｍＬ）に移した。
９）３Ｍ 酢酸Ｎａ（ｐＨ５．４）４０μＬ及びＩｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ ４００μＬを加え、転倒混和した。
１０）遠心分離（２０，０００ｇ×１０分）を行った。
１１）デカンテーションにて上清を除いた後、８０％Ｅｔｈａｎｏｌ ５００μＬを加えた。
１２）遠心分離後（２０，０００ｇ×２分）、デカンテーションにて上清を除いた。
１３）風乾（口を上にして約２０分間）した後、ＤＡＰＩ法による菌数測定に基づき、２×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＮｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）を加えて、撹拌して均一に溶解させた。さらにＮｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒにより１０倍段階希釈を実施し、２×１０−１〜２×１０１ｃｅｌｌｓ／ｍＬの範囲の希釈したサンプルを次の１４）記載のＲＮＡサンプルとして使用し、ＲＴ−ｑＰＣＲ反応に供試した。
１４）ＲＴ−ｑＰＣＲは、ＱＩＡＧＥＮ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ-ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて実施し、反応液組成は、１ｘＱＩＡＧＥＮ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ-ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、０．５ｘＱ−Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、０．４ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ、１／２５量のＱＩＡＧＥＮ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ、１／１００，０００量のＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、１ｘＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．６０μＭの表２に示した各プライマー、及び５μＬの上記１３）で調製したＲＮＡサンプル（１０−３〜１０３ｃｅｌｌｓ）を含む反応液（総量１０μＬ）で行った。
１５）反応液はまず５０℃で３０分間逆転写反応を行い、その後逆転写酵素を失活させるため９５℃で１５分間加熱した。引き続いて、９４℃・２０秒、５５℃又は６０℃（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ及びＣ．ｋｒｕｓｅｉの各プライマーについては６０℃で行い、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ及びＣａｎｄｉｄａ ｇｒｏｕｐの各プライマーについては５５℃で行った）・２０秒、７２℃・５０秒を４５サイクル行い、増幅産物の量をサイクルごとにＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ Ｉの蛍光強度として測定した。引き続いてＰＣＲの特異性を検定するため、増幅産物の変性温度の測定を行った。９４℃で１５秒間反応後、６０℃から９９℃にかけて０．２℃／秒の速度で緩やかに温度を上昇させ、増幅産物の変性曲線を作製した。これらの一連の反応は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（Ｒ）７９００ＨＴシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により行った。得られたＰＣＲ曲線について、蛍光強度のベースラインおよび閾値を設定し、PCR曲線と閾値が交差するサイクル数（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ:ＣＴ値）を求めた。得られたＣＴ値を縦軸に、ＰＣＲ反応に供試したサンプル菌数を横軸にプロットした。これらの解析には、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＤＳ）ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。
１６）ＤＡＰＩ法により測定しＣａｎｄｉｄａ属５菌種の菌数をｘ軸に、それに対応するＲＴ−ｑＰＣＲにより得たＣＴ値をｙ軸にプロットし、決定係数（Ｒ２）が０．９９を上回る値が得られる範囲を決定した。
