KR101642772B1

KR101642772B1 - 고추 탄저병 검출용 조성물 및 이를 이용한 고추 탄저병 검출 방법

Info

Publication number: KR101642772B1
Application number: KR1020140158533A
Authority: KR
Inventors: 안일평; 배신철; 박상렬; 황덕주
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2014-11-14
Filing date: 2014-11-14
Publication date: 2016-07-27
Also published as: KR20160057655A

Abstract

본 발명은 고추 탄저병 검출용 조성물 및 이를 이용한 고추 탄저병의 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 고추 탄저병 검출용 조성물은 고추 탄저병 유전체에 존재하는 세포자가포식 유전자(AUTOPHAGY8 gene; CaATG8)를 특이적으로 검출하여 고추 탄저병의 진전량을 객관적으로 수치화할 수 있으므로, 고추 탄저병의 분자생물학적 진단 방법으로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

고추 탄저병 검출용 조성물 및 이를 이용한 고추 탄저병 검출 방법{COMPOSITION FOR DETECTING PEPPER ANTHRACNOSE AND METHOD OF DETECTING PEPPER ANTHRACNOSE USING THE SAME}

본 발명은 고추탄저병을 검출하기 위한 조성물에 대한 것이다. 구체적으로 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 프로브를 포함하는 고추 탄저병 검출용 조성물에 대한 것이다.

탄저병의 병원체는 Colletotrichum acutatum이며, 주로 과실에 발생한다. 과실에는 처음에 감염부위가 수침상으로 약간 움푹 들어간 원형반점으로 나타나고, 진전되면 병반이 원형 내지 부정형의 겹무늬증상으로 확대된다. 병반부위에는 담황색 내지 황갈색의 포자덩어리가 형성되고, 심하게 병든 과실은 비틀어지고 미이라처럼 말라버린다. 성숙과의 병반은 간혹 흑색의 겹무늬증상을 띠는 것도 있으며, 수확 후 건조하는 과정에서 병증상이 나타나는 것도 있다.

고추 탄저병의 병원균은 종자 혹은 병든 부위에서 자낭각과 균사의 형태로 월동하여 1차전염원이 된다. 병의 전반은 주로 분생포자에 의해 이루어지며, 시설재배 포장보다는 노지포장에서 병 발생이 심하다. 노지포장에서는 여름철 장마기에 분생포자가 주로 비바람에 의해 전반된다. 노지재배의 풋고추에서는 7월 초순부터 병이 발생하기 시작하여 수확기까지 계속 발생한다. 우리나라의 경우 매년 전체 경작 면적의 20 30%가 피해를 입고 있으며, 매년 전국적으로 1,000 억원 가량의 경제 손실을 일으킨다. 심한 경우 80% 면적에서 피해가 발생하여 수확이 불가능해지는 경우도 있다.

고추 탄저병은 전세계적으로 고추 경작지에서 막심한 피해를 주고 있으며 앞으로 농업환경의 고온화 및 격발성 기후 변동과 더불어 그 피해가 계속 증가할 것으로 추정된다.

그러나 고추탄저병의 정확한 진단 및 예찰을 위한 분자생물학적 수단은 현재까지 개발된 바 없으며, 육안 관찰에 의한 병 진단 및 병 발생량 측정이 가장 널리 사용되고 있다. 하지만 육안으로 관찰될 정도의 병징이 진전되었다면 포장 내에는 이미 환경조건만 허락한다면 탄저병이 만연하기에 충분한 정도의 초기전염원이 존재하고 있다고 간주해야 한다. 따라서, 초기의 정밀하고 신속한 진단은 이 병의 방제 및 관리에 있어 매우 중요하다.

이에 본 발명자들은 종래의 문제점을 해결하기 위하여 신속하고 정확한 고추 탄저병 진단법을 연구하던 중에 고추 탄저병을 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

미국 특허공개공보 제2003-0099975호

본 발명의 목적은 고추 탄저병의 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 고추 탄저병을 검출하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 고추 탄저병의 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 프로브를 포함하는 고추 탄저병의 검출용 조성물을 제공한다.

