JP4469338B2 - 臨床検体中の病原性マイコバクテリアを検出する方法 - Google Patents
臨床検体中の病原性マイコバクテリアを検出する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4469338B2 JP4469338B2 JP2005511650A JP2005511650A JP4469338B2 JP 4469338 B2 JP4469338 B2 JP 4469338B2 JP 2005511650 A JP2005511650 A JP 2005511650A JP 2005511650 A JP2005511650 A JP 2005511650A JP 4469338 B2 JP4469338 B2 JP 4469338B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- pcr
- dna
- mycobacteria
- clinical
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 89
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 title claims description 49
- 239000002585 base Substances 0.000 claims description 30
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 27
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 27
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 19
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 18
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 claims description 18
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 18
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 claims description 17
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 15
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims description 14
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 8
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 claims description 7
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000007862 touchdown PCR Methods 0.000 claims description 7
- BMYCCWYAFNPAQC-UHFFFAOYSA-N 2-[dodecyl(methyl)azaniumyl]acetate Chemical group CCCCCCCCCCCCN(C)CC(O)=O BMYCCWYAFNPAQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims description 6
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 claims description 6
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000005202 decontamination Methods 0.000 claims description 5
- 230000003588 decontaminative effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000003172 expectorant agent Substances 0.000 claims description 4
- 229940066491 mucolytics Drugs 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 claims description 3
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 78
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 74
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 63
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 32
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 31
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 28
- 239000000047 product Substances 0.000 description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 22
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 21
- 241000894007 species Species 0.000 description 20
- 101150024128 mmaA1 gene Proteins 0.000 description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 17
- 101100023550 Mycobacterium bovis (strain ATCC BAA-935 / AF2122/97) cmaD gene Proteins 0.000 description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 101150084640 mmaA2 gene Proteins 0.000 description 13
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 12
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 11
- 101100023554 Mycobacterium bovis (strain ATCC BAA-935 / AF2122/97) cmaC gene Proteins 0.000 description 10
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 10
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 9
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 9
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 7
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 5
- 230000034994 death Effects 0.000 description 5
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 5