その結果を図１に示した。ＲＴ−ｑＰＣＲの結果より、ｓ−Ｃａｌｂ−Ｆ／Ｒを用いた場合、ＲＴ−ＰＣＲ一反応あたり１×１０−２から１×１０３個の範囲で高い相関が得られた。また、ｓ−Ｃｇｌａｂ−Ｆ／Ｒ、ｓ−Ｃｋｒｕ−Ｆ／Ｒ、ｓ−Ｃｔｒｐ−Ｆ／Ｒ、ｓ−Ｃｐａｒａ−Ｆ／Ｒ、及びｇ−Ｃａｎｄ−Ｆ／Ｒを用いた場合、ＲＴ−ＰＣＲ一反応あたり１×１０−３から１×１０３個の範囲で高い相関が得られた。すなわち、表２に示したプライマーセットは、いずれにおいても、ＲＴ−ＰＣＲ反応あたり１０−２cells相当のＲＮＡを検出可能であった。これは、血液１ｍＬあたりに換算すると、１個の菌体を検出可能であると推定された。
検出感度の確認に使用した図１は、前述の通り、ＲＴ−ＰＣＲ一反応あたり１×１０−２から１×１０３の範囲で、決定係数（Ｒ２）が０．９９を上回る値を示していることから、後述するプライマーの特異性検討、及び菌数の測定において標準曲線として使用した。
（４）プライマーの特異性の検討
Ｃａｎｄｉｄａグループに属する３０株（表１−１）及びヒト腸内細菌及び腸管感染症起因細菌２６株（表１−２）について、ＲＴ−ｑＰＣＲ法により合成したプライマーの特異性の検討を行った。ＲＴ−ＰＣＲ一反応に対して、各菌株から抽出された全ＲＮＡの１０５ｃｅｌｌｓ相当を供試した。各菌株より得られたＣＴ値を図１の標準曲線に代入し、菌数が１０４ｃｅｌｌｓ以上のものを陽性（＋）、１００ｃｅｌｌｓ以下のものを陰性（−）、１００−１０４ｃｅｌｌｓのものを（±）と判定した。
Ｃａｎｄｉｄａグループに属する３０株（表１−１）及びヒト腸内細菌及び腸管感染症起因細菌２６株（表１−２）について、ＲＴ−ｑＰＣＲ法により合成したプライマーの特異性の検討を行った。ＲＴ−ＰＣＲ一反応に対して、各菌株から抽出された全ＲＮＡの１０５ｃｅｌｌｓ相当を供試した。各菌株より得られたＣＴ値を図１の標準曲線に代入し、菌数が１０４ｃｅｌｌｓ以上のものを陽性（＋）、１００ｃｅｌｌｓ以下のものを陰性（−）、１００−１０４ｃｅｌｌｓのものを（±）と判定した。
（ａ）各プライマーのＣａｎｄｉｄａグループに対する特異性
Ｃａｎｄｉｄａ属５菌種特異的プライマー及びＣａｎｄｉｄａグループ特異的プライマーのＣａｎｄｉｄａグループに対する特異性を検討した。その結果、各菌株より表３に示すＣＴ値が得られた。得られたＣＴ値を対応するプライマーごとに図１のグラフＡ〜Ｆに代入して（＋）、（−）、（±）を判定した。
その結果、Ｃａｎｄｉｄａ属５菌種特異的プライマーでは、それぞれの菌種のみ（＋）となり、他のＣａｎｄｉｄａ属菌種とは反応しなかった。また、Ｃａｎｄｉｄａグループ特異的プライマーでは、すべての菌種で（＋）となり、高い反応性を有していることが分かった。
Ｃａｎｄｉｄａ属５菌種特異的プライマー及びＣａｎｄｉｄａグループ特異的プライマーのＣａｎｄｉｄａグループに対する特異性を検討した。その結果、各菌株より表３に示すＣＴ値が得られた。得られたＣＴ値を対応するプライマーごとに図１のグラフＡ〜Ｆに代入して（＋）、（−）、（±）を判定した。
その結果、Ｃａｎｄｉｄａ属５菌種特異的プライマーでは、それぞれの菌種のみ（＋）となり、他のＣａｎｄｉｄａ属菌種とは反応しなかった。また、Ｃａｎｄｉｄａグループ特異的プライマーでは、すべての菌種で（＋）となり、高い反応性を有していることが分かった。
（ｂ）各プライマーのヒト腸内細菌及び腸管感染症起因細菌に対する特異性
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ及びＣａｎｄｉｄａグループ特異的プライマーについて、ヒト腸内細菌及び腸管感染症起因細菌２６株との特異性を検討した。その結果、各菌株より表４に示すＣＴ値が得られた。また、プライマーと細菌が反応しなかったため、ＣＴ値が決定できなかったものは、ＵＤ（ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）と示した。得られたＣＴ値を対応するプライマーごとに図１のグラフＡ〜Ｆに代入して（＋）、（−）、（±）を判定した。
その結果、表４に示す通り、すべて陰性（−）となった。なお、ＵＤはプライマーと細菌が反応しないことから、陰性と判定した。
よって、検討したいずれのプライマーにおいても、交差反応は認められなかった。
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ及びＣａｎｄｉｄａグループ特異的プライマーについて、ヒト腸内細菌及び腸管感染症起因細菌２６株との特異性を検討した。その結果、各菌株より表４に示すＣＴ値が得られた。また、プライマーと細菌が反応しなかったため、ＣＴ値が決定できなかったものは、ＵＤ（ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）と示した。得られたＣＴ値を対応するプライマーごとに図１のグラフＡ〜Ｆに代入して（＋）、（−）、（±）を判定した。
