KR101493910B1 - 딸기잠재원형반점 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

딸기잠재원형반점 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 딸기잠재원형반점 바이러스(SLRSV)를 특이적으로 검출하기 위한 RT-PCR 및 네스티드 PCR용 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물, 키트 및 이를 이용한 딸기잠재원형반점 바이러스의 특이적 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 검출방법은 식물체 종자와 조직 등을 대상으로 기존 항혈청을 이용한 진단법보다 1,000배 이상의 검출한계로 진단할 수 있고, 지금까지 알려진 모든 계통의 SLRSV들과 반응할 수 있으며 양성 및 음성 반응의 검증도 가능하기 때문에, 식물바이러스 RT-PCR 진단키트의 산업화와 수입 식물체의 검역현장에서 SLRSV의 검사에 효율적으로 이용할 수 있다.

Description

딸기잠재원형반점 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도{PRIMER SET FOR DETECTING STRAWBERRY LATENT RINGSPOT VIRUS AND USE THEREOF}
본 발명은 딸기잠재원형반점 바이러스를 특이적으로 검출하기 위한 PCR용 프라이머 세트에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은, 딸기잠재원형반점 바이러스를 특이적으로 검출하기 위한 RT-PCR 및 네스티드 PCR용 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물, 키트 및 이를 이용한 딸기잠재원형반점 바이러스의 특이적 검출방법에 관한 것이다.
딸기잠재원형반점 바이러스(Strawberry latent ringspot virus; SLRSV)는, 분류학적으로 Secoviridae과 Nepovirus속에 속하며, 바이러스 Group IV (+) sense ssRNA 바이러스로 분류된다. SLRSV는 식물병원성 바이러스로 감염된 식물에서는 전체적으로 왜소화 현상이 일어나며, 특히 잎에서는 비정상적인 색과 모양이 보이는 증상이 나타나는데, 이 때문에 작물의 양적, 질적 손실이 발생한다. SLRSV의 입자는 지름이 약 34 nm로 정방형이다. 핵산은 M (97S)과 B (130S), 두 가지의 단편으로 구성되어 있다.
SLRSV는 선충 (Xiphinema diversicaudatum과 X. coxi) 또는 종자로 전염이 되며, 주요 기주로는 셀러리, 아스파라거스, 딸기, 백합, 수선화, 살구, 앵두, 자두, 복숭아, 루바브, 까막까치밥나무, 레드 커런트, 장미, 블랙베리, 흰토끼풀 및 포도 덩굴나무 등으로 기주 범위가 매우 넓으며 칠엽수, 홉열매, 파스닙 및 자두나무에도 감염될 수 있다.
SLRSV는 우리나라의 검역대상 병원체로서 수입되는 여러 가지 식물체로부터 이를 검출할 수 있는 진단법을 필요로 한다. 지금까지 SLRSV를 진단하기 위하여 주로 ELISA 방법을 사용하고 있으나, 식물체 추출물과 항혈청의 비특이적 반응으로 오진단하는 경우가 종종 있어왔다. 또한 검사할 종자에서 SLRSV의 감염율이 낮을 경우 ELISA 진단법으로는 검사에 실패할 가능성이 높다. 그리하여 이런 종자에서 바이러스를 검출하기 위해서는 일반적으로 ELISA 진단법보다 검출감도가 1,000배 정도 높은 PCR 진단법이 필요하다.
현재, 검역현장에서는 하나의 검사시료에 대하여 다양한 병원체의 진단을 수행하여야 되므로 여러 가지 진단법을 사용할 경우 많은 노동력과 검사비용이 소요된다. 그래서 각각의 병원체에 대하여 동일한 검사법의 개발이 필요하다. PCR 검사법으로 진단할 때, 특이적 반응의 강도가 낮아 판별이 곤란할 경우, 또는 다른 핵산과의 비특이적 반응을 일으킬 경우를 대비하여 병원체별 진단용 프라이머 은행의 구축과 PCR 양성 및 음성 반응을 검정할 수 있는 시스템을 필요로 한다.
