RU2816852C1 - Способ пцр-идентификации фитопатогенного гриба fusarium oxysporum - Google Patents
Способ пцр-идентификации фитопатогенного гриба fusarium oxysporum Download PDFInfo
- Publication number
- RU2816852C1 RU2816852C1 RU2022135433A RU2022135433A RU2816852C1 RU 2816852 C1 RU2816852 C1 RU 2816852C1 RU 2022135433 A RU2022135433 A RU 2022135433A RU 2022135433 A RU2022135433 A RU 2022135433A RU 2816852 C1 RU2816852 C1 RU 2816852C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- fusarium oxysporum
- pcr
- fsox2
- fsox1
- Prior art date
Links
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 23
- 241000894007 species Species 0.000 claims abstract description 7
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000012800 visualization Methods 0.000 claims abstract description 3
- 102100021391 Cationic amino acid transporter 3 Human genes 0.000 claims description 2
- 101000837344 Homo sapiens T-cell leukemia translocation-altered gene protein Proteins 0.000 claims description 2
- 108091006230 SLC7A3 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100028692 T-cell leukemia translocation-altered gene protein Human genes 0.000 claims description 2
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 claims 1
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 abstract description 13
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 8
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 241000207763 Solanum Species 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 235000008406 SarachaNachtschatten Nutrition 0.000 description 2
- 235000004790 Solanum aculeatissimum Nutrition 0.000 description 2
- 235000008424 Solanum demissum Nutrition 0.000 description 2
- 235000018253 Solanum ferox Nutrition 0.000 description 2
- 235000000208 Solanum incanum Nutrition 0.000 description 2
- 235000013131 Solanum macrocarpon Nutrition 0.000 description 2
- 235000009869 Solanum phureja Nutrition 0.000 description 2
- 235000000341 Solanum ptychanthum Nutrition 0.000 description 2
- 235000017622 Solanum xanthocarpum Nutrition 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004565 5.8S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000213004 Alternaria solani Species 0.000 description 1
- 241001274890 Boeremia exigua Species 0.000 description 1
- 241001123534 Colletotrichum coccodes Species 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000879841 Fusarium oxysporum f. cubense Species 0.000 description 1
- 108091023242 Internal transcribed spacer Proteins 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- 241000160320 Lilium formosanum x Lilium longiflorum Species 0.000 description 1
- 241000227653 Lycopersicon Species 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000233622 Phytophthora infestans Species 0.000 description 1
- 241000233629 Phytophthora parasitica Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- PWPJGUXAGUPAHP-UHFFFAOYSA-N lufenuron Chemical compound C1=C(Cl)C(OC(F)(F)C(C(F)(F)F)F)=CC(Cl)=C1NC(=O)NC(=O)C1=C(F)C=CC=C1F PWPJGUXAGUPAHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- HNJXPTMEWIVQQM-UHFFFAOYSA-M triethyl(hexadecyl)azanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](CC)(CC)CC HNJXPTMEWIVQQM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области молекулярной диагностики. Описан способ идентификации фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum методом ПЦР, основанный на использовании видоспецифических пар праймеров. Способ предусматривает выделение ДНК из образцов биологического материала, проведение полимеразной цепной реакции с выделенной ДНК и видоспецифическими праймерами, электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле, их визуализацию и идентификацию путем сравнения по размеру с ДНК-фрагментами маркера молекулярного размера. Наличие в пробе ПЦР-продуктов размером 285 п.н. или 370 п.н. свидетельствует о присутствии в исследуемом образце Fusarium oxysporum. Технический результат изобретения заключается в расширении арсенала средств для идентификации ДНК фитопатогенных грибов Fusarium oxysporum в биологическом материале. 1 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к технической области молекулярной диагностики и касается обнаружения и идентификации ДНК фитопатогенных грибов Fusarium oxysporum в биологическом материале с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и может быть использовано с целью научных исследований для молекулярной идентификации Fusarium oxysporum, либо для ранней диагностики фузариоза пасленовых растений в полевых условиях, а также для фитосанитарного контроля наличия данного фитопатогена.