その結果、表４に示す通り、すべて陰性（−）となった。なお、ＵＤはプライマーと細菌が反応しないことから、陰性と判定した。
よって、検討したいずれのプライマーにおいても、交差反応は認められなかった。
すなわち、作製したＣａｎｄｉｄａ属５菌種特異的プライマー及びＣａｎｄｉｄａ属とその近縁種を含むＣａｎｄｉｄａグループ特異的プライマーは、それぞれの標的菌種を特異的に検出可能であることが確認された。
実施例１〜２及び比較例１〜２
菌体からの核酸抽出並びにＲＴ−ｑＰＣＲ法を用いた菌数の測定
（１）血液サンプルの調製
健常成人から採血した末梢血液に１／１０量の３．８％クエン酸ナトリウム水溶液を添加して抗凝固処理した。これに、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ ＪＣＭ３７６１Ｔ、Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ ＩＦＯ１２７９Ｔ及び陽性コントロールとしてＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ１０１４５Ｔの純培養検体を、１ｍＬあたり１０５ｃｅｌｌｓ及び１０２ｃｅｌｌｓとなるように、採取したヒト末梢血に添加した。対照として、血液の代わりにＹＭブロスへ菌液を添加した。各菌液を添加した血液検体及び対照検体１ｍＬに、２ｍＬのＲＮＡｐｒｏｔｅｃｔ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を添加し、５分間室温にて静置した。その後、１４,０００ｇにて１０分間遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去した後、残渣をＲＮＡ抽出用サンプルとして使用した。
菌体からの核酸抽出並びにＲＴ−ｑＰＣＲ法を用いた菌数の測定
（１）血液サンプルの調製
健常成人から採血した末梢血液に１／１０量の３．８％クエン酸ナトリウム水溶液を添加して抗凝固処理した。これに、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ ＪＣＭ３７６１Ｔ、Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ ＩＦＯ１２７９Ｔ及び陽性コントロールとしてＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ１０１４５Ｔの純培養検体を、１ｍＬあたり１０５ｃｅｌｌｓ及び１０２ｃｅｌｌｓとなるように、採取したヒト末梢血に添加した。対照として、血液の代わりにＹＭブロスへ菌液を添加した。各菌液を添加した血液検体及び対照検体１ｍＬに、２ｍＬのＲＮＡｐｒｏｔｅｃｔ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を添加し、５分間室温にて静置した。その後、１４,０００ｇにて１０分間遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去した後、残渣をＲＮＡ抽出用サンプルとして使用した。
（２）菌体からの核酸抽出
下記手順に従い、ＲＮＡ抽出操作を行った。
１）サンプルチューブに、（１）で調製したＲＮＡ抽出用サンプル２００μＬ及びＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）４００μＬを添加し、５分間室温にて静置した。その後、１３，０００ｇにて５分間遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去した。上清を除去した後の残渣に溶菌バッファー ４５０μＬ（１サンプルあたり３４６．５μＬのＲＬＴ ｂｕｆｆｅｒ、１００μＬのＴＥ及び３.５μＬのβ―Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを混合して調製する）及び直径が０．１ｍｍ（３００ｍｇ）、０．５ｍｍ（３００ｍｇ）、１ｍｍ（３００ｍｇ）及び２．５ｍｍ（１０粒、２５０〜３００ｍｇ）のガラスビーズ（ＴＯＭＹ精工、及びＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）を所定量添加した。
２）前記参考例１（３）の２）〜１２）記載の方法と同様に抽出操作を行った。
３）風乾（口を上にして約２０分間）した後、Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを加えて、撹拌して均一に溶解させた。
下記手順に従い、ＲＮＡ抽出操作を行った。