한편, 분리주 특이적 프라이머를 진단에 사용할 경우 검사에 실패할 수 있기 때문에 바이러스 종 내에 존재하는 모든 분리주를 검출할 수 있는 종 특이 프라이머의 개발이 요구된다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 딸기잠재원형반점 바이러스를 특이적으로 검출하기 위한 RT-PCR 및 네스티드 PCR용 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물, 키트 및 이를 이용한 딸기잠재원형반점 바이러스의 특이적 검출방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 딸기잠재원형반점 바이러스의 특이적 검출을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머 세트로서, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열의 조합을 포함하되, 상기 조합은 정방향 프라이머(forward primer)가 서열번호 1, 서열번호 3 또는 서열번호 5이고, 역방향 프라이머(reverse primer)가 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14 또는 서열번호 15인 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 서열번호 3 및 서열번호 10로 이루어진 프라이머 세트와, 서열번호 1 및 서열번호 14으로 이루어진 프라이머 세트는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)용인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 서열번호 5 및 서열번호 12로 이루어진 프라이머 세트, 그리고 서열번호 3 및 서열번호 15으로 이루어진 프라이머 세트는 네스티드 중합효소연쇄반응(nested PCR)용인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 딸기잠재원형반점 바이러스의 특이적 검출을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 딸기잠재원형반점 바이러스의 특이적 검출을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 중합효소연쇄반응(PCR)용 키트는 양성대조군으로서 서열번호 17의 염기서열을 포함하는 플라스미드, 및 돌연변이-양성대조군으로서 서열번호 18의 염기서열을 포함하는 플라스미드를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은,
(a) 딸기잠재원형반점 바이러스를 검출하고자 하는 샘플로부터 추출한 RNA를 주형으로 상기 프라이머 세트를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 실시하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)로부터 얻어진 RT-PCR 산물을 주형으로 제4항에 따른 프라이머 세트를 사용하여 네스티드 중합효소 연쇄반응(nested PCR)을 실시하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)로부터 얻어진 nested PCR 산물의 크기를 확인하여 딸기잠재원형반점 바이러스의 감염여부를 판단하는 단계를 포함하는, 딸기잠재원형반점 바이러스 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 조성물, 키트 및 이를 이용한 검출방법을 이용하면, 식물 검체로부터 단시간 내에 전문장비 없이 고정밀도로 딸기잠재원형반점 바이러스(SLRSV)를 검출할 수 있다. 따라서 마늘이나 쪽파 등 식물 재배농가에 막대한 피해를 줄 수 있는 바이러스를 조기에 검출 가능하게 하여 보다 신속하고 효율적인 SLRSV 진단 시스템을 구축할 수 있을 뿐만 아니라, 이를 통해 바이러스 감염으로 인한 경제적 손실을 방지할 수 있을 것으로 기대된다.
또한, 본 발명에 따른 딸기잠재원형반점 바이러스(SLRSV) 검출용 프라이머 세트는, 식물체 종자와 조직 등을 대상으로 기존 항혈청을 이용한 진단법보다 1,000배 이상의 검출한계로 진단할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 딸기잠재원형반점 바이러스(SLRSV) 검출용 프라이머 세트는, 지금까지 알려진 모든 계통의 SLRSV들과 반응할 수 있고, 양성 및 음성 반응의 검증도 가능하다.
또한, 본 발명에 따른 딸기잠재원형반점 바이러스(SLRSV) 검출용 프라이머 세트는, 식물바이러스 RT-PCR 진단키트의 산업화와 수입 식물체의 검역현장에서 SLRSV의 검사에 효율적으로 이용할 수 있다.
도 1은, SLRSV 진단을 위해 설계한 프라이머 지도를 나타낸 것이다.
도 2는, SLRSV 진단용 프라이머의 1차 선발 결과를 나타낸 것이다.
도 3은, SLRSV 진단용 프라이머의 2차 선발 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 SLRSV 진단용 프라이머의 4차 선발 결과를 나타낸 것이다.
도 5는, 선발된 프라이머 조합들의 end-point PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 6은, 선발된 프라이머 조합들의 nested PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 7은, SLRSV 진단용 프라이머 세트 1 (N20/C50, 596bp)의 결합부위를 나타낸 것이다.
