CN112646804A - 一种提取土壤中环境dna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物学分析技术领域，具体涉及一种提取土壤中环境DNA的方法，包括破壁以及提纯步骤。通过对提取过程中的水浴加热时间、旋涡震荡时间以及离心时间等操作参数进行限定，从而实现可以在较低的离心转速下提取出环境DNA，从而可以处理高达5g的土壤样本，增大样本处理量，且最终提取的环境DNA的纯度和产量较高，提取成本低。

Description

一种提取土壤中环境DNA的方法
技术领域
本发明涉及生物学分析技术领域，具体涉及一种提取土壤中环境DNA的方法。
背景技术
环境DNA是指在环境样品中所有被发现的不同生物的基因组DNA的混合，是一种近年来新兴出现的一种用于生态环境监测的方法。相比于传统的通过捕捉某种生物来获得环境中的物种信息的监测方法，环境DNA的检测方式是通过采集环境样本、提取DNA，再进行PCR扩增以及测序而获取相关信息的，对环境更加友好，且由于其监测频率低、采样简单、监测结果准确，因此已被广泛应用于生态监测中。
目前，对环境DNA进行提取的主要方法是使用商用试剂盒进行提取。商用试剂盒提取环境DNA的优点是提取DNA快捷方便，但缺点是其在提纯过程中对离心转速要求较高，一般要求在12000转/分以上，且提取成本较高。因此，商用试剂盒通常只能对0.5g以下的样本进行提取。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的使用商用试剂盒提取环境DNA时可处理样本量小的缺陷，从而提供一种提取土壤中环境DNA的方法。
为解决上述技术问题，本发明所提供的技术方案为：
一种提取土壤中环境DNA的方法，包括以下步骤：
破壁：将x g土壤样品与2x ml的CTAB缓冲溶液混合后在2500-3000rpm下旋涡震荡30s，然后在60℃下水浴20-30min，得到土壤/CTAB混合物；然后往土壤/CTAB混合物中加入3x ml体积比为24：1的氯仿-异戊醇溶液，并在2500-3000rpm下震荡混合3-5分钟，得到土壤/CTAB/氯仿-异戊醇混合物；将土壤/CTAB/氯仿-异戊醇混合物在室温下于10000-12000rpm下离心15-20分钟，然后分离，得到水相和有机相；
提纯：往水相中加入与水相等体积的异丙醇和二分之一水相体积的浓度为5M的氯化钠，然后在-20℃下冷却至少一个小时；冷却后，在6℃下，在10000-12000rpm下离心15-20分钟并分离，得到固相，干燥，得DNA颗粒；将得到的DNA颗粒溶于100μL的pH为8的Tris-EDTA缓冲液中，得到DNA提取液。
可选的，所述CTAB缓冲溶液按照如下步骤配制得到：
将100mM pH为8的Tris-HCL、1.4M氯化钠、1％(wt./vol.)pH为8，分子量为360000的聚乙烯吡咯烷酮、2％(wt./vol.)十六烷基三甲基溴化铵、20mM pH为8的EDTA混合均匀，得到CTAB缓冲溶液。
可选的，所述土壤样品为地表表层土壤样品或水体环境的底泥沉积物样品。
可选的，在所述提纯步骤中还包括在离心后用1ml 70％的乙醇溶液对离心管内壁进行冲洗，然后在6℃、10000rpm下离心两分钟以收集残留DNA的步骤。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的提取土壤中环境DNA的方法，通过对提取过程中的水浴加热时间、旋涡震荡时间以及离心时间等操作参数进行限定，从而实现可以在较低的离心转速下提纯出环境DNA，降低了提纯步骤对离心转速的要求，进而使得可以处理高达5g的土壤样本，增大了样本处理量，且最终提取的环境DNA的纯度和产量较高，提取成本低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的实施例1中的提取的DNA的吸光度图；
图2为本发明的实施例2中的提取的DNA的吸光度图；
图3为本发明的实施例1中的提取的DNA的PCR扩增产物凝胶电泳图；
图4为本发明的实施例2中的提取的DNA的PCR扩增产物凝胶电泳图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
实施例1
本实施例涉及一种提取土壤中环境DNA的方法，包括以下步骤：
样本预处理：将5g土壤样品进行去腐预处理；
破壁：将10ml的CTAB缓冲液加入到含有5g经去腐预处理后的土壤样品的锥形管中，以2500rpm速率旋涡震荡混合30s，之后60℃水浴30min，得到土壤/CTAB混合物，然后往土壤/CTAB混合物中加入15ml体积比为24：1的氯仿-异戊醇溶液，并在旋涡混合器中以2500rpm速率震荡混合5分钟，得到土壤/CTAB/氯仿-异戊醇混合物；将土壤/CTAB/氯仿-异戊醇混合物在室温下于10000rpm下离心20分钟，然后在不接触中间层的情况下，小心将水相转移至一个新的锥形离心管中，得到水相和有机相。
