KR20110039575A - 바이로이드 ＰＳＴＶｄ 및 ＴＣＤＶｄ의 동시 검출 방법 - Google Patents
바이로이드 ＰＳＴＶｄ 및 ＴＣＤＶｄ의 동시 검출 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 피검식물 시료 유래의 RNA를 주형으로 하여, (i) PSTVd 게놈에 대응하는 DNA 염기 서열(PSTVd 게놈 대응 서열)의 염기 위치 18번째부터 114번째의 염기 서열에 대한 상보 서열 중 16 내지 30 염기길이의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머와, (ii) 그 PSTVd 게놈 대응 서열의 염기 위치 127번째부터 147번째의 영역 내에 3' 말단이 위치하도록 해당 게놈 대응 서열상에 설계한 16 내지 30 염기길이의 1종 이상의 PSTVd 검출용 정방향 프라이머와, (iii) 그 PSTVd 게놈 대응 서열의 염기 위치 210번째부터 224번째의 영역 내에 3' 말단이 위치하도록 해당 게놈 대응 서열상에 설계한 16 내지 30 염기길이의 1종 이상의 TCDVd 검출용 정방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 이용한 핵산 증폭을 행하여, 상기 역방향 프라이머와 PSTVd 검출용 정방향 프라이머에 의한 핵산 증폭 및 상기 역방향 프라이머와 TCDVd 검출용 정방향 프라이머에 의한 핵산 증폭의 유무를 판정함으로써, 피검식물 중의 바이로이드 PSTVd 및 TCDVd를 구별하여 검출하는 것을 포함하는, 바이로이드의 검출 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 바이로이드의 검출 방법 및 바이로이드 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다.
토마토 황화 위축 바이로이드(Tomato chlorotic dwarf viroid; TCDVd) 및 감자 걀쭉 바이로이드(Potato spindle tuber viroid; PSTVd)는 가지과 식물(예를 들면, 감자, 토마토, 페튜니아 등)을 중심으로 하여 다양한 숙주식물에 감염되어, 감자에서의 걀쭉 감자류 증상이나 토마토에서의 황화·잎말림 증상 등의 병징을 야기하는 중요 식물병해이다. TCDVd는 최근까지 일본 국내에서의 발생이 확인되지 않았지만, 2007년에 히로시마켕에서 토마토에서의 감염이 확인되었다. 한편, PSTVd는 일본 국내에서 발생되지 않은 바이로이드로서, 일본에서는 식물 방역상 침입 경계를 요하는 병원체로 인식되어 있다.
바이로이드는 바이러스를 닮은 성질을 가지는 저분자의 핵산 병원체로서, 식물에 기생하여 왜소화나 기형 증상을 야기하는 것으로 알려져 있다. 바이로이드는 분자량이 3만 내지 81만 정도인 단일쇄의 환상 RNA로 이루어지고, 구조 단백질을 결여하고 있다. 바이로이드는 바이러스의 10분의 1 내지 100분의 1 정도의 크기밖에 되지 않아 전자 현미경으로 시인하는 것이 용이하지 않은 점이나, 구조 단백질을 결여하기 때문에 항원성을 가지지 않는 점에서, 미생물이나 바이러스의 일반적 검출 방법으로의 검출이 곤란하다. 이에 식물이 바이로이드에 감염되었는지 여부의 진단은 그의 병징으로 판정하는 생물 검정에 의해 행하는 경우가 많지만, 이 방법에는 병징이 나타날 때까지 장시간을 요하는 경우가 있는 점, 또한 환경 조건이나 품종에 따라 병징에 차이가 생기는 경우가 있는 점 등의 문제가 있다. 최근에는 분자 생물학적 검출 기술에 기초한 유전자 진단법이 바이로이드 검출에 이용되게 되었다(예를 들면, 특허문헌 1).