상기 프라이머 세트는 CaATG8(Colletotrichum acutatum AUTOPHAGY8) 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 것이다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 CaATG8_249F(서열번호 1) 및 CaATG8_363F(서열번호 2) 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트이다. 본 발명의 또 다른 일 구체예에서, 상기 프라이머 세트를 이용하여 탄저병균(Colletotrichum acutatum), 벼 잎집무늬마름병균(Rhizoctonia solani), 벼 키다리병균(Fusarium fujikuroi), 검은무늬병균(Alternaria brassicicola) 및 독야청청 고추에서 PCR 증폭한 결과 탄저병균에서만 115 bp의 동일한 크기를 가지는 증폭산물을 검출하였으므로 본 발명의 프라이머 세트는 탄저병균(Colletotrichum acutatum)에 특이적임을 알 수 있었다.

상기 “CaATG8”는 탄저병균 세포자가포식 유전자(Colletotrichum acutatum AUTOPHAGY8 gene)를 의미하여, 탄저병 발생에 필수적인 병원성 유전자로서 모든 탄저병균에 한 개씩만 존재하는 것으로 보고되어 있다(Plant Cell. Apr 2009; 21(4): 12911304). 상기 CaATG8 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 유전자일 수 있다.

상기 프로브는 CaATG8 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 것이다.

상기 프라이머와 프로브를 동시에 이용하여 고추 탄저병을 검출할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 프라이머 세트는 고추 탄저병의 CaATG8 유전자의 일부인 115 bp를 증폭시키는 프라이머 세트일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “프라이머”는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다. 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “프로브(probe)”는 타깃 핵산서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 단일쇄 핵산 분자이다.

본 발명에서 이용되는 프라이머는 타겟 핵산에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.

또한, 본 발명은

1) 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;

2) 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 프로브를 제작하는 단계;

3) 상기 단계 1)의 추출된 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및

4) 상기 단계 3)에서 PCR로 증폭한 결과 생성된 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 고추 탄저병 검출방법을 제공한다.

상기 시료는 고추인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 프라이머 세트는 CaATG8 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 것이다.

상기 단계 3)의 PCR은 실시간(real time) PCR에 따라 실시되고, 본 발명의 프라이머 및 프로브는 유전자 증폭 반응에 이용된다.

상기 실시간 PCR은 Taqman 실시간 PCR 방법으로 실시되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 PCR에 의한 검출 또는 정량의 최소 DNA 양은 10 내지 100 fg(femtogram)인 것이 바람직하고, 최소 30 fg만 있어도 검출이 가능하므로 검출감도가 매우 높은 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어 “증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CPPCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loopmediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

실시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 분석하는 기술이다(Levak KJ, et al., PCRMethods Appl., 4(6): 357-62(1995)). PCR 생산물의 증가가 타겟 템플레이트의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 CT 값(threshold cycle)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다. 종래의 PCR 방법에 비해, 실시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태(plateau)에서 측정되는 반면에, 실시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플 리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.

PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 cycle 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 한계치(threshold)를 설정하면 한계치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 CT 값이 산출된다.

실시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 interchelating 방법(SYBR 그린I 방법), 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다. interchelating 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다.

한편, TaqMan 프로브는 전형적으로 5’-말단에 형광물질 및 3’-말단에 퀀처(예컨대, TAMRA 또는 비-형광 퀀처(NFQ))를 포함하는 프로브를 이용한다. TaqMan 프로브는 PCR 생산물의 내부 부위에 어닐링할 수 있도록 고안된다.

TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브 상에 퀀처에 의해 형광 발색이 억제된다. 연장 반응 시에 Taq DNA 폴리머라제가 갖는 5’to 3’뉴클레아제 활성에 의해 템플레이트에 혼성화한 TaqMan 프로브가 분해되어 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 퀀처에 의한 억제가 해제되어 형광은 나타낸다. 이때, TaqMan 프로브의 5’-말단은 프라이머의 3’-말단의 다운스트림에 위치하여야 한다. 즉, 프라이머의 3’-말단이 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 연장되는 경우, 이 중합효소의 5’to 3’뉴클레아제 활성에 의해 TaqMan 프로브의 5’-말단이 절단되어 리포터 분자의 형광 시그널이 발생하게 된다.

TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 모두 형광성 물질이다. 본 발명에 이용될 수 있는 형광성 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있으며 이에 한정되지 않는다.

아울러, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 프로브를 포함하는 고추 탄저병의 검출용 키트를 제공한다.

상기 프라이머 세트 및 프로브는 CaATG8 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 것이다.

상기 키트는 실시간 PCR용 키트이고, 상기 실시간 PCR에 의한 CaATG8 유전자의 검출의 최소 DNA 양은 10 내지 100 fg인 것이나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 CaATG8 유전자 특이적 프라이머 및 프로브를 이용하여 고추 탄저병을 검출 및 고추 탄저병 진전의 객관적 정량화를 할 수 있으므로 고추 탄저병의 분자생물학적 진단 방법으로 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 CaATG8 유전자 특이적 프라이머 세트 및 프로브의 위치를 나타낸 도이다.
도 2는 CaATG8 유전자 특이적 프라이머 세트(서열번호 1 및 서열번호 2)를 이용하여 고추 탄저병 특이적 검출 능력을 PCR로 확인한 도이다:
M, 사이즈 마커;
레인 1: Colletotrichum acutatum Ca_1;
레인 2: Colletotrichum acutatum Ca_2;
레인 3: Colletotrichum acutatum Ca_3;
레인 4: Colletotrichum acutatum Ca_4;
레인 5: Rhizoctonia solani strain Rs40101;
레인 6: Fusarium fujikuroi strain Fm41032;
레인 7: Alternaria brassicicola strain Ab44877; 및
레인 8: Capsicum annuum cv. Dokyachungchung.
도 3은 본 발명의 탄저병 CaATG8 유전자 특이적 프라이머 세트 및 프로브를 이용한 Taqman 실시간 PCR을 한 결과 플라스미드의 카피 수와 CP 값 간의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 탄저병 CaATG8 유전자 특이적 프라이머 세트 및 프로브를 이용한 Taqman 실시간 PCR을 한 결과 탄저병균의 유전체 DNA 양과 CP값 간의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 5는 독야청청 고추에 탄저병균 Ca_1 및 물을 처리한 결과 접종/처리 7일 후의 고추 탄저병의 진전과 이병 조직을 나타낸 도이다.
도 6은 탄저병균 Ca_1로부터 얻은 분생포자 현탁액을 접종원으로 하여 독야청청 고추 열매에 접종한 결과 일수의 경과에 따른 이병 조직 DNA 250 ng(nanogram) 당 탄저병균 DNA의 양(ng)을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

<실시예 1> 탄저병균 특이적 프라이머 및 프로브(probe) 제작

탄저병균 유전체에 특이적으로 한 카피(copy)씩 존재하는 CaATG8 유전자(Colletotrichum acutatum AUTOPHAGY8 gene; CaATG8)를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 CaATG8_249F(서열번호 1)(5’-GCC TAT CTA CCT CTA GAA GTC CAA-3’)/CaATG8_363R(서열번호 2)(5’-GGA CGA GGT ACT TCT TCT TAT CAA T-3’)를 제작하였고, 식물조직 내에서 탄저병 균주의 특이적 증식을 정량적으로 측정하기 위하여 Taqman_CaATG8(서열번호 3)(5’-gTT ATC TGC GAG AAG GTC GAG-3’)의 프로브를 제작하여 하기 표 1에 나타내었다. 서열번호 4는 CaATG8 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 나타낸 것이다.