提纯：往水相中加入与水相等体积的异丙醇(预先在-20℃下冷却)和二分之一水相体积的浓度为5M的氯化钠，然后在-20℃下冷却至少一个小时；冷却后，在6℃下，以10000rpm离心20分钟并分离，得到固相，干燥，得DNA颗粒。将得到的DNA颗粒溶于100μL的Tris-EDTA缓冲液(pH 8，Thermo Fisher Scientific，美国)中，得到DNA提取液。
其中，CTAB缓冲液配制为：100mm Tris-HCL(pH＝8,WAKO，日本)、1.4M NaCl(WAKO，日本)、1％(wt./vol.)聚乙烯吡咯烷酮(分子量:360,000,pH 8,SIGMA-ALDRICH，美国)、2％(wt./vol.)十六烷基三甲基溴化铵(CTAB,WAKO，日本)、20mM EDTA(pH＝8，日本WAKO)。
其中提纯步骤中，在离心后，还可用1ml70％的乙醇溶液对离心管内壁进行冲洗，然后在6℃、10000rpm下离心两分钟从而将离心管壁上残留的DNA提取完全，冲洗步骤可重复。
实施例2
本实施例涉及一种提取土壤中环境DNA的方法，包括以下步骤：
样本预处理：将2.5g土壤样品进行去腐预处理；
破壁：将5ml的CTAB缓冲液加入到含2.5g经去腐预处理后的土壤样品的锥形管中，以3000rpm速率旋涡震荡混合30s，之后60℃水浴30min，得到土壤/CTAB混合物，然后往土壤/CTAB混合物中加入7.5ml体积比为24：1的氯仿-异戊醇溶液，并在旋涡混合器中以3000rpm速率震荡混合3分钟，得到土壤/CTAB/氯仿-异戊醇混合物；将土壤/CTAB/氯仿-异戊醇混合物在室温下于12000rpm下离心15分钟，然后在不接触中间层的情况下，小心将水相转移至一个新的锥形离心管中，得到水相和有机相。
提取：往水相中加入与水相等体积的异丙醇(预先在-20℃下冷却)和二分之一水相体积的浓度为5M的氯化钠，然后在-20℃下冷却至少一个小时；冷却后，在6℃下，以12000rpm离心15分钟并分离，得到固相，干燥，得DNA颗粒。将得到的DNA颗粒溶于50μL的Tris-EDTA缓冲液(pH 8，Thermo Fisher Scientific，美国)中，得到DNA提取液。
其中，CTAB缓冲液配制为：100mm Tris-HCL(pH＝8,WAKO，日本)、1.4M NaCl(WAKO，日本)、1％(wt./vol.)聚乙烯吡咯烷酮(分子量:360,000,pH 8,SIGMA-ALDRICH，美国)、2％(wt./vol.)十六烷基三甲基溴化铵(CTAB,WAKO，日本)、20mM EDTA(pH＝8，日本WAKO)。
其中提取步骤中，在离心后，还可用1ml70％的乙醇溶液对离心管内壁进行冲洗，然后在6℃、10000rpm下离心两分钟从而将离心管壁上残留的DNA提取完全，冲洗步骤可重复。
可行性评价
实验土壤：取天津近河口沿岸附近土壤样品，采集深度：0-10cm
环境DNA检测目标物种为日本大螯蜚(Grandidierella japonica)。设置5个采集区域，每个区域各采集一个土壤样品，共采集5个土壤样品。根据采集区域，分别将样品标记为分别为A、B、C、D、M。土壤样品的部分理化性质见表1。
表1样品含水率、有机质含量
样品编号 含水率 有机质含量
A 28％ 2.6％
B 35％ 4.2％
C 27％ 3.0％
D 38％ 4.5％
M 33％ 3.6％
实验方法：按照实施例1-2提供的环境DNA提取方法对土壤样品的环境DNA进行提取，并将提取后的DNA进行纯度和浓度分析，每个土壤样品做3次重复实验，A11、A12、A13为A点位重复样品，其余样品同理。
DNA纯度分析所用仪器为NanoDrop-1000(ThermoFisher Scientific,美国)，在波长分别为260nm和280nm的情况下对提取的DNA进行纯度检测。DNA浓度由Qubit 3.0荧光计(ThermoFisher Scientific,美国)和dsDNA HS检测试剂盒进行测量。
图1为按照实施例1中的方法提取的各点位样品DNA吸光度图，图2为按照实施例2中的方法提取的各点位样品DNA吸光度图，表2为按照实施例1中的方法提取的各点位样品DNA吸光度与纯度结果，表3为按照实施例2中的方法提取的各点位样品DNA吸光度与纯度结果。
表2.实施例1提取各点位样品DNA吸光度分析表(土壤样品质量为5g)
样品ID ng/ul A260 A280 260/280 260/230
A11 66.84 1.337 0.685 1.95 2.18
A11 87.75 1.755 0.867 2.02 2.85
A12 92.26 1.845 0.909 2.03 2.44
A13 90.03 1.801 0.902 2.00 2.02
B11 81.96 1.639 0.837 1.96 2.13
B12 66.73 1.335 0.676 1.97 2.22
B13 85.4 1.708 0.855 2.00 2.20
C11 110.31 2.206 1.093 2.02 2.41
C12 97.48 1.950 0.98 1.99 2.49
C12 120.21 2.404 1.18 2.04 2.38
