JP2010046038A - イチゴ重要病害の病原菌検出方法および検出用プライマー - Google Patents
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Abstract
【解決手段】各病原菌の遺伝子特異的に増幅し、増幅産物の分子量が異なるように設計された各プライマーを混合したプライマーミックスを用いて遺伝子増幅操作を行い、増幅産物の分子量を測定することによる。
【選択図】図2
Description
奈良県農業技術センター研究報告 第32号、9-18頁(2001年) 四国植物防疫研究 第41巻、49-50頁(2006年)
1.イチゴ組織または土壌を試料とし、試料中に混入可能性のある遺伝子を分析することによるイチゴの重要病害の検出方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする検出方法:
1)イチゴの重要病害に関連する少なくとも2種以上の病原菌の遺伝子配列を各々特異的に増幅しうる複数のプライマーを用いて遺伝子増幅処理を行う工程;
2)上記遺伝子増幅処理工程により得られた増幅産物の分子量を測定する工程;
3)測定した分子量から、増幅産物に関連する病原菌を同定する工程。
2.前記イチゴの重要病害が、炭疽病、疫病および/または萎黄病である前項1に記載の検出方法。
3.前記イチゴの重要病害に関連する病原菌が、糸状菌から選択される少なくとも2種以上である、前項1または2に記載の検出方法。
4.前記糸状菌が、グロメレラ(Glomerella)属、コレトトリカム(Colletotrichum)属、フィトフィトラ(Phytophthora)属、フザリウム(Fusarium)属のいずれかに属する前項3に記載の検出方法。
5.複数のプライマーが、各病原菌のリボソームRNA遺伝子のITS(internal transcribed spacer)領域の部分を含む塩基配列を検出しうるプライマーである、前項1〜4のいずれか1に記載の検出方法。
6.前項1〜5のいずれか1に記載の検出方法に使用する遺伝子増幅用プライマー。
7.前項6に記載のプライマーであり、以下の1)〜10)のいずれかに示す塩基配列、並びに各塩基配列のうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなり、病原菌の遺伝子配列を特異的に増幅しうるプライマー機能を有するオリゴヌクレオチドから選択されるいずれかのオリゴヌクレオチドを含む、イチゴの重要病害検出用の遺伝子増幅用プライマー:
1)GTAGGGTCTCCGCGACCCT(配列番号1);
2)CCTAAACTCTGTTTCTATATGTAAC(配列番号2);
3)TTCCTACCTGATCCGAGGTCA(配列番号3);
4)GCCGGCCCCACCACGGGGA(配列番号4);
5)AAGGGCCCACGTGTGCCGTG(配列番号5);
6)CTTCGGCCTGAGCTAGTAGCTTT(配列番号6);
7)ATGCATACCGAAGTACACACACAT(配列番号7);
8)CAATAGTTGGGGGTCTTATTTGGC(配列番号8);
9)ATGCATACCGAAGTACACATTAAG(配列番号9);
10)ctatatgtaacttctgagtaaaacc(配列番号10)。
8.プライマー機能を有する少なくとも2種のオリゴヌクレオチドを1対とし、以下のA)〜E)のいずれかの組み合わせからなるオリゴヌクレオチドのセットであって、前項1〜5のいずれか1に記載の検出方法に使用するイチゴの重要病害検出用の遺伝子増幅用プライマーセット:
A)配列番号1に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号3に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、2種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ;
B)配列番号4に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号5に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、2種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ;
C)配列番号2に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号3に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、2種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ;
D)配列番号8に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号9に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、2種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ;
E)配列番号6に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号7に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、2種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ。
9.前項8のA)〜E)のいずれかのオリゴヌクレオチドの組み合わせからなる遺伝子増幅用プライマーセットを、少なくとも2セット以上含む、イチゴの重要病害の検出用キット。
1)イチゴの重要病害に関連する少なくとも2種以上の病原菌の遺伝子配列を各々特異的に増幅しうる複数のプライマーを用いて遺伝子増幅処理を行う工程;
2)上記遺伝子増幅処理工程により得られた増幅産物の分子量を測定する工程;
3)測定した分子量から、増幅産物に関連する病原菌を同定する工程。
例えば、試料中に検出したい遺伝子の混入が極微量の場合は、微量の遺伝子であっても増幅可能な方法が好適である。PCR法の場合、例えばリアルタイムPCR法などの手法により、感度よく検出することができる。
1)GTAGGGTCTCCGCGACCCT(配列番号1)
2)CCTAAACTCTGTTTCTATATGTAAC(配列番号2)
3)TTCCTACCTGATCCGAGGTCA(配列番号3)
4)GCCGGCCCCACCACGGGGA(配列番号4)
5)AAGGGCCCACGTGTGCCGTG(配列番号5)
6)CTTCGGCCTGAGCTAGTAGCTTT(配列番号6)
7)ATGCATACCGAAGTACACACACAT(配列番号7)
8)CAATAGTTGGGGGTCTTATTTGGC(配列番号8)
9)ATGCATACCGAAGTACACATTAAG(配列番号9)
10)ctatatgtaacttctgagtaaaacc(配列番号10)。