	종류	이름	염기서열(5'→3')
서열번호 1	정방향 프라이머	CaATG8_249F	GCC TAT CTA CCT CTA GAA GTC CAA
서열번호 2	역방향 프라이머	CaATG8_363R	GGA CGA GGT ACT TCT TCT TAT CAA T
서열번호 3	프로브	Taqman_CaATG8	gTT ATC TGC GAG AAG GTC GAG

<실시예 2> 탄저병균 특이적 프라이머 및 프로브를 이용한 탄저병균 검출

탄저병균(Colletotrichum acutatum) 4균주(Ca_1, Ca_2, Ca_3, Ca_4), 및 탄저병균 이외 농업생태계에 흔히 존재하는 진균병원체인 벼 잎집무늬마름병균(Rhizoctonia solani), 벼 키다리병균(Fusarium fujikuroi), 검은무늬병균(Alternaria brassicicola)을 농촌진흥청 국립농업과학원 농업유전자원센터에서 각각 분양받았다. 그리고 각 균주를 PDbroth, 25℃, 150 rpm, 암조건에서 3일간 증식시켰으며 수거한 균사체는 균사체로 마쇄한 후 이로부터 본체 DNA를 얻었다. 또한, 독야청청 고추(Capsicum annuum)로부터 DNA를 준비하였다. 그 다음 상기 <실시예 1>에서 제작한 탄저병균 특이적 프라이머 세트를 이용하여 증폭하였다.

구체적으로, 본체 DNA와 CaATG8_249F(서열번호 1) 및 CaATG8_363R(서열번호 2) 프라이머 각각을 혼합한 후 Pfu Taq polymerase 조건에서 95 ℃에서 5분, 30×(95 ℃에서 15초, 62 ℃에서 15초 및 72 ℃에서 30초), 72 ℃에서 5분으로 PCR을 수행하고 그 산물의 5 ㎕를 전기영동하였다.

그 결과, 탄저병균을 제외한 모든 병원균 및 독야청청 고추에서 증폭산물을 보여주지 않았으나, 모든 탄저병균으로부터 115 bp의 동일한 크기를 가지는 증폭산물을 검출하였다(도 2). 이로부터 본 발명의 프라이머 CaATG8_249F 및 CaATG8_363F는 탄저병균(Colletotrichum acutatum)만을 특이적으로 검출함을 확인할 수 있었다.

<실시예 3> 고추 탄저병균 정량을 위한 CaATG8 유전자 분석

<3-1> CaATG8 유전자 클로닝

상기 <실시예 1>에서 제작한 탄저병균 특이적 프라이머를 이용하여 얻은 115 bp 크기의 증폭 산물을 pGEM-T 이지 벡터(Promega Corporation)에 제작사의 실험방법에 의하여 클로닝하였다.

<3-2> CaATG8 유전자 서열 분석

상기 <실시예 3-1>에서 증폭된 단편의 염기서열을 분석하기 위하여 pGEM-T Easy Vector(Promega Corporation)에 클로닝하였다. M13 정방향 프라이머( 5‘-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'; 서열번호 5)를 이용하여 염기서열을 분석하였다.

염기서열을 분석한 결과, 증폭된 단편이 CaATG8의 한 부분임을 확인하였다.

<실시예 4> 탄저병 특이적 프라이머 및 프로브를 이용한 정량 분석

<4-1> 플라스미드 카피수(copy)에 따른 CaATG8 유전자 증폭 검사

GaATG8 유전자 증폭의 정량적 신뢰도를 증가시키기 위하여 <실시예 1>과 같이 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 두 프라이머 사이의 염기서열을 기반으로 서열번호 3의 프로브를 제작하였다. 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 및 서열번호 3의 프로브를 혼합하고, 그리고 증폭산물을 농도별로 첨가한 후 Roche사의 Taqman real time master와 Light Cycler 480 Ⅱ 시스템을 이용하여 플라스미드 카피수(copy number) 별 유전자 증폭양상을 비교하였다. 사용한 프로그램은 95 ℃ 10초, 60 ℃ 30초였고 총 40 cycle의 증폭을 거치며 실시간 PCR을 수행하여 매회 증폭산물 생산으로 인한 형광물질 농도 증가를 측정하였다. CaATG8 유전자 카피수 대 CP(Crossing Point value) 값의 표준 곡선을 얻었다.