도 8은, SLRSV 진단용 프라이머 세트 2 (N10/C70, 624bp)의 결합부위를 나타낸 것이다.
도 9는, SLRSV 진단용 프라이머 구간을 포함하는 양성대조군의 산물과 최종 선발된 프라이머 조합들의 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 10은, SLRSV의 양성대조군(N10/C30, 1,077 bp)의 결합부위를 나타낸 것이다.
도 11은, SLRSV 돌연변이-양성대조군(N20/C50, 602bp)의 결합부위, nested PCR 프라이머 결합부위, 염기서열 삽입부위를 나타낸 것이다.
본 발명은 딸기잠재원형반점 바이러스(SLRSV)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, SLRSV를 검출하기 위한 최적의 RT-PCR용 프라이머 세트 및 이에 부합하는 검정용 네스티드 프라이머 세트(nested primer ser)와 이를 뒷받침할 수 있는 종 특이적 프라이머 은행 및 양성대조군을 포함하고 있다.
PCR(polymerase chain reaction)법은, DNA 또는 RNA의 특정영역을 튜브 내에 대량으로 증폭하는 획기적인 기술이다. 그 원리는 극히 단순하고, 쉽게 응용할 수 있기 때문에 순수 분자생물학 분야 이외에도 의학, 이학, 농학, 수의학, 식품과학, 환경과학 뿐만 아니라 고고학이나 인류학에 이르는 분야까지 그 활용범위를 넓혀가고 있다. PCR 증폭효율에 영향을 미치는 요인으로는 각 단계의 반응온도와 시간, cycle수, 반응액 조성(주형 DNA, dNTP농도, Mg2 + 농도 등) 등이 있지만, 프라이머 설계가 가장 중요하다.
RNA 검출법으로는 RT-PCR법이 개발되기 이전부터 Northern blot, dot blot, nuclease protection method, in situ hybridization법 등을 이용하여 왔다. RT-PCR법은 미량 분자의 검출 감도면에서 상기 종래의 방법들 보다 우수하고, 조작이 빠르고 간편하다. 특히 미량으로 존재하는 여러 종류의 시료를 동시에 해석하는 경우에 유용하므로 임상진단에도 폭넓게 응용하고 있다. 또한 RT-PCR법을 SSCP와 조합함으로써 mRNA의 미세한 구조이상을 고감도로 검출할 수 있어 이 방향의 임상응용도 시험되고 있다. RT-PCR법은 RNA 조제, 역전사 효소 반응(RT), PCR 등의 3단계로 나뉘어 진다. 검출감도는 1세포당 10분자 정도이지만, 실제는 상기의 3단계에 대응하는 RNA의 회수율, RT반응의 효율, PCR의 효율, 그 중에서도 시료의 DNA 혼입에 의한 증폭반응의 저해 유무등에 의해 최종산물량이 정해진다. 따라서 특히 미량의 RNA분자를 검출하거나 정량 해석을 목적으로 할 때에는 각 단계에 있어 효율을 가능한 한 높이는 노력이 필요하다. 본 발명을 위해 RT-PCR은 42℃, 60분의 역전사반응과 95℃, 10분의 denaturation 후 95℃에서 45초, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분 과정을 35회 반복 후, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시켰다.
네스티드 PCR(Nested PCR)은, 목적하는 영역의 처음의 PCR산물을 주형으로 처음에 사용한 프라이머의 위치보다 양쪽 모두 안쪽으로 프라이머의 위치를 설정하여 PCR을 실시함으로써, 목적 이외의 영역으로부터 유래하는 산물을 제거할 수 있다. 본 발명을 위해 PCR은 RT-PCR의 역전사반응을 제외한 나머지와 동일하게 반응시켰다.
Figure 112013076557020-pat00001

PCR로 유전자의 특정영역을 증폭하려면 프라이머가 되는 2종의 합성된 단일가닥 DNA가 필요하다. 프라이머의 설계와 그에 대응하는 재조건 설정이 PCR의 성패를 결정한다고 해도 과언이 아니다. 프라이머의 설계상 주의점은 길이, 프라이머간의 상보성, GC 함량, 프라이머 내의 2차구조, Tm 값, 사용농도 등이 있다.