１）サンプルチューブに、（１）で調製したＲＮＡ抽出用サンプル２００μＬ及びＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）４００μＬを添加し、５分間室温にて静置した。その後、１３，０００ｇにて５分間遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去した。上清を除去した後の残渣に溶菌バッファー ４５０μＬ（１サンプルあたり３４６．５μＬのＲＬＴ ｂｕｆｆｅｒ、１００μＬのＴＥ及び３.５μＬのβ―Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを混合して調製する）及び直径が０．１ｍｍ（３００ｍｇ）、０．５ｍｍ（３００ｍｇ）、１ｍｍ（３００ｍｇ）及び２．５ｍｍ（１０粒、２５０〜３００ｍｇ）のガラスビーズ（ＴＯＭＹ精工、及びＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）を所定量添加した。
２）前記参考例１（３）の２）〜１２）記載の方法と同様に抽出操作を行った。
３）風乾（口を上にして約２０分間）した後、Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを加えて、撹拌して均一に溶解させた。
（３）菌数の測定
（２）で得られた核酸抽出液について、ＲＴ−ｑＰＣＲ法を用いて、菌数を測定した。ＲＴ−ｑＰＣＲは、前記参考例１（３）の１４）、１５）記載の方法と同様に行った。プライマーとして表２に示す配列番号３〜６及び表５に示す配列番号１３、１４を使用した。ＲＴ−ｑＰＣＲ解析において、検量線作成のための標準菌株のＲＮＡ抽出は、菌体添加検体と対応する菌体破砕条件により実施した。
（２）で得られた核酸抽出液について、ＲＴ−ｑＰＣＲ法を用いて、菌数を測定した。ＲＴ−ｑＰＣＲは、前記参考例１（３）の１４）、１５）記載の方法と同様に行った。プライマーとして表２に示す配列番号３〜６及び表５に示す配列番号１３、１４を使用した。ＲＴ−ｑＰＣＲ解析において、検量線作成のための標準菌株のＲＮＡ抽出は、菌体添加検体と対応する菌体破砕条件により実施した。
結果を表６に示した。また、ＹＭブロスへ菌体液を添加した場合の結果を表７に示す。
（４）結果
陽性コントロールであるＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは、いずれのガラスビーズを用いた菌体破砕でも、ＹＭブロス及びヒト末梢血において、添加した菌数と同程度の菌数が測定された。Ｃａｎｄｉｄａ菌種の場合は、ヒト末梢血検体において、０．１ｍｍ及び０．５ｍｍ径のガラスビーズを用いた菌体破砕では、添加菌数の１/１０程度の菌数が測定された（比較例１及び２）。一方で、１．０ｍｍ及び２．５ｍｍ径のガラスビーズを用いた菌体破砕では、ヒト末梢血において、添加菌数と同程度の菌数が測定された（実施例１及び２）。また、ＹＭブロスでは、いずれのビーズ径を用いた場合でも、添加菌数と同程度の菌数が測定された。以上より、ヒト血液において真菌であるＣａｎｄｉｄａ菌種の菌体破砕に１．０〜２．５ｍｍ径のガラスビーズを用いた場合に、特異的に菌体破砕効率が上がることが分かった。
実施例３〜４及び比較例３
ガラスビーズをジルコニア／シリカビーズ（ＴＯＭＹ精工及びＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）に換え、実施例１〜２及び比較例１〜２と同様にして、菌体からの核酸抽出並びにＲＴ−ｑＰＣＲ法を用いた菌数の測定を行った。結果を表８及び表９に示した。
ガラスビーズをジルコニア／シリカビーズ（ＴＯＭＹ精工及びＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）に換え、実施例１〜２及び比較例１〜２と同様にして、菌体からの核酸抽出並びにＲＴ−ｑＰＣＲ法を用いた菌数の測定を行った。結果を表８及び表９に示した。
実施例１〜２及び比較例１〜２と同様、Ｐ. aｅｒｕｇｉｎｏｓａのＹＭブロス及びヒト末梢血への添加検体並びにＣａｎｄｉｄａ菌種のＹＭブロスへの添加検体では、添加した菌数と同程度の菌数が測定されたが、Ｃａｎｄｉｄａ菌種のヒト末梢血への添加検体では、０．５ｍｍのジルコニア／シリカビーズを使用した際には、添加した菌数の１／３程度の菌数しか測定されず（比較例３）、一方で、１．０ｍｍ及び２．５ｍｍ径のジルコニア／シリカビーズを用いた菌体破砕では、添加菌数と同程度の菌数が測定された（実施例３及び４）。以上より、ヒト血液において真菌であるＣａｎｄｉｄａ菌種の菌体破砕に１．０〜２．５ｍｍ径のジルコニア／シリカビーズを用いた場合にも、特異的に菌体破砕効率が上がることが分かった。
実施例５ Ｃａｎｄｉｄａ属５菌種特異的プライマーを用いたヒト末梢血への菌体添加回収試験