바이로이드 PSTVd 및 TCDVd는 모두 토마토 등의 가지과 식물에 감염되기 때문에, 이들을 구별하여 검출하는 기술이 필요한 것으로 여겨지고 있다. 그러나, PSTVd와 TCDVd는 동일한 포스피바이로이드속에 속하는 근연종으로, PSTVd와 TCDVd의 전체 게놈 서열은 서로 85％ 이상의 상동성(서열 동일성)을 갖기 때문에, 종래 방법의 대부분은 양자를 식별할 수 없다. 한편, 바이로이드 PSTVd 및 TCDVd가 속하는 포스피바이로이드속을 검출하기 위한 RT-PCR 어세이나 바이로이드 PSTVd와 TCDVd를 따로따로 검출하기 위한 RT-PCR 어세이는 알려져 있지만(비특허문헌 1), 이들 방법에는 동일 반응액 중에서 PSTVd와 TCDVd를 구별하여 양성 검출할 수 없다는 문제가 있다. 하나의 반응 혼합액 중에서 복수의 표적 핵산을 증폭하는 수법으로서 멀티플렉스 PCR법이 알려져 있지만, 상동성이 높은 근연종의 핵산에 대해서는 프라이머의 비특이적 결합이 생기기 쉬운 점 등에서, 멀티플렉스 PCR을 근연종간의 식별에 적용하는 것은 매우 곤란한 것이 일반적이다.
Rudra P. Singh, et al., Journal of General Virology (1999), 80, 2823-2828
본 발명은 바이로이드 PSTVd와 TCDVd를 구별하면서 동시에 검출하는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 거듭한 결과, 동일 반응액 중에서 PSTVd와 TCDVd의 쌍방을 서로 용이하게 구별 가능한 핵산 증폭 단편으로서 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제작하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하를 포함한다.
[1] 피검식물 시료 유래의 RNA를 주형으로 하여, (i) 서열번호 1의 염기 위치 18번째부터 114번째의 염기 서열에 대한 상보 서열 중 16 내지 30 염기길이의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머와, (ii) 서열번호 1의 염기 위치 127번째부터 147번째의 영역 내에 3' 말단이 위치하도록 서열번호 1의 염기 서열 상에 설계한 16 내지 30 염기길이의 1종 이상의 PSTVd 검출용 정방향 프라이머와, (iii) 서열번호 1의 염기 위치 210번째부터 224번째의 영역 내에 3' 말단이 위치하도록 서열번호 1의 염기 서열 상에 설계한 16 내지 30 염기길이의 1종 이상의 TCDVd 검출용 정방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 이용한 핵산 증폭을 행하고, 상기 역방향 프라이머와 PSTVd 검출용 정방향 프라이머에 의한 핵산 증폭 및 상기 역방향 프라이머와 TCDVd 검출용 정방향 프라이머에 의한 핵산 증폭의 유무를 판정함으로써, 피검식물 중의 바이로이드 PSTVd 및 TCDVd를 구별하여 검출하는 것을 포함하는, 바이로이드의 검출 방법.
이 방법에서 사용하는 프라이머 세트의 바람직한 일 실시 형태에서는, 상기 역방향 프라이머가 서열번호 3의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 1종 이상의 PSTVd 검출용 정방향 프라이머가 서열번호 15의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머, 서열번호 16의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 서열번호 17의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 프라이머를 포함하고, 그리고 1종 이상의 TCDVd 검출용 정방향 프라이머가 서열번호 5의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함한다.
이 방법에서 사용하는 프라이머 세트의 바람직한 다른 실시 형태에서는, 상기 역방향 프라이머가 서열번호 3의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 1종 이상의 PSTVd 검출용 정방향 프라이머가 서열번호 4의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하고, 그리고 1종 이상의 TCDVd 검출용 정방향 프라이머가 서열번호 5의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함한다.
본 발명에 따른 바이로이드의 검출 방법에서는 상기 프라이머 세트를 하나의 반응액 중에서 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 이 검출 방법에서는 피검식물이 가지과 식물인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 방법에서는, 바람직하게는 핵산 증폭이 역전사 공정과 멀티플렉스 PCR 공정을 포함하는 RT-PCR이다. 그 경우, 적합하게는 역전사 공정에서는 상기 역방향 프라이머가 핵산 증폭에 사용되며, 멀티플렉스 PCR 공정에서는 역방향 프라이머, 1종 이상의 PSTVd 검출용 정방향 프라이머, 및 1종 이상의 TCDVd 검출용 정방향 프라이머가 핵산 증폭에 사용된다.
본 발명에 따른 방법에서 사용하는 프라이머 세트에서는 상기 역방향 프라이머, PSTVd 검출용 정방향 프라이머 및 TCDVd 검출용 정방향 프라이머 중 적어도 1개가 표지 프라이머인 것도 바람직하다.