Фузариоз, сухая гниль - распространенная патология пасленовых сельскохозяйственных растений, вызываемый микромицетом Fusarium oxysporum. При заболевании участки поражения обнаруживаются на листьях, стебле и клубнях картофеля. При неблагоприятных погодных условиях фузариоз наносит существенный урон урожаю картофеля. Фузариоз хорошо определяется морфологически, когда растение или клубни поражены в значительной степени, однако на ранних стадиях заражения Fusarium oxysporum может быть точно идентифицирован только молекулярными методами. Известны способы, позволяющие диагностировать фузариоз с помощью ПЦР-амплификации, однако они не оптимизированы для рутинного применения, либо требуют дорогостоящего оборудования [1-3]. И в настоящее время на рынке России нет доступных ПЦР-диагностикумов для быстрого эффективного определения фузариоза в целях фундаментальных исследований или фитосанитарного мониторинга.
Известен патент на праймеры и способ детекции возбудителя картофеля Fusarium oxysporum [3], включающий праймеры для молекулярной детекции и способ детекции возбудителя фузариоза картофеля. Недостатками данного способа являются многостадийность, низкая температура отжига праймеров (56°С), что приводит к увеличению продолжительности анализа за счет большой разницы температур в цикле и длительности времени, затрачиваемой амплификатором на нагрев/охлаждение термоблока.
Заявляемое изобретение направлено на решение задачи разработки удобного ПЦР-диагностикума, пригодного для выявления Fusarium oxysporum и в поточном прикладном мониторинге, и в научной работе, при котором достигается высокая видоспецифичность, и избирательность праймеров, простота анализа результата.
Технический результат изобретения – праймеры и протокол ПЦР-реакции, позволяющей идентифицировать ДНК фитопатогенных грибов Fusarium oxysporum в биологическом материале.
Для достижения технического результата по базе данных GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore) проведен поиск и выбор последовательностей региона, кодирующего 18S рРНК, 5,8S рРНК, 28S рРНК и межгенные спейсеры ITS1, ITS2, Fusarium oxysporum (проанализирована 231 последовательность), других видов Fusarium (проанализировано 156 последовательностей), других микромицетов – фитопатогенов пасленовых (возбудителей фитофтороза, фомоза, фузариоза – 183 последовательности), а также томатов и картофеля (20 последовательностей). Проведено множественное выравнивание выбранных последовательностей внутри групп и между характерными представителями групп, выявлены полиморфизмы, отличающих ДНК вида Fusarium oxysporum от других видов рода Fusarium, от других микромицетов-фитопатогенов картофеля и от ДНК растения-хозяина.
Множественное выравнивание выбранных последовательностей проводили с помощью приложения Align программного пакета VectorNTI Advance 11.5, а также оригинальной программы Yacwgui 1.2, работающих на основе алгоритма ClustalW. По результатам множественного выравнивания выявляли полиморфизмы, отличающие выбранный регион у Fusarium oxysporum от представителей других организмов.
Дизайн праймеров, определение идентичности и специфичности олигонуклеотидных последовательностей – кандидатов для дизайна праймеров провндены с помощью сервиса Nucleotide BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi? PROGRAM=blastn). Термодинамические характеристики, специфичность, отсутствие само- и взаимокомплементарностей, повторов определеныи в приложении Oligo Analysis програмного пакета VectorNTI Advance 11.5. По сконструированным последовательностям олигонуклеотиды были синтезированы фосфоамидитным методом.
Технический результат достигается тем, что проводится полимеразная цепная реакция (ПЦР), для которой используются олигонуклеотиды - праймеры, специфичные к области ДНК, имеющей отличия в последовательности, характерные для вида Fusarium oxysporum.