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 5
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 5
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241000186367 Mycobacterium avium Species 0.000 description 3
- 101100077242 Mycobacterium bovis (strain ATCC BAA-935 / AF2122/97) cmaA gene Proteins 0.000 description 3
- 241000186364 Mycobacterium intracellulare Species 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- 101150090383 mmaA4 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 3
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 2
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 2
- 241001467553 Mycobacterium africanum Species 0.000 description 2
- 241000187919 Mycobacterium microti Species 0.000 description 2
- 241000187490 Mycobacterium scrofulaceum Species 0.000 description 2
- 241001302239 Mycobacterium tuberculosis complex Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010042566 Superinfection Diseases 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 238000009583 bone marrow aspiration Methods 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- AAIWMXAOKUXQTP-VYWHOSGGSA-N (2R)-2-[(1R)-1-hydroxy-18-{(1R,2S)-2-[(17S,18S)-17-methoxy-18-methylhexatriacontyl]cyclopropyl}octadecyl]hexacosanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](C(O)=O)[C@H](O)CCCCCCCCCCCCCCCCC[C@@H]1C[C@@H]1CCCCCCCCCCCCCCCC[C@H](OC)[C@@H](C)CCCCCCCCCCCCCCCCCC AAIWMXAOKUXQTP-VYWHOSGGSA-N 0.000 description 1
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- CVOFKRWYWCSDMA-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-(2,6-diethylphenyl)-n-(methoxymethyl)acetamide;2,6-dinitro-n,n-dipropyl-4-(trifluoromethyl)aniline Chemical compound CCC1=CC=CC(CC)=C1N(COC)C(=O)CCl.CCCN(CCC)C1=C([N+]([O-])=O)C=C(C(F)(F)F)C=C1[N+]([O-])=O CVOFKRWYWCSDMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 3,7-bis(dimethylamino)phenothiazin-5-ium Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 206010006049 Bovine Tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- JUQPZRLQQYSMEQ-UHFFFAOYSA-N CI Basic red 9 Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC=C1C(C=1C=CC(N)=CC=1)=C1C=CC(=[NH2+])C=C1 JUQPZRLQQYSMEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 206010013453 Disseminated tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 208000034454 F12-related hereditary angioedema with normal C1Inh Diseases 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010027259 Meningitis tuberculous Diseases 0.000 description 1
- 201000006836 Miliary Tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 description 1
- 241000187478 Mycobacterium chelonae Species 0.000 description 1
- 241000186365 Mycobacterium fortuitum Species 0.000 description 1
- 241000187492 Mycobacterium marinum Species 0.000 description 1
- 241000187481 Mycobacterium phlei Species 0.000 description 1
- 241000187480 Mycobacterium smegmatis Species 0.000 description 1
- 241000187496 Mycobacterium szulgai Species 0.000 description 1
- 101100023553 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) mmaA1 gene Proteins 0.000 description 1
- DIFYYTDHSDUGDI-UHFFFAOYSA-N NC(N)=N.N=C=S.OC1=CC=CC=C1.OC1=CC=CC=C1.OC1=CC=CC=C1 Chemical compound NC(N)=N.N=C=S.OC1=CC=CC=C1.OC1=CC=CC=C1.OC1=CC=CC=C1 DIFYYTDHSDUGDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108010066717 Q beta Replicase Proteins 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 208000022971 Tuberculous meningitis Diseases 0.000 description 1