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＩＦＯ １３８５Ｔ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ ＪＣＭ １５４１Ｔ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ ＤＳＭ ５７８４Ｔ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａＪＣＭ ３７６１Ｔ、Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ ＩＦＯ １２７９Ｔ及び実験の陽性コントロールとしてのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ１０１４５Ｔ純培養菌体を、健常成人３名（Blood A, Blood B, Blood C）より採取したヒト末梢血及びＹＭブロスへ１ｍＬあたり１０５、１０４、１０３、１０２、１０１ｃｅｌｌｓとなるように添加した。実施例１と同様に、菌体を添加した検体について、１．０ｍｍ径のガラスビーズを用いた菌体破砕を行い、核酸を抽出した。抽出した核酸について、ＲＴ−ｑＰＣＲ法により菌数を測定し、横軸に添加菌数を、縦軸にＲＴ−ｑＰＣＲ法により得た測定菌数をプロットした（図２）。検討した全ての菌株について、ヒト末梢血に菌体を添加した場合において、１０１から１０５ｃｅｌｌｓ/ｍＬの範囲で直線性が認められ、その近似式は異なる被験者より採取した末梢血及びＹＭブロス間でほぼ一致していた。以上の結果より、１．０ｍｍ径のガラスビーズ及びＣａｎｄｉｄａ属５菌種特異的プライマーを用いることにより、ヒト末梢血中のＣａｎｄｉｄａ属５菌種を正確に定量可能であると考えられた。
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＩＦＯ １３８５Ｔ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ ＪＣＭ １５４１Ｔ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ ＤＳＭ ５７８４Ｔ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａＪＣＭ ３７６１Ｔ、Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ ＩＦＯ １２７９Ｔ及び実験の陽性コントロールとしてのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ１０１４５Ｔ純培養菌体を、健常成人３名（Blood A, Blood B, Blood C）より採取したヒト末梢血及びＹＭブロスへ１ｍＬあたり１０５、１０４、１０３、１０２、１０１ｃｅｌｌｓとなるように添加した。実施例１と同様に、菌体を添加した検体について、１．０ｍｍ径のガラスビーズを用いた菌体破砕を行い、核酸を抽出した。抽出した核酸について、ＲＴ−ｑＰＣＲ法により菌数を測定し、横軸に添加菌数を、縦軸にＲＴ−ｑＰＣＲ法により得た測定菌数をプロットした（図２）。検討した全ての菌株について、ヒト末梢血に菌体を添加した場合において、１０１から１０５ｃｅｌｌｓ/ｍＬの範囲で直線性が認められ、その近似式は異なる被験者より採取した末梢血及びＹＭブロス間でほぼ一致していた。以上の結果より、１．０ｍｍ径のガラスビーズ及びＣａｎｄｉｄａ属５菌種特異的プライマーを用いることにより、ヒト末梢血中のＣａｎｄｉｄａ属５菌種を正確に定量可能であると考えられた。
実施例６ Ｃａｎｄｉｄａグループ特異的プライマーを用いたヒト末梢血への菌体添加回収試験
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓＩＦＯ １３８５Ｔ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓＪＣＭ １５４１Ｔ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ ＤＳＭ ５７８４Ｔ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ ＪＣＭ ３７６１Ｔ、Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ ＩＦＯ １２７９Ｔの各純培養菌体を、健常成人３名より採取したヒト末梢血（被験者Ａ、被験者Ｂ、被験者Ｃ）及びＹＭブロスへ、それぞれ１ｍＬあたり１０５、１０４、１０３、１０２、１０１ｃｅｌｌｓとなるように添加した（添加した総菌数は１ｍＬあたり、５×１０５、５×１０４、５×１０３、５×１０２、５×１０１ｃｅｌｌｓとなる）。菌体を添加した検体から実施例１と同様に菌体を添加した検体について、１．０ｍｍ径のガラスビーズを用いた菌体破砕を行い、核酸を抽出した。抽出した核酸について、ＲＴ−ｑＰＣＲ法により菌数を測定し、添加菌数を横軸に、ＲＴ−ｑＰＣＲ法により得た測定菌数を縦軸にプロットした（図３）。ヒト末梢血に菌体を添加した場合において、１０１から１０５ｃｅｌｌｓ/ｍＬの範囲で直線性が認められ、その近似式は異なる被験者より採取した末梢血及びＹＭブロス間でほぼ一致していた。以上の結果より、１．０ｍｍ径のガラスビーズ及びＣａｎｄｉｄａグループ特異的プライマーを用いることにより、ヒト末梢血中のＣａｎｄｉｄａ属を正確に定量可能であると考えられた。