具体的には以下のA)〜E)のいずれかの組み合わせからなるオリゴヌクレオチドのセットからなるイチゴの重要病害検出用の遺伝子増幅用プライマーセットが挙げられる。
配列番号1または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号3に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、2種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ。
配列番号4に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号5に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、2種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ。
配列番号2に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号3に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、2種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ。
配列番号8に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号9に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、2種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ。
配列番号6に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号7に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、2種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ。
1)試料
試料としてイチゴに病原性を持つ培養菌株5種(Glomerella cingulata,Colletotrichum acutatum,Fusarium oxysporum, Phytophthora nicotianae, Phytophthora cactorum)および実験的にこれらの菌に病気に感染させたイチゴ苗を用いた。更に徳島県内のイチゴ栽培農家から病原菌に感染したと思われるイチゴ苗28株を入手し、実験に用いた。
DNAの抽出に、植物DNA抽出キットNucleon PhytoPure TM(Nucleon Bioscience社)を用いた。操作はマニュアルに従って次のような手順で行った。
上記5種の病原菌の培養菌株を寒天プレート上に培養し、菌叢をヘラで約25mg掻き取り、乳鉢中で蒸留水1000μLを加え、氷温で組織をすり潰した。上記キットに含まれる試薬1(reagent1)を1500μL加え、乳鉢でさらにすり潰した後、700μLを採取し、マイクロチューブに移した。マイクロチューブ中の細胞破砕液に、上記キットに含まれる試薬2(reagent2)を200μL加え、上下をよく反転し混合後、アルミバス中65℃で20分間保温し、2−3分ごとによく振って撹拌した。その後、氷中で20分間静置し、−20℃の冷クロロホルム500μLと上記キットに含まれる上記キットに含まれる精製試薬(Nucleon PhytoPure resin)を100μL加え、室温で10分間上下を反転させながら混合した。5000rpmで遠心し、上層(DNA層)を滅菌済の新しい1.5mLチューブに移した。冷イソプロパノールを600μL加えて、撹拌してDNAを析出させた。DNAのペレットを得るため、12000rpmで10分間遠心し、上清を捨てた。70%エタノールを300μL加え、再び12000rpmで5分間遠心し、上清を廃棄した。沈殿物を真空ポンプで2分間真空状態に置き、DNAを含む沈殿物を乾燥させた。乾燥した沈殿物は50μLの×0.1 TE緩衝液を加えてピペッティングにより溶解した後、−20℃で保存した。
上記5種の菌種の遺伝子を、一度の遺伝子増幅処理(マルチプルPCR)で検出しうるように、プライマーを設計した。各プライマーは、各菌種特異的な遺伝子の配列部分を増幅可能であり、かつ、得られた増幅産物の分子量が異なるように考慮して設計した(図2参照)。
上記2により抽出、精製したDNA溶液中のDNA収量を測定するため、既知濃度のマーカーDNAとともに電気泳動を行い、染色後のバンドの発色を比較して、DNA濃度を計算した。DNA溶液8μLに染色液(0.25%Bromphenol blue(BPB)、40%スクロース、100mM EDTA)を2μL加え、電気泳動を行った。マーカーDNAとして、制限酵素Hind IIIで消化したλDNA(0.25μL/10μL)を10μL添加した。電気泳動装置はMupid(R)-2(コスモ・バイオ、東京)を用い、2.0%のアガロースゲル、1×TAE緩衝液中を50Vで80分泳動することにより、DNA断片を展開した。アガロースは、核酸電気泳動用アガロース(Agarose for ≧1Kbp fragment(ナカライテスク、京都市))を使用した。泳動終了後、100mLの蒸留水に5mg/mLのエチジウムブロマイド(EB)を12μL加えた染色液にゲルを移し、30分おいて染色した。染色後、UVP Ultraviolet Transilluminator TDM-20(UVP, Inc., Uoland, CA, USA)により紫外線を照射し、写真撮影した。
PCR法による遺伝子増幅はPuReTaq Ready-To-Go PCR Beads in strips(Amersham BioScience, Inc, Piscataway, NJ, USA)を使用し、サーマルサイクラーは、TaKaRa PCR Thermal Cycle Dice TP600 Gradient/TP650 Standard(タカラバイオ)を用いて行った。検体の調製は以下の手順で行った。
各菌に対応する1対のプライマーペアおよびすべてのプライマーを混合したプライマーミックス溶液を、上記濃度に従い作製した。
各菌種のDNAは、各々個別にPCRを行う他、5種をすべて混合したDNA溶液を作製してPCRを行った。
PCR後のアガロース電気泳動は、核酸電気泳動用アガロース(Agarose for 50~800bp fragment(ナカライテスク、京都市))を用い、1.0%の濃度で行った以外は4)と同手法により行った。電気泳動後、同様にEB染色し、写真撮影した。
イチゴ栽培農家から得た重要病害の可能性がある28のイチゴの苗のうち4つ(苗番号3,27,9,11)について、実施例1で作製したプライマーミックスを用いて、PCR法により、5種(Glomerella cingulata,Colletotrichum acutatum,Fusarium oxysporum, Phytophthora nicotianae, Phytophthora cactorum)の病原菌の検出を行った。DNAの抽出、PCR条件および電気泳動の手法は、上記実施例1と同手法により行った。