- 108010064978 Type II Site-Specific Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 208000033354 avian tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940052223 basic fuchsin Drugs 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940072185 drug for treatment of tuberculosis Drugs 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002360 explosive Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000016861 hereditary angioedema type 3 Diseases 0.000 description 1
- 238000007849 hot-start PCR Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 208000001223 meningeal tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 208000008128 pulmonary tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- PVGBHEUCHKGFQP-UHFFFAOYSA-N sodium;n-[5-amino-2-(4-aminophenyl)sulfonylphenyl]sulfonylacetamide Chemical compound [Na+].CC(=O)NS(=O)(=O)C1=CC(N)=CC=C1S(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=C1 PVGBHEUCHKGFQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008279 sol Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- SOBHUZYZLFQYFK-UHFFFAOYSA-K trisodium;hydroxy-[[phosphonatomethyl(phosphonomethyl)amino]methyl]phosphinate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OP(O)(=O)CN(CP(O)([O-])=O)CP([O-])([O-])=O SOBHUZYZLFQYFK-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
(a)従来の方法により粘液を含む汚染物質から臨床検体を浄化するステップと、
(b)生きている病原性マイコバクテリアを不活性化し、プロセスをユーザにとって安全なものにするために、ステップ(a)で得た処理済臨床検体を改変溶解緩衝液で処理するステップと、
(c)DNAの収量と質を高めるように改変された方法を用いて、ステップ(b)から得た処理済臨床検体からゲノムDNAを抽出するステップと、
(d)病原性マイコバクテリアの特異的な検出のためにステップ(c)で得たDNAから配列番号4の配列を設計するステップであって、前記設計された配列はステップ(c)で得たDNAの配列番号3の選択された遺伝子間領域ならびに配列番号1の遺伝子mmaA1の一部および配列番号2の遺伝子mmaA2の一部を含む隣接領域から構成されるステップと、
(e)配列番号4のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅のために、フォワードプライマーである配列番号5およびリバースプライマーである配列番号6の一組の特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、合成するステップと、
(f)ステップ(d)の配列番号4を特異的に増幅するためのPCR増幅プロセスを構築するステップであって、前記プロセスは臨床検体中の病原性マイコバクテリアの存在を検出するためにステップ(e)で設計および合成された特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いることを含むステップと、
(g)HIV重感染の迅速な評価のために病原性マイコバクテリアの種を分類するために、制限断片長多型(RFLP)分析により増幅されたPCR産物を分析するステップ。
5’GAGGTGTAATGCCTTTCCGGACCCTAGGTGGCCTTTCGGTGCTTGCACGGAACGCACCGATGCTTCCCCCTCCCCGCATGCTCGAGGCATGCTATCCGATACAGGGCCGCCGCACTAAACCGCGATCGAATTTGCCCAGGTCAGGGAACGGATATGAGCGGACGAG3’
a.フォワードプライマーである、5’TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG3’(配列番号5)
a.リバースプライマーである、5’GGAATTCCACTACCACGGACTCTC3’(配列番号6)
(a)フォワードプライマーである、5’TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG3’(配列番号5)
(b)リバースプライマーである、5’GGAATTCCACTACGCACGGACTCTC3’(配列番号6)
a.DNAの収量と質を高めるように改変された方法を用いて、処理済臨床検体からゲノムDNAを抽出するステップと、
b.病原性マイコバクテリアの特異的な検出のためにステップ(a)で得たDNAから配列番号4の配列を設計するステップであって、前記設計された配列はステップ(a)で得たDNAの配列番号3の選択された遺伝子間領域ならびに配列番号1の遺伝子mmaA1の一部および配列番号2の遺伝子mmaA2の一部を含む隣接領域から構成されるステップと、
c.ステップ(b)の配列番号4を特異的に増幅するためのPCR増幅プロセスを構築するステップと、
d.HIV重感染の迅速な評価のために病原性マイコバクテリアの種を区別するために、制限断片長多型(RFLP)分析により増幅されたPCR産物を分析するステップ。
5’GAGGTGTAATGCCTTTCCGGACCCTAGGTGGCCTTTCGGTGCTTGCACGGAACGCACCGATGCTTCCCCCTCCCCGCATGCTCGAGGCATGCTATCCGATACAGGGCCGCCGCACTAAACCGCGATCGAATTTGCCCAGGTCAGGGAACGGATATGAGCGGACGAG3’
トリス塩基、N−アセチル−L−システイン(NALC)、エチジウムブロマイド、アガロース、K2HPO4、KH2PO4、クエン酸ナトリウム、N−ラウリルサルコシル、EDTA、2−メルカプトエタノールは、シグマ・アルドリッチ社(米国)から購入した。サーモポリメラーゼおよびdNTPsは、ニュー・イングランド・バイオラボ社(米国)から入手した。プラスチック製品は、アキシジェン社(米国)およびコーニング−コースター社(米国)から入手した。
臨床検体は、ラーマクリシュナ・ミッションフリー結核診療所(カロルバーグ、ニューデリー、インド)において、患者からの142の唾液検体と1の脳脊髄液検体を殺菌した検体ボトルに得た。試料は、可能な場合は即座に処理し、または処理前に4℃で一晩保存した。
試料はNALC−NaOH法で処理した。約1〜3mlの唾液をスクリューキャップ付きの15ml遠心管(コーニング−コースター社、米国)に移した。各試料に1〜3mlの消化除染緩衝液を加え、静かに混合し、室温で15分間静置した。試料を3倍量の0.67Mリン酸緩衝液(pH6.8)で希釈し、スイングアウトローター(レミ・セントリフュージ社、インド)を用いて3500gで15分間遠心分離した。沈殿物を300μlの滅菌蒸留水中に再懸濁した。処理した試料の3分の1を必要であれば培養に使用し、残りの3分の2をPCRに使用した。PCR用に取り分けた部分は、不活性化した後、0.5mlの溶解緩衝液を試験管に添加し、85℃で20分間加熱することで溶解させた。