PCR을 실시하려면 프라이머가 되는 2종의 합성 한가닥 DNA가 필요하다. 프라이머가 결합하는 위치에 따라 DNA 상의 어느 부분이 증폭되는지 결정된다. 또한 프라이머의 설계와 그 프라이머의 서열에 따라 PCR의 조건을 설정하여야 하며 이것이 PCR의 가장 중요한 요인이 된다. 표적 DNA의 상류(5')측의 sense strand(정방향), 하류(3')측의 antisense strand(역방향)의 프라이머를 선택한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1. SLRSV 검출용 프라이머의 설계 및 조합
SLRSV 검출용 프라이머의 설계를 위하여, 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information: NCBI)로부터, SLRSV의 3가지 주(strain)와, SLRSV와는 분류학적으로 유사한 2종의 세코비리데(Secoviridae) 염기서열을 다운로드하였다(표 1 참조).
[표 1] 종 특이적 염기서열 탐색을 위해 사용한 바이러스의 정보
Figure 112013076557020-pat00002
다운로드한 염기서열은, 도 1에 나타낸 바와 같이, 'fasta' format으로 정렬한 뒤 서열배열 프로그램(sequence alignment program)인 DNAMAN 패키지를 사용하여 다중배열(multiple alignment)하였다.
그 후, SLRSV의 종 특이적인 서열을 탐색한 후 약 4 Kb 중 '132-1,476' 부분을 대상으로 진단용 프라이머를 설계하였다. 설계한 프라이머는, 정방향(forward) 7가지(표 2-1)와 역방향(reverse) 9가지(표 2-2)의 총 16가지로서, 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.
[표 2-1] SLRSV 종에 공통인 염기서열로부터 설계한 정방향 프라이머 정보
Figure 112013076557020-pat00003
*는 GenBank accession number NC006965를 기준으로 작성된 것임.
[표 2-2] SLRSV 종에 공통인 염기서열로부터 설계한 역방향 프라이머 정보
Figure 112013076557020-pat00004
*는 GenBank accession number NC006965를 기준으로 작성된 것임.
이후, 이들 정방향 프라이머과 역방향 프라이머를 조합하여 PCR 증폭이 가능한 41가지 조합(세트)을 선발하였고, 각각의 RT-PCR 산물의 예상 크기(product size)를 포함하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
[표 3] SLRSV 진단용 프라이머 조합과 RT - PCR 산물의 예상 크기
Figure 112013076557020-pat00005

실시예 2. SLRSV 의 최적 프라이머 세트 선발
1) 최적 프라이머 세트 선발
실시예 1에서 SLRSV의 최적 진단용 프라이머 세트 선발을 위해 설계한 프라이머 41가지 조합으로 1-4차까지의 선발 과정을 진행하였다.
우선, 도 2에 나타낸 바와 같이, 1차 선발에서 41가지 조합 중 11가지, 즉 조합 10, 16, 20, 21, 24, 25, 26, 28, 29, 32, 및 36을 선발하였다. 이때 2차 선발 대상인 유연관계 바이러스의 목록과 4차 선발 대상인 기주 목록은 하기 표 4에 나타낸 바와 같다.
[표 4] 2차 선발 대상 바이러스 목록
Figure 112013076557020-pat00006

3차 선발은 기주관련 바이러스의 RNA를 확보하지 못하여 실험을 진행하지 못하였으므로, 2차 선발에서도 11가지 조합을 선발하였다(도 3 참조).
4차 선발 결과, 밴드의 끌림이 없으며 가장 깔끔한 결과를 보인 4가지 조합 (조합 21, 24, 25 및 32)을 선발하였다(도 4 참조).
상기에서 선발된 조합들로 end­point PCR (희석한계 실험)을 실시한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 각각 10-1, 10-2, 10-4 및 10-3의 민감도를 보였다.
한편, 각 lane 별 희석 배수는 다음과 같았다. Lane 1~8: SLRSV 원액~10-7 희석; lane 9: negative control; lane 10~17: SLRSV 원액~10-7 희석; lane 18: negative control; lane 19~26: SLRSV 원액~10-7 희석; lane 27: negative control; lane 28~35: SLRSV 원액~10-7 희석; lane 36: negative control.