Способ предусматривает выделение ДНК из образцов биологического материала, проведение с выделенной ДНК полимеразной цепной реакции с использованием пар праймеров FsOx1-F и FsOx1-R, специфичных для области генов рибосомальных РНК и межгенных спейсеров, ограничивающих участок ДНК размером 285 пар нуклеотидов (п.н.) или FsOx2-F и FsOx2-R, ограничивающих участок ДНК размером 370 пары нуклеотидов, и анализ продуктов ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле. Наличие на электрофореграмме ПЦР-продуктов размером 285 или 370 п.н., соответственно, свидетельствует о присутствии в исследуемом образце ДНК F. oxysporum. При этом используемые праймеры имеют следующие нуклеотидные последовательности:
FsOx1-F: 5'-CCC CTA AAC TCT GTT TCT ATA TGT AA-3',
FsOx1-R: 5'- ATT AAC GCG AGT CCC AAC ACC AAG CTG T-3',
FsOx2-F: 5'- TCTA TAT GTA ACT TCT GAG TAA AAC CAT-3',
FsOx2-R: 5'- ACG ATT ACC AGT AAC GAG GGT TTT AC-3',
ПЦР проводят в следующем температурно-временном режиме:
Предварительный прогрев: 94°С, 120 сек;
30 циклов, включающих: 94°С, 20 сек, 62°С, 20 сек, 72°С, 30 сек;
Дополнительная элонгация: 72°С, 120 сек.
Выделение и подготовка ДНК для ПЦР-анализа микромицетов данным способом проводится любым стандартизованным коммерческим набором для выделения ДНК из растений и грибов. Образцы ДНК, пригодные для быстрого ПЦР-анализа могут быть получены путем механического лизиса с использованием микросфер и гомогенизатора, например, MagnaLyser, либо с помощью лизирующего буфера на основе цетилтриэтиламмония бромида либо гуанидинтиоционата и сорбента «диатомовая земля».
Этот способ позволяет проводить раннюю диагностику альтарнариоза при отсутствии характерных морфологических признаков присутствия этого фитопатогена и может быть использован с целью научных исследований для молекулярной идентификации Fusarium oxysporum, либо для ранней диагностики фузариоза пасленовых растений в полевых условиях, а также для фитосанитарного контроля наличия данного фитопатогена.
Изобретение поясняется следующими примерами.
Пример 1. ПЦР-идентификация культуры микромицета
Fusarium oxysporum
Материал мицелия микромицетов отбирают с поверхности чашки Петри с агаризованной средой одноразовьм шпателем в количестве от 5-50 мг, переносят в пластиковую микропробирку объемом 2 мл, содержащую буфер ТЕ(10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, pH 8,0) и микросферы для гомогенизации клеток, гомогенизируют 5-кратным включением по 5 минут при скорости 5000 оборотов в минуту на аппарате MagNA Lyser, ROCHE, Швейцария, центрифугруют при 14000g в течении 3 минут, надосадочную жидкость прогревают при переносят в чистую микропробирку, прогревают 10 мин при 95°С для дезактивирования возможных примесей нуклеаз и используют для ПЦР-амплификации.
Амплификацию ДНК проводят следующим образом:
Для постановки ПЦР используют, в микропробирки объёмом 200 мкл или лунки мироплашки вносят компоненты ПЦР-реакции из расчёта: 10×ПЦР-буфер – 2,5 мкл; водный раствор, содержащего по 10 пикомоль праймеров FsOx1-F и FsOx1-R, либо
праймеров FsOx2-F и FsOx2-R – 5 мкл, термостабильную ДНК-полимеразу – 5 ед. активности; образец, содержащий анализируемую ДНК – 2,5 мкл, H2O до 25 мкл. Содержимое пробирки смешивают 10 сек на вортексе.
Амплификацию проводят на программируемом термоциклере (амплификаторе) при следующем температурно-временном режиме:
Предварительный прогрев: 94°С, 120 сек;
30 циклов, включающих: 94°С, 20 сек, 62°С, 20 сек, 72°С, 30 сек;
Дополнительная элонгация: 72°С, 120 сек.