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓＩＦＯ １３８５Ｔ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓＪＣＭ １５４１Ｔ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ ＤＳＭ ５７８４Ｔ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ ＪＣＭ ３７６１Ｔ、Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ ＩＦＯ １２７９Ｔの各純培養菌体を、健常成人３名より採取したヒト末梢血（被験者Ａ、被験者Ｂ、被験者Ｃ）及びＹＭブロスへ、それぞれ１ｍＬあたり１０５、１０４、１０３、１０２、１０１ｃｅｌｌｓとなるように添加した（添加した総菌数は１ｍＬあたり、５×１０５、５×１０４、５×１０３、５×１０２、５×１０１ｃｅｌｌｓとなる）。菌体を添加した検体から実施例１と同様に菌体を添加した検体について、１．０ｍｍ径のガラスビーズを用いた菌体破砕を行い、核酸を抽出した。抽出した核酸について、ＲＴ−ｑＰＣＲ法により菌数を測定し、添加菌数を横軸に、ＲＴ−ｑＰＣＲ法により得た測定菌数を縦軸にプロットした（図３）。ヒト末梢血に菌体を添加した場合において、１０１から１０５ｃｅｌｌｓ/ｍＬの範囲で直線性が認められ、その近似式は異なる被験者より採取した末梢血及びＹＭブロス間でほぼ一致していた。以上の結果より、１．０ｍｍ径のガラスビーズ及びＣａｎｄｉｄａグループ特異的プライマーを用いることにより、ヒト末梢血中のＣａｎｄｉｄａ属を正確に定量可能であると考えられた。
Claims (6)
- カンジダ属真菌を含む生体試料から当該真菌のＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得る核酸断片を用いて核酸増幅反応を行う、生体試料中のカンジダ属真菌の定量方法であって、
ＲＮＡの抽出が、真菌を含む試料溶液を直径１ｍｍ〜２．５ｍｍのビーズと接触させて撹拌した後、ＲＮＡを分離することを特徴とする、方法。 - カンジダ属真菌が、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・トロピカリス及びカンジダ・クルーセイから選ばれる１以上である、請求項１記載の方法。
- ビーズがガラスビーズ又はジルコニア／シリカビーズである、請求項１又は２記載の方法。
- 生体試料がヒト血液である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
- 核酸断片が、配列番号１〜１２で示される塩基配列からなる核酸断片又はそれと相補的な塩基配列からなる核酸断片である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
- 直径１ｍｍ〜２．５ｍｍのビーズ及び真菌のＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得る核酸断片を含み、核酸抽出試薬、核酸増幅反応試薬及びプロトコールから選ばれる１種以上を含んでもよい、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法を実施するためのキット。
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
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| JP2014090149 | 2014-04-24 | ||
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Publications (2)
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|---|---|
| JPWO2015163449A1 JPWO2015163449A1 (ja) | 2017-04-20 |
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ID=54332609
Family Applications (1)
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