脳脊髄液(CSF)は、通常無菌であると考えられるので、消化および除染をする必要はない。1〜2mlの脳脊髄液(CSF)をマイクロ遠心チューブ(MCT)に移し、マイクロ遠心分離機(エッペンドルフ社、ドイツ)を用いて12000gで3分間遠心分離した。沈殿物を0.067Mリン酸緩衝液(pH7.0)で洗浄し、300μlの滅菌蒸留水中に再懸濁した。全ての試料をPCRに使用した。
染料として塩基性フクシン(basic fuschin)を使用し、Zeihl-Neelsenの染色手順により抗酸性染色を行った。唾液の粘液部分の一部を1×2cmの面に塗布した。塗布物を短時間熱定着した後、塩基性フクシン染料に浸し、ブンゼンバーナーで短時間加熱した。95%エタノールに3%の硫酸を含む酸アルコールを用いて脱色した。スライドを蒸留水で洗浄後、メチレンブルー(0.3%塩化メチレンブルー)で1〜2分間対比染色した。水で洗い流し、空気乾燥させた。スライドを400×の油浸対物レンズの下に置き、双眼顕微鏡(ツァイス、ドイツ)で観察した。塗布物をWHOのガイドラインに沿って評価した。
消化および浄化した試料の一部(200μl)をマイクロ遠心チューブへ移した。4Mのグアニジンイソチオシアネート、50mMのトリス.Cl(pH8.0)、1%のN−ラウリルサルコシル、1mMのEDTA、10mMの2−メルカプトエタノールおよび0.2MのNaClを含む500μlの改変溶解緩衝液を加え、転倒混和した。遠心チューブを断続的に振とうしながら85℃で20分間インキュベートし、細胞を溶解した。溶解物に200μlの2.5M酢酸アンモニウム(pH7.6)を添加し、転倒混和した。混合物を12000gで5分間遠心分離した。フェノールとクロロホルムを用いて上清を一度抽出した。0.8倍量のイソプロピルアルコールを用いてDNAを沈降した。沈殿物を70%エチルアルコールで完全に洗浄し、短時間空気乾燥させた後、30μlのTE緩衝液(10mMのトリス.Cl(pH8.3)および0.01mMのEDTA(pH8.0))に溶解し、このうちの2μlをPCR増幅に使用した。
病原性マイコバクテリアの必須遺伝子(essential gene)の一部を増幅する2つのオリゴヌクレオチドプライマーを、プライマー選択ソフトウェア(レーザージーン社のソフトウェア「DNAスター」)を使用して設計した。ミコール酸メチルシンターゼは、mmaA1〜mmaA4の4つの遺伝子の遺伝子群である。これらの遺伝子は、ミコール酸の合成と修飾にかかわっており、病原性マイコバクテリアにのみ存在することが報告されている。フォワードプライマーの11塩基対はmmaA1とmmaA2との間の遺伝子間領域にあり、一方リバースプライマーはミコール酸メチルシンターゼ1遺伝子(mmaA1)内に位置する。これらのプライマーについて、当センターのバイオインフォマティックス部門が開発したソフトウェア「ゲノム・カルキュレーター」を使ってマイコバクテリアに対する特異性をチェックした。フォワードオリゴヌクレオチドプライマーである配列番号5の配列は、長さ27塩基対である。リバースプライマーである配列番号6の配列は、長さ25塩基対である。フォワードプライマーAはmmaA2遺伝子の1〜9番目の塩基に位置し、このオリゴヌクレオチドプライマーの11塩基対はmmaA2遺伝子とmmaA1遺伝子との間の167塩基対のスペーサー領域に存在する。リバースプライマーDである配列番号2の配列は、mmaA1遺伝子内の688〜705番目の塩基に位置する(図1および図2)。プライマー配列は、5’末端にBamHI制限エンドヌクレアーゼ部位を含む7塩基対の突出部を有する。オリゴヌクレオチドプライマーDも、5’末端にEcoRI部位を含む7塩基対の突出部を有する。これらのプライマーは、病原性マイコバクテリアの必須遺伝子のADと呼ばれる373塩基対の領域を特異的に増幅する。
5’TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG3’
リバースプライマー:配列番号6
5’GGAATTCCACTACGCACGGACTCTC3’
PCR反応は、上記調製により得られた2.0μlのDNA、50mMのKCl、10mMのトリス.Cl(pH8.3)、1.5mMのMgCl2、10ピコモルの各オリゴヌクレオチドプライマーおよび1単位のサーモポリメラーゼを含む20μlの反応量で行った。反応は2回行い、2回目は上記DNAの10倍希釈液を2.0μl用いて行った。
タッチダウンPCR法は、非特異的増幅を抑制するのに有効な方法であり、PCR反応の収率と効率を高めることができる。タッチダウン法では、所定のTm(融解温度)よりわずかに高い温度でオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングし、所望のアニーリング温度になるまでアニーリング温度Tmをサイクルごとに下げてゆく。この方法は、初期サイクル中における非特異的な産物の確立させず、PCR反応の効率を何倍も向上させるだけでなく特異的な増幅の促進に寄与する。
このプログラムでは、95℃で3分間の初期変性に続き、タッチダウンサイクルを14サイクル行った。各タッチダウンサイクルでは、94℃で45秒間の変性;70℃で開始し、サイクルごとに0.8℃ずつ下がる、45秒間のアニーリング;72℃で1分間の伸長;を行った。タッチダウンに続き、94℃で45秒間の変性;58℃で45秒間のアニーリング;72℃で1分間の伸長;のサイクルを25サイクル行った。
増幅PCR産物は、アガロースゲルを用いた電気泳動により分析された。PCR産物を1.0μlの6×ゲルローディングバッファーと混合した後、混合物を1.8%アガロースゲルに乗せた。1×TAE緩衝液(0.04Mのトリス酢酸および0.001MのEDTA)中でゲルを調製し、電気泳動した。電気泳動の後、0.5μg/mlのエチジウムブロマイドを含む染色液中でゲルを染色した。イーグルアイゲル撮影システム(Eagle eye gel documentation system:ストラタジーン)を使って、ゲルを撮影し、記録した。
臨床検体中の病原性マイコバクテリアのPCRベースの検出方法は、今まで説明したように様々なものがある。しかし、どの方法をとってもそれぞれに欠点があり、完璧なものはない。主な欠点は、臨床検体からのDNA抽出の段階にある。検出のために研究室に持ち込まれる臨床試料は、これまでに示された多くの方法でDNAとともに純化され、後に続く検出ステップを阻害する様々な不純物を含む。DNA分離の本発明の方法は、分離物を除去し、PCR用に純化されたDNAを提供する。この方法の別の利点は、病原性マイコバクテリアに特異的な標的DNA領域を特異的に増幅するようにオリゴヌクレオチドプライマーを選択する点である。プライマーのうちの一方はマイコバクテリアの必須遺伝子の間の遺伝子間領域に存在し、他方はマイコバクテリアの必須遺伝子内に位置するように、一組のプライマーを設計した。したがって、この一組のプライマーは、病原性マイコバクテリアに特異的であり、病原性マイコバクテリア由来のDNA領域を特異的に増幅することができ、従来のプライマーの多くで報告されたような他のマイコバクテリア由来のDNAを増幅しない。この方法の他の利点は、特異的な増幅を達成するために、ストリンジェントな条件下で標的配列をPCR増幅するための高価な試薬を使用しないことである。このような試薬は、検査のコストを増加させる。その代わり、この方法は、標的DNAの特異的増幅を達成するための独特なサイクル条件を使用する。その結果、検査のコストは約10〜20%削減される。この方法の別の利点は、遺伝子間領域とマイコバクテリアの二つの基幹遺伝子の隣接領域とを含む増幅DNAの独特な構成によるものである。このような構成は、病原性マイコバクテリアの様々な菌株の制限断片長多型(RFLP)に基づく分類のためには理想的なものである。この方法の別の利点は、検査の初めに臨床検体中の病原性マイコバクテリアを不活性化するステップを取り入れているため、ユーザにとって安全なプロセスになっていることである。
一般事項
出願人:CSIR