2) nested PCR 프라이머 세트 설계
상기 선발된 조합들에 대하여 검정 시스템인 nested PCR 프라이머 조합을 설계하였다. 이 때 주형으로 사용되는 RT-PCR 산물은 각각 1/100 희석하여 사용하였으며, nested PCR 프라이머 조합의 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
[표 5] 검증용 nested PCR 프라이머 조합의 설계
Figure 112013076557020-pat00007
Nested PCR 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 모든 조합에서 밴드가 나타났으며, Nested PCR 프라이머는 밴드의 밝기와 두께, 비특이적인 밴드의 유무, 크기 (length) 및 선발된 조합과 산물과의 크기가 어느 정도 차이나는지 등을 고려하여 최종 선발하였다.
3) 프라이머 은행 구축
실험 결과, 조합 25와 조합 32를 SLRSV 최종 진단용 프라이머 세트로 선발하였고, 검정 시스템인 nested PCR 프라이머 역시 각각 한 세트씩 선발하였다. SLRSV를 검사하기 위한 최종 진단용 프라이머 세트, nested 프라이머 및 양성대조군의 크기를 하기 표 6에 정리하였으며, 프라이머 정보를 하기 표 7에 기재하였다.
[표 6] 최종 선발된 프라이머 조합
Figure 112013076557020-pat00008

[표 7] 최종 선발된 프라이머의 염기서열
Figure 112013076557020-pat00009

실시예 3. SLRSV 의 검출 및 양성대조군의 제작
1) SLRSV 의 검출
실시예 2에서 얻어진 최종 SLRSV 검출용 프라이머 세트 1과 세트 2를 사용하여 one-step 또는 two-step RT-PCR로 검사를 수행한 결과, 프라이머들이 각각의 상보적 위치에 결합하여 밴드를 형성함을 확인하였다. 이로써, 본 발명의 프라이머 세트는 SLRSV의 검출에 유용함을 알 수 있다.
이때 각각의 서열위치는 도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같다. 도 7은 SLRSV 진단용 프라이머 세트 1 (N20/C50, 596 bp)의 결합부위([ ] 부분)를 나타낸 것이고, 도 8은 SLRSV 진단용 프라이머 세트 2 (N10/C70, 624 bp)의 결합부위([ ] 부분)를 나타낸 것이다.
2) 양성대조군의 제작
양성대조군(positive control)으로 사용할 수 있도록 진단용 프라이머가 설계된 전체 영역을 포함하는 플라즈미드를 제조하였다. 도 9는 SLRSV 진단용 프라이머 구간을 포함하는 양성대조군의 산물과 최종 선발된 프라이머 조합들의 PCR 결과를 나타낸 것이다. 도 10은 SLRSV 양성대조군(N10/C30, 1,077bp)에서의 결합부위([ ] 부분)를 나타낸 것이다.
3) 돌연변이-양성대조군의 제작
SLRSV 검출시 양성대조군의 오염으로 인한 거짓양성이 나타날 경우를 대비하여 플라즈미드 서열의 일부를 변형한 돌연변이-양성대조군(mutation positive control)을 제작하였다. 도 11은, SLRSV 돌연변이-양성대조군(N20/C50, 602bp)에서의 결합부위([ ] 부분)과, Nested 프라이머 결합부위(< > 부분)와, 염기서열 삽입에 의한 돌연변이부위({ } 부분)를 나타낸 것이다.