그 결과, 높은 선형 상관계수 R²=0.9999로 표준 곡선의 기울기 -3.3918 및 Y 절편 43.938이 얻어졌다(도 3). 이것은 CaATG8 유전자가 단일 유전자이기 때문에 감염된 조직 샘플 내의 CaATG8 유전자 카피수와 게놈 카피수가 동일하게 나타난 것을 의미한다.

또한, 실험결과 이 시스템은 약 200 copy 내외의 CaATG8 유전자를 검출할 수 있을 정도로 예민하여 높은 신뢰도로 정량할 수 있음을 확인할 수 있었다.

<4-2> 탄저병 균체 DNA양에 따른 CaATG8 유전자 증폭 검사 및 탄저병균 정량 분석

탄저병 CaATG8 유전자 특이적 프라이머 세트 및 프로브를 이용한 시스템의 감도를 본체 DNA 수준에서 정량 분석을 하였다.

구체적으로, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 및 서열번호 3의 프로브를 혼합한 후, 탄저병균 DNA의 PCR 혼합액 내 농도를 12.5 ng에서 0.125 femtogram까지 희석시킨 후 실시간 PCR을 수행하였다. 본체 DNA 양 대 CP 값에 대한 표준 곡선을 분석하였다.

그 결과, DNA 농도와 CP 값 사이의 선형 상관계수 R²=0.9996으로 높았고, 균체에서 각각 기울기 -3.7212 및 -3.7075, Y절편 21.835 및 21.754를 각각 얻었다(도 4). 상기 기울기 값은 각 균체에서 매우 유사하게 얻어진 것이다. 이러한 결과는 본 발명의 프라이머 및 Taqman 프로브가 아가로오스겔 상의 밴드의 상대적 밝기에 기초한 게놈 DNA의 정량분석에 매우 높은 정확도를 가진다는 것을 의미한다.

또한, 실험 결과 상기 CaATG8 유전자 특이적 프라이머 세트 및 프로브는 탄저병균 유전체 DNA(genomic DNA)의 약 30 femtogram까지 측정할 수 있음을 확인하였다(도 4).

<실시예 5> 이병 조직 내 탄저병균 DNA 양의 측정

<5-1> 탄저병균 접종원의 준비

CaATG8 유전자 증폭이 정상적으로 작동하는지 검사하기 위한 실험을 하였다. 독야청청 고추에 포장에서 얻어서 동정한 탄저병균(Ca_1) 및 물만을 처리하였고, 접종/처리 7일 후 얻은 이병 조직으로부터 병원균/고추 DNA 혼합체를 얻었다(도 5). 각 균주는 감자한천배지(potato dextrose agar; PDA)에 접종한 후 22 ℃, 광 조건에서 2주간 배양하여 분생포자생성을 유도하였다. 멸균수를 배지에 붓고 loop로 긁은 다음 미라클로스(miracloth)로 걸러 균사체가 제거된 분생포자 현탁액을 제조한 후, 포자농도를 1 × 10⁵/ml로 적정한 후 Tween20을 250 ppm이 되도록 가하였다.

<5-2> 독야청청 고추에 접종 및 이병 조직 내 탄저병균 DNA 양 측정

독야청청 고추 열매를 70% 에탄올로 30초간 표면살균한 후 멸균증류수로 3회 세척한 후 표면의 수분을 제거하였다. 그 다음, 곤충 표본칩으로 직경 0.2 mm, 깊이 0.2 mm의 상처를 낸 후 <실시예 5-1>에서 제조한 접종원 10 ㎕를 상처 위에 떨어뜨려 접종하였다. 그 후, 25 ℃, 100% 상대습도에서 5일간 동안 방치하였다. 실험 결과 250 ng의 이병 조직 DNA 중 69 ng이 병원균(Colletotrichum acutatum) DNA임을 확인하였다(도 6).