発明の名称:臨床検体中の病原性マイコバクテリアを検出する方法
配列数:06
住所:インド国,デリー−110007,モールロード,インスティテュート・オブ・ゲノミクス・アンド・インテグラティブ・バイオロジー(旧センター・フォー・バイオケミカル・テクノロジー)、電話番号00−91−11−7666158、Fax番号00−91−7667471
配列番号1の情報
1.配列の特徴:
1.配列の長さ:861塩基対
2.配列の型:DNA
5’CTACTTGGTCATGGTGAACTGGGCGACGTTGATTAGGCCTCTGCGGAAGCGCTCCGCGCATCCGGTCAGATAGTGCATGAAGTTGTTGTAGACCTCTTCGGACTGTACGGCGATGGCGCGTTCGCGGGCAGCCTGTAGGTTGGCGGCCCATGCATCGAGAGTCCGTGCGTAGTGCTGCTGCAGCAGCTGGACATGCTCGATGGTGAAGCCCGCGGCCTGCGCATTGTCGACAATGTCGGGCTCCGATGGCAGCTCGCCGCCCGGGAAGATCGACTCCCGCAGGAATTTGAGGAATCGAAGGTCGCTCATCGTCAGCGCAATGCCCTGTTCGTGCAGCCACCTGCGGTCGTAGGTGAACAGGCTGTGCAGTAGCATCCGCCCGTCATCGGGCAGGATGTCGTAGGAGCGTTCGAAGAACGTCAGATACCGCTCCTTTTTGAACGCGTCGAATGCCTCAAAGCTGACGATCCGGTCGACGTTCTCTTCAAACTCTTCCCAGCCCTGCAGCCGGGCCTCGGCGCGCCGTTGCGTTCCGATTGCGGCCAGGCGGTCTTTGCTGCGTTCATAGTGATTCCGGCTGAGCGTGAGGCCGATGACATTGACGTCGTACTTCTCCACGGCCCGAACGAGCGCCCCGCCCCACCCGCAACCCACGTCGAGTAGCGTCATCCCCGGTTCGAGGTTCAGCTTGTCCAACGCCAGATCCACCTTGGCCAGTTGCGCCTCTTCCAGCGTCATATCGTCACGCTCGAAATAGGCGCAGGTGTAGACCCAGGTGGGATCGAGGAACAACGCGAAGAAGTCATCCGAAATGTCGTAAGCCGACTGTGACTCTTCGTAATATGGTCTCAGCTTGGCCAT3’
3.生物名:マイコバクテリウム・テュバキュローシス
4.現時(IMMEDIATE):自然配列
5.配列の特徴を示す記号:mmaA1
6.配列番号1
配列番号2の情報
1.配列の特徴:
1.配列の長さ:864塩基対
2.配列の型:DNA
5’CTACTTCGCCAGCGTGAACTGGTTGACGTCGATGTAGCCGACCCGGAACAGCTTGGCGCAGCCGGTCAGGTATTTCATGTACCGCTCGTAGACCTCTTCGGACTGGATCGCGATGGCCTCGCTTTTGTGTTCCTGCAGCGCCTCGGCCCACAGGTCGAGGGTCCTGGCGTAATGCGGCTGCAGCGACTGGCGGCGAGTCAGCGTGAAACCCGTCTTCGCCGACTGTTCCTCAACCATTTCAATCGTCGGAGGTTGGCCCCCCGGGAAGATTTCGGTCGCGATGAACTTGAGAAAGCGGGCCAGCCACAACGTGAGCGGCAAGCCGTGGTCGACCATCTGCTGCCTGGTCAGGCCGGTGATCGTGTGCAGCAGCAACACGCCATCGGGCGGCAGGATTTTGTGGGCCCGGGCGAAGAAGTCGGCGTGACGATCGTGGCCGAAGTGCTCGAACGCGCCGATCGACACGATGCGGTCGACGGGCTCGTTGAACTGCTCCCATCCCGCCAGCAACACTCGCCTGTCGCGCGGGGTGTCCATCTCGTCGAACGACTTCTGCACATGGGCGGCCTGGTTCTTCGACAATGTCAGGCCGACGACGTTGACGTCATACTGCGCGATCGCGCGCCGCATGGTGGCGCCCCAGCCGCAACCGATATCGAGCAGCGTCATGCCGGGCTGCAGACCTAGCTTGCCCAGCGCCAGGTCGATCTTGGCGATCTGGGCCTCTTCCAGCGTCATGTCCTCGCGTTCGAAATGCGCGCAGCTGTAGGTCTGGGTCGGATCCAGGAACAGCCGGAAGAAGTCGTCGGACAGGTCGTAGTGTGCCTGCACGTCCTCGAAGTGCGGCGTTAGGTCGTTGACCAT3’
3.生物名:マイコバクテリウム・テュバキュローシス
4.現時:自然配列
5.配列の特徴を示す記号:mmaA2
6.配列番号2
配列番号3の情報
1.配列の特徴:
1.配列の長さ:166塩基対
2.配列の型:DNA
5’GAGGTGTAATGCCTTTCCGGACCCTAGGTGGCCTTTCGGTGCTTGCACGGAACGCACCGATGCTTCCCCCTCCCCGCATGCTCGAGGCATGCTATCCGATACAGGGCCGCCGCACTAAACCGCGATCGAATTTGCCCAGGTCAGGGAACGGATATGAGCGGACGAG3’
3.生物名:マイコバクテリウム・テュバキュローシス
4.現時:自然配列
5.配列の特徴を示す記号:mmaA1とmmaA2との間の遺伝子間領域
6.配列番号3
配列番号4の情報
1.配列の特徴:
1.配列の長さ:363塩基対
2.配列の型:DNA
5’TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATGCCTTTCCGGACCCTAGGTGGCCTTTCGGTGCTTGCACGGAACGCACCGATGCTTCCCCCTCCCCGCATGCTCGAGGCATGCTATCCGATACAGGGCCGCCGCACTAAACCGCGATCGAATTTGCCCAGGTCAGGGAACGGATATGAGCGGACGAGCTACTTGGTCATGGTGAACTGGGCGACGTTGATTAGGCCTCTGCGGAAGCGCTCCGCGCATCCGGTCAGATAGTGCATGAAGTTGTTGTAGACCTCTTCGGACTGTACGGCGATGGCGCGTTCGCGGGCAGCCTGTAGGTTGGCGGCCCATGCATCGAGAGTCCGTGCGTAGTGGGAATTC3’
3.生物名:マイコバクテリウム・テュバキュローシス
4.現時(IMMEDIATE):自然配列および人工配列
5.配列の特徴を示す記号:フォワードプライマー(配列番号5)とリバースプライマー(配列番号6)との間の領域
6.配列番号4
配列番号5の情報
1.配列の特徴:
1.配列の長さ:27塩基対
2.配列の型:DNA
5’TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG3’
3.生物名:人工配列
4.現時:合成オリゴヌクレオチド
5.配列の特徴を示す記号:フォワードプライマー
6.配列番号5
配列番号6の情報
1.配列の特徴:
1.配列の長さ:25塩基対
2.配列の型:DNA
5’GGAATTCCACTACGCACGGACTCTC3’
3.生物名:人工配列
4.現時:合成オリゴヌクレオチド
5.配列の特徴を示す記号:リバースプライマー
6.配列番号6
Bafica A, Scanga CA, Schito ML, Hieny S, Sher A. 2003 J Immunol. Aug 1; 171(3): 1123-7
Bennedsen., J, Thomson, V. O, Pfyffer, G. E, Funke, J, Feldman, K, Beneke, A, Jenkins, P. A, Heginbothom, M., Fahr, A., Hengstler, M., Cleator, G., Clapper, P. and Wilkins, E. G. I. 1996. J Clin. Microbiol. 34: 1407-1411.