돌연변이-양성대조군을 사용할 때에는 최종 SLRSV 진단용 프라이머 세트 1을 사용하여야 하며, nested 검정 역시 세트 1의 nested 프라이머를 사용해야 한다. 제작한 돌연변이-양성대조군을 양성대조군으로 사용하면, 검사 후에 양성반응이 나타난 시료의 염기서열을 분석할 때, 진짜 바이러스에 감염되어 있는 시료인지 아니면 본 발명의 양성대조군으로부터 오염된 것인지를 판단할 수 있다. 또한, 종 내에는 다양한 주(strain)가 있고 일부가 치환되어 있을 수 있으므로, 염기서열 확인시 산물의 크기에 약간 차이가 있을 수 있음을 고려해야 한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
<110> Animal and Plant Quarantine Agency <120> PRIMER SET FOR DETECTING STRAWBERRY LATENT RINGSPOT VIRUS AND USE THEREOF <130> PB13-11398 <160> 18 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STRAWBERRY LATENT RINGSPOT VIRUS N10 Forward <400> 1 taatgtgggc actaccgtct ac 22 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STRAWBERRY LATENT RINGSPOT VIRUS C10 Reverse <400> 2 cctcaggggc aaaactcc 18 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STRAWBERRY LATENT RINGSPOT VIRUS N20 Forward <400> 3 atggctttgc tatgatccct gtga 24 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STRAWBERRY LATENT RINGSPOT VIRUS C20 Reverse <400> 4 cactccactg ggcattctct tg 22 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STRAWBERRY LATENT RINGSPOT VIRUS N30 Forward <400> 5 tttatgcctg gtagacacga ttca 24 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STRAWBERRY LATENT RINGSPOT VIRUS C30 Reverse <400> 6 ggctccaccc aatcagaagt t 21 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STRAWBERRY LATENT RINGSPOT VIRUS N40 Forward <400> 7 gaaatgcccc tcacagatag tt 22 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STRAWBERRY LATENT RINGSPOT VIRUS C40 Reverse <400> 8 ggaggaacag caaacagaga acca 24 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STRAWBERRY LATENT RINGSPOT VIRUS N50 Forward <400> 9 aatgggcttt gctaacgact cct 23 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STRAWBERRY LATENT RINGSPOT VIRUS C50 Reverse <400> 10 ctgtggaacc aaagtaccga tagg 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STRAWBERRY LATENT RINGSPOT VIRUS N60 Forward <400> 11 tgggtggtag tggttctctg tttg 24 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STRAWBERRY LATENT RINGSPOT VIRUS C60 Reverse <400> 12 acagtgcctc cgcccatagc 20 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STRAWBERRY LATENT RINGSPOT VIRUS N70 Reverse <400> 13 tcttgggttg gaggattgtg agta 24 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STRAWBERRY LATENT RINGSPOT VIRUS C70 Reverse <400> 14 cctttccagt aacggtgatt c 21 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STRAWBERRY LATENT RINGSPOT VIRUS C80 Reverse <400> 15 taaatcaaaa tccacaacta cctg 24 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STRAWBERRY LATENT RINGSPOT VIRUS C90 Reverse <400> 16 tcccaagatc agcaacctca aa 22 <210> 17 <211> 1077 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STRAWBERRY LATENT RINGSPOT VIRUS Plasmid <400> 17 taatgtgggc actaccgtct acactctccc cttgataaga acttctctca aggatactga 60 atggggaagg tattacaaaa gttatacttt catgcgcttt aagccgacgg tccggttggt 120 ttcttcagct cctatccagg ccaaaggact tttgtggctt tgctatgatc cctgtgagac 180 tcttgctaaa tatcctagca gggaaagggc ccttatgctt caaggaactt ggtttatgcc 240 tggcaggcat gatccagtga cactcacgat tgatgaatta gcaacgccat ctggttattc 300 tataatgacc agtgaccata atggtgcctt taaggttgtc attataaaga accttgaaaa 360 ttttgaagtt gctgatctcg ggatggagct ttctctattc ctggatgttc aagacattgg 420 tatgggaatg ggccctgaga tgcctctcac agatagtttt ctgccacttc gtcaggttgt 480 ggtggatttt gatctgtcta caacaacccc gaaagggaaa gcccttgttg tgcctctcaa 540 ccctcttctt