<110> Republic of korea <120> COMPOSITION FOR DETECTING PEPPER ANTHRACNOSE AND METHOD OF DETECTING PEPPER ANTHRACNOSE USING THE SAME <130> P14R12D0625 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaATG8_249F <400> 1 gcctatctac ctctagaagt ccaa 24 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaATG8_363R <400> 2 ggacgaggta cttcttctta tcaat 25 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Taqman_CaATG8 <400> 3 gttatctgcg agaaggtcga g 21 <210> 4 <211> 642 <212> DNA <213> Colletotrichum acutatum <220> <221> gene <222> (1)..(642) <223> Colletotrichum acutatum AUTOPHAGY8 <400> 4 atgcgatcca agttcaagga cgagcacccc tttgagaagc gtaaggctga ggccgagcgt 60 atccgccaga agtattctga tcgtattccc gtacgttgta actctccatt gcgtcggcct 120 catctcgtgg ctattcctct gtagtctctg tacagagata cagctccgcc gtttcgccgt 180 gactgcattc gtcagcttcg cgcgttattg gaggctgccc cacgttcccc gaccgtcacc 240 gccgatctgc ctatctacct acctttacaa gtccgaaagc tgacaaggcc ctcacaacac 300 aggttatctg cgagaaggtc gagaagtctg atatcgctac tattgataag aagaagtacc 360 tcgtccccgc cgacttgacg gttggtcagt tcgtctacgt catccgcaag cgcatcaagc 420 tctccccgga gaaggccatc ttcatcttcg tcgatgaggt gctgccgcct accgccgctc 480 tcatgagcag catctacgag gagcacaaag acgaggacgg gtacgtttca cgagcattct 540 gctaccttga cacaagctct ttgttgctga cctattgtgt tcagattcct ttacatcacc 600 tactccggcg agaacacctt tggcaacttt gagatggctt aa 642 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 forward primer <400> 5 gttttcccag tcacgac 17

Claims

서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 프로브(probe)를 포함하는 고추 탄저병 검출용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 CaATG8(Colletotrichum acutatum AUTOPHAGY8) 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 고추 탄저병 검출용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 프로브는 CaATG8(Colletotrichum acutatum AUTOPHAGY8) 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 고추 탄저병 검출용 조성물.
1) 고추 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
2) 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 프로브를 제작하는 단계;
3) 상기 단계 1)의 추출된 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)에서 PCR로 증폭한 결과 생성된 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 고추 탄저병 검출방법.
제 4항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 CaATG8(Colletotrichum acutatum AUTOPHAGY8) 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 고추 탄저병 검출방법.
제 4항에 있어서, 상기 프로브는 CaATG8(Colletotrichum acutatum AUTOPHAGY8) 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 고추 탄저병 검출방법.
제 4항에 있어서, 상기 단계 3)의 PCR은 실시간(real time) PCR에 따라 실시되는 것을 특징으로 하는 고추 탄저병 검출방법.
제 7항에 있어서, 상기 실시간 PCR은 Taqman 실시간 PCR에 따라 실시되는 것을 특징으로 하는 고추 탄저병 검출방법.
제 4항에 있어서, 상기 PCR에 의한 검출 또는 정량의 최소 DNA 양은 10 내지 100 fg(femtogram)인 것을 특징으로 하는 고추 탄저병 검출방법.
서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 프로브를 포함하는 고추 탄저병 검출용 키트.
제 10항에 있어서, 상기 프라이머 세트 및 프로브는 CaATG8(Colletotrichum acutatum AUTOPHAGY8) 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 고추 탄저병 검출용 키트.
제 10항에 있어서, 상기 키트는 실시간 PCR용 키트이고, 상기 실시간 PCR에 의한 CaATG8(Colletotrichum acutatum AUTOPHAGY8) 유전자의 검출의 최소 DNA 양은 10 내지 100 fg(femtogram)인 것을 특징으로 하는 고추 탄저병 검출용 키트.