萎黄病を発病したイチゴ苗を栽培したときの土壌について、実施例1で作製したプライマーミックスを用いて、PCR法により、5種(Glomerella cingulata,Colletotrichum acutatum,Fusarium oxysporum,Phytophthora nicotianae,Phytophthora cactorum)の病原菌の検出を行った。
Fusarium oxysporumの検出のためのプライマーとして、FoxyF6(配列番号2)のかわりに以下に示すプライマー(FoxyF2)を用いたほかは、実施例1に記載の方法と同手法によりPCR法により病原菌の検出を行い、電気泳動を行った。本実施例で用いた各プライマーの位置を図6に示した。Fusarium oxysporumの検出のためのプライマーとして、FoxyF2およびFGC-Rを用いた場合の増幅産物の長さは368bpである。
FoxyF2 ctatatgtaacttctgagtaaaacc (配列番号10)
イチゴ栽培農家から得た重要病害の可能性がある28のイチゴの苗のうち5つ(苗番号22,23,1,9,6)について、実施例4で作製したプライマーミックスを用いて、5種(Glomerella cingulata,Colletotrichum acutatum,Fusarium oxysporum, Phytophthora nicotianae, Phytophthora cactorum)の病原菌の検出を行った。DNAの抽出、PCR条件および電気泳動の手法は、上記実施例1と同手法により行った。
Claims (9)
- イチゴ組織または土壌を試料とし、試料中に混入可能性のある遺伝子を分析することによるイチゴの重要病害の検出方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする検出方法:
1)イチゴの重要病害に関連する少なくとも2種以上の病原菌の遺伝子配列を各々特異的に増幅しうる複数のプライマーを用いて遺伝子増幅処理を行う工程;
2)上記遺伝子増幅処理工程により得られた増幅産物の分子量を測定する工程;
3)測定した分子量から、増幅産物に関連する病原菌を同定する工程。 - 前記イチゴの重要病害が、炭疽病、疫病および/または萎黄病である請求項1に記載の検出方法。
- 前記イチゴの重要病害に関連する病原菌が、糸状菌から選択される少なくとも2種以上である、請求項1または2に記載の検出方法。
- 前記糸状菌が、グロメレラ(Glomerella)属、コレトトリカム(Colletotrichum)属、フィトフィトラ(Phytophthora)属、フザリウム(Fusarium)属のいずれかに属する請求項3に記載の検出方法。
- 複数のプライマーが、各病原菌のリボソームRNA遺伝子のITS(internal transcribed spacer)領域の部分を含む塩基配列を検出しうるプライマーである、請求項1〜4のいずれか1に記載の検出方法。
- 請求項1〜5のいずれか1に記載の検出方法に使用する遺伝子増幅用プライマー。
- 請求項6に記載のプライマーであり、以下の1)〜10)のいずれかに示す塩基配列、並びに各塩基配列のうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなり、病原菌の遺伝子配列を特異的に増幅しうるプライマー機能を有するオリゴヌクレオチドから選択されるいずれかのオリゴヌクレオチドを含む、イチゴの重要病害検出用の遺伝子増幅用プライマー:
1)GTAGGGTCTCCGCGACCCT(配列番号1);
2)CCTAAACTCTGTTTCTATATGTAAC(配列番号2);
3)TTCCTACCTGATCCGAGGTCA(配列番号3);
4)GCCGGCCCCACCACGGGGA(配列番号4);
5)AAGGGCCCACGTGTGCCGTG(配列番号5);
6)CTTCGGCCTGAGCTAGTAGCTTT(配列番号6);
7)ATGCATACCGAAGTACACACACAT(配列番号7);
8)CAATAGTTGGGGGTCTTATTTGGC(配列番号8);
9)ATGCATACCGAAGTACACATTAAG(配列番号9);
10)ctatatgtaacttctgagtaaaacc(配列番号10)。 - プライマー機能を有する少なくとも2種のオリゴヌクレオチドを1対とし、以下のA)〜E)のいずれかの組み合わせからなるオリゴヌクレオチドのセットであって、請求項1〜5のいずれか1に記載の検出方法に使用するイチゴの重要病害検出用の遺伝子増幅用プライマーセット:
A)配列番号1に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号3に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、2種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ;
B)配列番号4に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号5に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、2種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ;
C)配列番号2に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号3に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、2種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ;
D)配列番号8に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号9に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、2種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ;
E)配列番号6に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号7に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、1〜3個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、2種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ。 - 請求項8のA)〜E)のいずれかのオリゴヌクレオチドの組み合わせからなる遺伝子増幅用プライマーセットを、少なくとも2セット以上含む、イチゴの重要病害の検出用キット。
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