Детекцию продуктов амплификации проводят методом электрофореза в 1,2%-ном агарозном геле при напряженности электрического поля 5 В/см в течение 30 мин с последующим окрашиванием ДНК бромистым этидием. В качестве контроля для оценки размеров амплифицированных фрагментов используют ДНК-маркерный набор, включающий диапазон размеров ДНК от 100 до 1000 п.н.
Визуализацию электрофоретического разделения и регистрацию результатов проводят на установке для гель-документации при ультрафиолетовой подсветке.
Обнаружение продуктов ПЦР фрагментов, соответствующих размерам 285 или 370 п.н., (при использовании праймеров FsOx1-F и FsOx1-R или FsOx2-F и FsOx2-R, соответственно), свидетельствует о положительном результате анализа – обнаружении ДНК Fusarium oxysporum, другие виды рода Fusarium, другие распространенные фитопатогены картофеля (Alternaria solani, Colletotrichum atramentarium, Phytophthora infestans, Phoma solanicola), а также ДНК самого картофеля не дают ПЦР-продукта – демонстрируют отрицательную реакцию (табл. 1).
Пример 2. ПЦР-идентификация культуры микромицета
Fusarium oxysporum
в растительном материале
Для анализа используют материал органов растений, предположительно зараженный Fusarium oxysporum. Образцы растительной ткани в размере 10-300 мг отбираются чистым скальпелем и помещаются в пластиковую микропробирку объемом 2 мл, содержащую буфер ТЕ (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, pH 8,0) и микросферы для гомогенизации клеток. Гомогенизацию, подготовку образца, амплификацию ДНК, электрофоретическое разделение и визуализацию проводят, как описано в примере 1.
Обнаружение продуктов ПЦР фрагментов, соответствующих размерам 285 или 370 п.н. (при использовании праймеров FsOx1-F и FsOx1-R или FsOx2-F и FsOx2-R, соответственно), свидетельствует о положительном результате анализа – обнаружении ДНК Fusarium oxysporum.
Литература
1. Toda, Т., Hanesaka, S., Shishido, К. et al. Development of specific primers for Fusarium oxysporum causing damping off of Lilium formolongi. J Genet Eng Biotechnol - 2020. - Vol. 18. - 1. https://doi.org/10.1186/s43141-019-0015-2.
2. Patent CN 101974650 B, Li Yuan, Cao Ao, Cheng Guo, Meixia Cui, Rui Wu Zhanfang, Zhao Haibin. Polymerase chain reaction (PCR) method for detecting fusarium oxysporum and kit, 2012.
3. Patent CN 109182582 B, Lu Guiyun, Li Jingrui, Zhong Xin, Wu Xiaolei, Gao Hongbo, Gong Binbin, Zhao Jing. Qualitative detection primer and detection method for fusarium oxysporum f.sp.cubense, 2021.