D11 158.72 3.174 1.582 2.01 2.14
D12 153.75 3.075 1.53 2.01 2.26
D13 153.89 3.078 1.517 2.03 2.23
M11 153.36 3.067 1.507 2.04 2.19
M12 73.85 1.477 0.745 1.98 2.20
M13 64.64 1.293 0.665 1.94 2.19
空白对照 -0.06 -0.001 0.017 -0.06 0.07
由表2可知，各点位的OD值260/280均为2.0左右，OD值260/230均大于2，表明提取的DNA纯度较好；DNA浓度均在60ng/ul以上，浓度较高。
将实施例1提取的DNA进行PCR扩增后，将PCR扩增产物进行凝胶电泳。电泳图如图3所示，其中多数产物的条带清晰可见，扩增产物长度约为126bp，与引物扩增子设计长度相吻合。说明PCR结果良好，证明按照实施例1的方法提取的DNA可进行下一步分子生物学分析。
表3.实施例2各点位样品DNA吸光度分析表(土壤样品质量为2.5g)
样品ID ng/ul A260 A280 260/280 260/230
A11 130.10 2.60 1.29 2.02 2.77
A12 85.63 1.71 0.85 2.02 3.02
A13 96.91 1.94 0.94 2.07 2.80
B11 131.67 2.63 1.33 1.98 3.05
B12 105.60 2.11 1.03 2.05 3.15
B13 100.89 2.02 0.98 2.06 3.16
C11 113.39 2.27 1.11 2.04 3.19
C12 131.52 2.63 1.26 2.08 3.28
C12 115.96 2.32 1.10 2.10 3.31
D11 145.92 2.92 1.42 2.06 2.92
D12 172.78 3.46 1.68 2.05 3.15
D13 152.22 3.04 1.49 2.04 2.73
M11 121.23 2.43 1.17 2.08 2.94
M12 87.16 1.74 0.83 2.10 3.35
M13 81.95 1.64 0.77 2.14 3.54
空白对照 -2.21 -0.04 -0.06 0.75 0.64
由表3可知，各点位的OD值260/280均为2.0左右，OD值260/230均大于2，表明提取的DNA纯度较好；DNA浓度均在60ng/ul以上，浓度较高。
将实施例2提取的DNA进行PCR扩增后，将PCR扩增产物进行凝胶电泳。电泳图如图4所示，其中多数产物的条带清晰可见，扩增产物长度约为126bp，与引物扩增子设计长度相吻合。说明PCR结果良好，证明按照实施例2提供的方法提取的DNA可进行下一步分子生物学分析。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (4)

1.一种提取土壤中环境DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
破壁：将x g土壤样品与2x ml的CTAB缓冲溶液混合后在2500-3000rpm下旋涡震荡30s，然后在60℃下水浴20-30min，得到土壤/CTAB混合物；然后往土壤/CTAB混合物中加入3x ml体积比为24：1的氯仿-异戊醇溶液，并在2500-3000rpm下震荡混合3-5分钟，得到土壤/CTAB/氯仿-异戊醇混合物；将土壤/CTAB/氯仿-异戊醇混合物在室温下于10000-12000rpm下离心15-20分钟，然后分离，得到水相和有机相；
提纯：往水相中加入与水相等体积的异丙醇和二分之一水相体积的浓度为5M的氯化钠，然后在-20℃下冷却至少一个小时；冷却后，在6℃下，在10000-12000rpm下离心15-20分钟并分离，得到固相，干燥，得DNA颗粒；将得到的DNA颗粒溶于100μL的pH为8的Tris-EDTA缓冲液中，得到DNA提取液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CTAB缓冲溶液按照如下步骤配制得到：
将100mM pH为8的Tris-HCL、1.4M氯化钠、1％(wt./vol.)pH为8，分子量为360000的聚乙烯吡咯烷酮、2％(wt./vol.)十六烷基三甲基溴化铵、20mM pH为8的EDTA混合均匀，得到CTAB缓冲溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述土壤样品为地表表层土壤样品或水体环境的底泥沉积物样品。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，在所述提纯步骤中还包括在离心后用1ml 70％的乙醇溶液对离心管内壁进行冲洗，然后在6℃、10000rpm下离心两分钟以收集残留DNA的步骤。
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