Boom, R. C. J. A. sol, M. M. salimans, C. L. jansen, P. M. E. Wertheim-Van Dillen, and J. Van derNoorda. 1990. J. Clin. Microbiol. 28: 495-503.
Brisson-Noel, A., C. Aznar, C. Chureau, S. Nguyen, C. Pierre, M. Bartoli, R. Bonte, G. pialoux, B. Gicquel, and G. Garrigue. 1991. Lancet 338: 364-366.
Clarridge et al, Journal of Clinical Microbiology 31: 2049-2056, 1993.
Daniel, T. M., and S. M. Debannne, 1987. Am. Rev. Res. Dis. 135: 1137-1151.
Eisenach, K. D., M. D. Cave, J, H. Bates and J. T. crawford. 1990 J. Infect. Dis. 161: 997-981
Hermans, P. W. M, A. R. J. Suchitema, D. V. Soolingen, C. P. H. J. Verstyner, E. M. Bik, J. E. R. Thole, A. H. J. Kolk, and J. D. A. V. Embden. 1990. J. Clin. Microbiol. 28: 1204-1213.
Kadival, G. V., T. B. M. S. Mazarelo. and S. D. Chaparas. 1986. J. Clin. Microbiol. 23: 901-904.
Kolk, A. H. J., A. R. J. Suchitema, S. Kuijper, J. Van Leewen, P. M. W. Hermans, J. D. A. Van Embden, and R. A. Hartskreel. 1992. J. Clin. Microbiol. 30: 2567-2575.
Kent et al, J. Clin. Microbiol. 33: 2290-2293, 1995.
Kolk et al, J. Clin. Microbiol. 30: 2567-2575, 1992.
Kox et al, J. Clin. Microbiol. 32: 672-678, 1994.
Lee et al, J. Neurological Sciences 123: 173-179, 1994.
Noordhoek, G. T., A. H. T. Kaan, S. Mulder, H. Wilke, and A. H. J. Kolk. 1995.. J. Clin. Pathol. 48: 810-814.
Saiki, R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuichi, G. T. Horn, K. B. Mullis and H. A. Erlich, 1988. Science. 239: 487-491.
Schirm., J., Oosendrop, L. A. B, and Mulder, J. G. 1995. J. Clin. Microbiol. 33: 3221-3224.
Thierry, D., A. Brisson-Noel, V. Levy-Frebault, S. Nguyen, J. Guesdon, and B. Gicquel. 1990.
Thierry, D., Cave, M. D, Crawford, J. T, Bates, J. S, Gicquel, B. and Geusdon, J. L. 1989. Nuc. Acid. Res. 18: 188.
Yenez, M. A., M. P. Coppola, D. A. Russo, E. Delaha, S. D. Chaparas, and H. Yeager Jr. 1986. J. Clin. Micobiol. 23: 822-825.
Yuen, L. K. w., Ross, B. C, Jackson, K. M. and Dwyer, B. 1993. :1615-1618.
Zambardi et al, Annalesde Biologie Clinique 50: 893-897, 1993.
Abe et. al.: J. Clin. Microbiol. (1993), 31, 3270-3274
Miller et. al.: J. Clin. Microbiol. (1994), 32, 393-397,
Das, et. al.: Bio Techniques (1996) 20, 364-368,
Bose et. al.: Nucl. Acids Res. (1993) 21, 2529-2530, Bose, M. Chander, A, and Das, R. H.