Claims (1)
- Способ идентификации фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum методом ПЦР, основанный на использовании видоспецифических пар праймеров FsOx1-F: 5'-CCC CTA AAC TCT GTT TCT ATA TGT AA-3'/FsOx1-R: 5'- ATT AAC GCG AGT CCC AAC ACC AAG CTG T-3', или FsOx2-F: 5'- TCTA TAT GTA ACT TCT GAG TAA AAC CAT-3'/ FsOx2-R: 5'- ACG ATT ACC AGT AAC GAG GGT TTT AC-3', предусматривающий выделение ДНК из образцов биологического материала, проведение полимеразной цепной реакции с выделенной ДНК и видоспецифическими праймерами, электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле, их визуализацию и идентификацию путем сравнения по размеру с ДНК-фрагментами маркера молекулярного размера, при котором наличие в пробе ПЦР-продуктов размером 285 п.н. при использовании праймеров FsOx1-F/ FsOx1-R или 370 п.н. при использовании праймеров FsOx2-F / FsOx2-R свидетельствует о присутствии в исследуемом образце Fusarium oxysporum.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2816852C1 true RU2816852C1 (ru) | 2024-04-05 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2527728A (en) * | 2014-02-18 | 2016-01-06 | Malaysian Palm Oil Board Mpob | Detection of a specific fungal pathogen |
| RU2584035C1 (ru) * | 2015-02-12 | 2016-05-20 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ диагностики онихомикоза |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2527728A (en) * | 2014-02-18 | 2016-01-06 | Malaysian Palm Oil Board Mpob | Detection of a specific fungal pathogen |
| RU2584035C1 (ru) * | 2015-02-12 | 2016-05-20 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ диагностики онихомикоза |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Haegi A., Catalano V., Luongo L., Vitale S., Scotton M., Ficcadenti N., Belisario A. A newly developed real-time PCR assay for detection and quantification of Fusarium oxysporum and its use in compatible and incompatible interactions with grafted melon genotypes. Phytopathology. 2013 Aug; 103(8):802-10. doi: 10.1094/PHYTO-11-12-0293-R. PMID: 23464901. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Martin et al. | Anaplasma platys: an improved PCR for its detection in dogs | |
| Andresen et al. | Diagnosis of visceral leishmaniasis by the polymerase chain reaction using blood, bone marrow and lymph node samples from patients from the Sudan | |
| JP2016013133A (ja) | 多数の標的の増幅のためのアンプリコンレスキューマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応 | |
| RU2625006C1 (ru) | Способ таргетной амплификации геномов возбудителей инфекций органов репродукции человека с целью одновременной идентификации возбудителей с набором праймеров | |
| RU2727054C1 (ru) | Способ выявления кДНК коронавируса SARS-CoV-2 с помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции | |
| Vuran et al. | Identification of Malassezia species from pityriasis versicolor lesions with a new multiplex PCR method | |
| Guillemi et al. | Tick-borne Rickettsiales: Molecular tools for the study of an emergent group of pathogens | |
| JP4469338B2 (ja) | 臨床検体中の病原性マイコバクテリアを検出する方法 | |
| JP2010046038A (ja) | イチゴ重要病害の病原菌検出方法および検出用プライマー | |
| US20120100545A1 (en) | Method and/or primers for the detection of mycobacterium tuberculosis | |
| CN109762910B (zh) | 一种用于同时检测两型包虫病的引物及试剂盒 | |
| RU2816852C1 (ru) | Способ пцр-идентификации фитопатогенного гриба fusarium oxysporum | |
| JP3194943B2 (ja) | クリプトコックス・ネオホルマンスの検出に用いる核酸プローブおよび方法 | |
| RU2804687C1 (ru) | Способ пцр-идентификации фитопатогенного гриба alternaria solani | |
| JP3525259B2 (ja) | ペクチネータス属菌の検出 | |
| RU2455364C2 (ru) | Способ идентификации микобактерий с помощью полимеразной цепной реакции | |
| JP2003144153A (ja) | 遺伝子検出方法、遺伝子検出用プライマー、ｄｎａマイクロアレイ及び遺伝子検出用キット | |
| RU2644233C2 (ru) | Способ экспресс-диагностики лейкоза крупного рогатого скота | |
| KR101768955B1 (ko) | 에볼라 바이러스 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| RU2765495C1 (ru) | Способ определения подвидов Francisella tularensis методом мультипраймерной ПЦР | |
| JP6318239B2 (ja) | 真菌核酸の抽出方法 | |
| RU2737396C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса западного нила 4 генотипа (west nile virus lineage 4) | |
| RU2809735C1 (ru) | Способ определения бактерии вида Mycobacterium tuberculosis методом петлевой изотермической амплификации (LAMP) | |
| RU2338789C2 (ru) | Способ детекции патогенных микобактерий в клинических образцах | |
| JP5435612B2 (ja) | リケッチア・ジャポニカ感染症の診断方法 |