ccaggttttg atggggcaca gtggtaccca agctgttcgt cttccatatt 600 agaaaatcac cgttactgga aaggtaccct tgttttagag gtgattttta acctcccagc 660 tatgggggga ggtactgtgg aaatgggctt cgctaatgac tcctattctg gttgggagag 720 tgatgcctat cggtactttg gttccacagt ggtggatttg cgggctcacc ggttgttacg 780 tgccaaggtt cctctccatg gttatggtgg ttatctaatg ggtggtagtg gttctctttt 840 tgctgttcct ccactcactg attatggaca atctctgaga tttgtccttc tctttactgc 900 ccctctgcac attagcgatg ccacaaagaa ggggtcagta atggtccgtt atcttgggtt 960 ggaggattgt gagtacatac aaccaaccac ttccttggga agactgaacc cggcaaccac 1020 tctggtagct tcaggagctc ctgttgttca agttggaact tctgattggg tggagcc 1077 <210> 18 <211> 602 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STRAWBERRY LATENT RINGSPOT VIRUS Mutant Plasmid <400> 18 atggctttgc tatgatccct gtgagactct tgctaaatat cctagcaggg aaagggccct 60 tatgcttcaa ggaacttggt ttatgcctgg caggcatgat ccagtgacac tcacgattga 120 tgaattagca acgccatctg gttattctat aatgaccagt gaccataatg gtgcctttaa 180 ggttgtcatt ataaagaacc ttgaaaattt tgaagttgct gatctcggga tgctcgagga 240 gctttctcta ttcctggatg ttcaagacat tggtatggga atgggccctg agatgcctct 300 cacagatagt tttctgccac ttcgtcaggt tgtggtggat tttgatctgt ctacaacaac 360 cccgaaaggg aaagcccttg ttgtgcctct caaccctctt cttccaggtt ttgatggggc 420 acagtggtac ccaagctgtt cgtcttccat attagaaaat caccgttact ggaaaggtac 480 ccttgtttta gaggtgattt ttaacctccc agctatgggg ggaggtactg tggaaatggg 540 cttcgctaat gactcctatt ctggttggga gagtgatgcc tatcggtact ttggttccac 600 ag 602

Claims (9)

  1. 딸기잠재원형반점 바이러스의 특이적 검출을 위한 프라이머 세트로서,
    상기 프라이머 세트는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열의 조합을 포함하되,
    상기 조합은 정방향 프라이머(forward primer)가 서열번호 1, 서열번호 3 또는 서열번호 5이고, 역방향 프라이머(reverse primer)가 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14 또는 서열번호 15인, 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 3 및 서열번호 10으로 이루어진 프라이머 세트는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)용인 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 1 및 서열번호 14로 이루어진 프라이머 세트는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)용인 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
  4. 제1항에 있어서, 서열번호 5 및 서열번호 12로 이루어진 프라이머 세트는 네스티드 중합효소연쇄반응(nested PCR)용인 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
  5. 제1항에 있어서, 서열번호 3 및 서열번호 15로 이루어진 프라이머 세트는 네스티드 중합효소연쇄반응(nested PCR)용인 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
  6. 제1항에 따른 프라이머 세트를 포함하는, 딸기잠재원형반점 바이러스의 특이적 검출을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 조성물.
  7. 제1항에 따른 프라이머 세트를 포함하는, 딸기잠재원형반점 바이러스의 특이적 검출을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 키트.
  8. 제7항에 있어서, 양성대조군으로서 서열번호 17의 염기서열을 포함하는 플라스미드, 및 돌연변이-양성대조군으로서 서열번호 18의 염기서열을 포함하는 플라스미드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 중합효소연쇄반응(PCR)용 키트.
  9. (a) 딸기잠재원형반점 바이러스를 검출하고자 하는 샘플로부터 추출한 RNA를 주형으로 제2항 또는 제3항에 따른 프라이머 세트를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 실시하는 단계; 및
    (b) 상기 단계 (a)로부터 얻어진 RT-PCR 산물을 주형으로 제4항 또는 제5항에 따른 프라이머 세트를 사용하여 네스티드 중합효소 연쇄반응(nested PCR)을 실시하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)로부터 얻어진 nested PCR 산물의 크기를 확인하여 딸기잠재원형반점 바이러스의 감염여부를 판단하는 단계를 포함하는, 딸기잠재원형반점바이러스 검출방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107090047A (zh) * 2017-03-10 2017-08-25 兰州理工大学 同时检测五种草莓病毒的串联抗原表位肽及其鸡卵黄抗体的制备方法
KR101844657B1 (ko) * 2016-06-01 2018-04-02 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 딸기잠재원형반점바이러스 진단용 lamp 프라이머 세트 및 이를 포함하는 진단 키트

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