Gurpreet et. al.: 米国特許第5731150号(チバ・コーニング・ダイアグノスティック社に付与)
Claims (11)
- a.任意の方法により粘液を含む汚染物質から臨床検体を浄化し、処理済臨床検体を得るステップと、
b.ステップ(a)で得た前記処理済臨床検体を溶解緩衝液で処理し、生きている病原性マイコバクテリアを不活性化するステップと、
c.ステップ(b)の前記臨床検体からゲノムDNAを抽出するステップと、
d.配列番号5および配列番号6のオリゴプライマーを用いて前記抽出したゲノムDNAをPCR増幅し、配列番号4を得るステップと、
e.配列番号4をさらにPCR増幅し、PCR増幅産物を得るステップと、
f.ゲル電気泳動、制限断片長多型(RFLP)から選択された方法によりステップ(e)の前記PCR増幅産物を分析し、前記試料内の病原性マイコバクテリアの存在を検出するステップと、
を有する、臨床検体中の病原性マイコバクテリアを検出する方法。 - 前記臨床検体は、唾液、胃洗浄物、脳脊髄液、血液、組織生検、または骨髄穿刺液およびその他の体液または組織から選択される、請求項1記載の方法。
- 前記ステップ(a)における汚染物質からの検体の浄化は、アルカリ、粘液溶解薬および0.5〜2.0Mの範囲のグアニジンイソチオシアネートを含む除染混合液により行われ、その後、遠心分離により検体を濃縮する、請求項1記載の方法。
- 前記溶解緩衝液は、0.5〜8Mの範囲のグアニジンイソチオシアネート、20〜100mMの範囲のトリス.Cl(pH7.6)、0.5〜2%の範囲のN−ラウリルサルコシル、0.1〜20mMの範囲のEDTA、1.0〜25.0mMの範囲のb−メルカプトエタノールおよび0.2Mの塩化ナトリウムを含む、請求項1記載の方法。
- 臨床検体からの前記抽出ゲノムDNAは、非特異的なDNAを産生させず、かつPCR阻害物質を含まない、請求項1記載の方法。
- ステップ(e)におけるDNAの増幅は、タッチダウンPCRサイクル条件により達成され、前記条件は、62〜72℃の範囲の高温での初期アニーリングのステップと、それに続く最初の10〜25サイクルの間に、PCRサイクルごとに0.2〜1℃の範囲ずつ温度を下げ、その後の30サイクルのPCRのために56〜62℃の最適なアニーリング温度にするタッチダウンステップとを有する、請求項1記載の方法。
- 臨床検体中の病原性マイコバクテリアの特異的な検出のために配列番号4を有するDNAの領域を増幅することができる前記オリゴヌクレオチドプライマーは、以下の群から選択される、請求項1記載の方法。
a.フォワードプライマーである、配列番号5のオリゴヌクレオチド
b.リバースプライマーである、配列番号6のオリゴヌクレオチド - オリゴヌクレオチドプライマーの長さは、5塩基から100塩基の間である、請求項1記載の方法。
- a.配列番号5のフォワードプライマーと、
b.配列番号6のリバースプライマーと、
を有する、臨床検体中の病原性マイコバクテリアを検出する診断キット。 - 臨床検体中の病原性マイコバクテリアを検出するための、配列番号5および配列番号6を有するプライマーの使用。
- a.フォワードプライマーである、配列番号5のオリゴヌクレオチド
b.リバースプライマーである、配列番号6のオリゴヌクレオチド
配列番号5および配列番号6の一組のプライマー。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US10/725,994 US7638309B2 (en) | 2003-12-03 | 2003-12-03 | Method for detecting pathogenic mycobacteria in clinical specimens |
PCT/IB2003/005767 WO2005056831A1 (en) | 2003-12-03 | 2003-12-09 | Method for detecting pathogenic mycobacteria in clinical specimens |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2007535292A JP2007535292A (ja) | 2007-12-06 |
JP4469338B2 true JP4469338B2 (ja) | 2010-05-26 |
Family
ID=34796858
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2005511650A Expired - Lifetime JP4469338B2 (ja) | 2003-12-03 | 2003-12-09 | 臨床検体中の病原性マイコバクテリアを検出する方法 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7638309B2 (ja) |
EP (1) | EP1694858B1 (ja) |
JP (1) | JP4469338B2 (ja) |
CN (1) | CN1930302A (ja) |
AU (1) | AU2003288577B2 (ja) |
CA (1) | CA2553286C (ja) |
DE (1) | DE60328055D1 (ja) |
DK (1) | DK1694858T3 (ja) |
WO (1) | WO2005056831A1 (ja) |
Families Citing this family (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101443462A (zh) * | 2006-05-15 | 2009-05-27 | 北海道公立大学法人札幌医科大学 | 利用胃粘膜洗涤液的疾病相关标记物检测法 |
FR2907793A1 (fr) * | 2006-10-26 | 2008-05-02 | Univ Aix Marseille Ii | Procede d'identification moleculaire et genotypage des bacteries du complexe mycobactrium tuberculosis. |
CN101323852B (zh) * | 2007-06-11 | 2013-01-23 | 北京东胜创新生物科技有限公司 | 一种在自动化核酸提取工作站上进行基因组提取的试剂盒及方法 |
CN102162007A (zh) * | 2010-02-23 | 2011-08-24 | 中国检验检疫科学研究院 | 牛分枝杆菌Taqman荧光定量PCR检测方法 |
KR101152061B1 (ko) * | 2010-05-27 | 2012-06-08 | 울산대학교 산학협력단 | 이중 중합효소연쇄반응법을 이용한 결핵균과 항산성비결핵균의 검출 방법 |
KR101193765B1 (ko) * | 2011-05-16 | 2012-10-24 | (주)나노헬릭스 | 초고속 핵산의 정제방법 |
AP2015008200A0 (en) * | 2012-06-11 | 2015-01-31 | Univ Pretoria | A liposomal composition comprising a sterol-modified lipid and a purified mycobacterial lipid cell wall component and it's use in the diagnosis of tuberculosis |
JP6325077B2 (ja) | 2013-03-15 | 2018-05-16 | アボツト・モレキユラー・インコーポレイテツド | 核酸を抽出するための組成物および方法 |
EP3382040A3 (en) | 2013-12-03 | 2018-10-31 | Kusuma School of Biological Sciences | Genetic markers for diagnosis of tuberculosis caused by mycobacterium tuberculosis |
CN113801876A (zh) | 2017-01-16 | 2021-12-17 | 光谱解决方案有限责任公司 | 核酸保存溶液及其制造和使用方法 |
CN107937391B (zh) * | 2017-11-29 | 2021-07-09 | 上海透景生命科技股份有限公司 | 人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液及其制备方法和应用 |
EP3501282A1 (en) * | 2017-12-22 | 2019-06-26 | F. Hoffmann-La Roche AG | Composition for processing a sputum sample |
AU2019384801A1 (en) | 2018-11-20 | 2021-06-10 | Spectrum Solutions, Llc | Sample collection system including sealing cap and valve |
US11701094B2 (en) | 2019-06-20 | 2023-07-18 | Spectrum Solutions L.L.C. | Sample collection system including valve and plug assemblies |
EP4021474A4 (en) * | 2019-08-28 | 2023-08-23 | Contamination Source Identification LLC | RAPID ISOLATION AND COLLECTION OF MICROBIAL RNA FROM A BIOLOGICAL SAMPLE |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100433260B1 (ko) * | 2000-09-15 | 2004-05-24 | 주식회사 에스제이하이테크 | 멀티플렉스 pcr 방법 및 이를 이용한 마이코박테리아동정용 키트 및 올리고 뉴클레오티드 |
-
2003
- 2003-12-03 US US10/725,994 patent/US7638309B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-12-09 CN CNA2003801109798A patent/CN1930302A/zh active Pending
- 2003-12-09 WO PCT/IB2003/005767 patent/WO2005056831A1/en active Application Filing
- 2003-12-09 EP EP03780417A patent/EP1694858B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-12-09 CA CA2553286A patent/CA2553286C/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-12-09 DE DE60328055T patent/DE60328055D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-12-09 JP JP2005511650A patent/JP4469338B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2003-12-09 DK DK03780417T patent/DK1694858T3/da active
- 2003-12-09 AU AU2003288577A patent/AU2003288577B2/en not_active Ceased
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2553286C (en) | 2011-07-19 |
JP2007535292A (ja) | 2007-12-06 |
CA2553286A1 (en) | 2005-06-23 |
AU2003288577A1 (en) | 2005-06-29 |
DE60328055D1 (de) | 2009-07-30 |
DK1694858T3 (da) | 2009-08-17 |
US20050123928A1 (en) | 2005-06-09 |
US7638309B2 (en) | 2009-12-29 |
EP1694858A1 (en) | 2006-08-30 |
CN1930302A (zh) | 2007-03-14 |
WO2005056831A1 (en) | 2005-06-23 |
AU2003288577B2 (en) | 2011-06-02 |
EP1694858B1 (en) | 2009-06-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3097059B2 (ja) | 標的ヌクレオチド配列に対する特異的プローブの生成 | |
Lin et al. | Comparison of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) and real-time PCR method targeting a 529-bp repeat element for diagnosis of toxoplasmosis | |
US5731150A (en) | IS6110 based molecular detection of mycobacterium tuberculosis | |
JP4469338B2 (ja) | 臨床検体中の病原性マイコバクテリアを検出する方法 | |
Vitale et al. | Detection of Mycobacterium tuberculosis complex in cattle by PCR using milk, lymph node aspirates, and nasal swabs | |
JP2709256B2 (ja) | マイコバクテリアプローブ | |
US5597911A (en) | Mycobacterial nucleic acid hybridization probes and methods of use | |
KR100388548B1 (ko) | 알이피 13 이 12 반복서열의 피시알 증폭을 이용한결핵균의 검출방법 | |
CN114196766B (zh) | 用于特异鉴定水稻白叶枯菌Xoo的分子标记、引物对、试剂盒和方法 | |
Del Prete et al. | Detection of Mycobacterium paratuberculosis in stool samples of patients with inflammatory bowel disease by IS900-based PCR and colorimetric detection of amplified DNA | |
KR101158934B1 (ko) | 핵산 검출 방법 | |
US11434527B2 (en) | Method for detecting mycoplasma using mitochondrial DNA as internal control sample | |
RU2338789C2 (ru) | Способ детекции патогенных микобактерий в клинических образцах | |
JP2006061134A (ja) | 結核菌検出のためのプライマーおよび検出同定法 | |
RU2455364C2 (ru) | Способ идентификации микобактерий с помощью полимеразной цепной реакции | |
JP2007075017A (ja) | Campylobacterjejuniの検出法 | |
RU2816852C1 (ru) | Способ пцр-идентификации фитопатогенного гриба fusarium oxysporum | |
RU2163638C1 (ru) | Способ обнаружения днк микобактерий туберкулезного комплекса с дифференциальным выявлением днк mycobacterium tuberculosis и набор реагентов для его осуществления | |
EP2723891B1 (en) | Diagnostic methods for detecting clostridium difficile | |
Lee et al. | DNA sequencing validation of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae nucleic acid tests | |
JP3634960B2 (ja) | ジャイレース遺伝子を用いた結核菌群構成細菌の同定・検出方法 | |
Uchenna et al. | Comparison of Molecular and Conventional Methods of Detecting Cryptosporidium Parvum in Seropositive HIV Patient’s Fecal Specimens | |
JP2902054B2 (ja) | ヒト型結核菌の検出方法 | |
KR101687156B1 (ko) | 마이코박테리움 보비스 감염 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단방법 | |
JP2004081054A (ja) | 腸管出血性大腸菌ベロトキシン検出のためのプライマーおよびそれを用いた腸管出血性大腸菌の同定法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090602 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090902 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090909 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091002 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091208 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100118 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100209 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100226 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130305 Year of fee payment: 3 |