[2] 서열번호 1의 염기 위치 18번째부터 114번째의 염기 서열에 대한 상보 서열 중 16 내지 30 염기길이의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머와, 서열번호 1의 염기 위치 127번째부터 147번째의 영역 내에 3' 말단이 위치하도록 서열번호 1의 염기 서열 상에 설계한 16 내지 30 염기길이의 1종 이상의 PSTVd 검출용 정방향 프라이머와, 서열번호 1의 염기 위치 210번째부터 224번째의 영역 내에 3' 말단이 위치하도록 서열번호 1의 염기 서열 상에 설계한 16 내지 30 염기길이의 1종 이상의 TCDVd 검출용 정방향 프라이머를 포함하는, 바이로이드 PSTVd 및 TCDVd 검출용 프라이머 세트.
본 발명에 따른 프라이머 세트의 바람직한 일 실시 형태에서는, 상기 역방향 프라이머가 서열번호 3의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 1종 이상의 PSTVd 검출용 정방향 프라이머가 서열번호 15의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머, 서열번호 16의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 서열번호 17의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 프라이머를 포함하고, 그리고 1종 이상의 TCDVd 검출용 정방향 프라이머가 서열번호 5의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트의 바람직한 다른 실시 형태에서는 상기 역방향 프라이머가 서열번호 3의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 1종 이상의 PSTVd 검출용 정방향 프라이머가 서열번호 4의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하고, 그리고 1종 이상의 TCDVd 검출용 정방향 프라이머가, 서열번호 5의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트에서는 상기 역방향 프라이머, PSTVd 검출용 정방향 프라이머 및 TCDVd 검출용 정방향 프라이머 중 적어도 1개가 표지 프라이머인 것이 바람직하다.
[3] 상기 [2]에 기재된 프라이머 세트를 포함하는, 바이로이드 검출용 키트.
본 발명은 추가로 이하를 포함한다.
[4] 피검식물 시료 유래의 RNA를 주형으로 하여, 서열번호 3의 염기 서열로 이루어지는 제1의 올리고뉴클레오티드 프라이머와, 서열번호 4의 염기 서열로 이루어지는 제2의 올리고뉴클레오티드 프라이머와, 서열번호 5의 염기 서열로 이루어지는 제3의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 이용한 핵산 증폭을 행하고, 제1의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 제2의 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의한 핵산 증폭 및 제1의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 제3의 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의한 핵산 증폭의 유무를 판정함으로써, 피검식물 중의 바이로이드 PSTVd 및 TCDVd를 구별하여 검출하는 것을 포함하는, 바이로이드의 검출 방법.
본 방법에서는 상기 프라이머 세트를 하나의 반응 중에서 이용하는 것이 바람직하다. 본 방법은 피검식물이 가지과 식물인 경우에 특히 적합하다. 본 방법에서의 핵산 증폭으로서는 역전사 공정과 멀티플렉스 PCR 공정을 포함하는 RT-PCR이 바람직하다. 본 방법에서 이용하는 상기 제1, 제2 및 제3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 중 적어도 1개가 표지 프라이머인 것도 바람직하다.
[5] 서열번호 3의 염기 서열로 이루어지는 제1의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 서열번호 4의 염기 서열로 이루어지는 제2의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 및 서열번호 5의 염기 서열로 이루어지는 제3의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는, 바이로이드 PSTVd 및 TCDVd 검출용 프라이머 세트.
이 프라이머 세트에 있어서, 상기 제1, 제2 및 제3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 중 적어도 1개가 표지 프라이머인 것도 바람직하다.
[6] 상기 [5]의 프라이머 세트를 포함하는, 바이로이드 검출용 키트.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초가 되는 일본국 특허 출원 제2009-133144호의 명세서 및 도면에 기재된 내용을 포함한다.
본 발명의 방법에서는 바이로이드 PSTVd 및 TCDVd를 서로 구별하여 동시에 검출할 수 있다.
도 1은 프라이머 TCDVd-F, PSTVd-F 및 PS+TCV-R의, TCDVd와 PSTVd의 게놈 서열 상의 설계 위치를 나타낸다.
도 2는 프라이머 TCDVd-F, PSTVd-F 및 PS+TCV-R로 이루어지는 프라이머 세트를 이용한 멀티플렉스 RT-PCR의 증폭산물에 대한 전기영동 사진을 나타낸다. M은 100 bp 래더 마커(분자량 마커)를 나타낸다. 레인 1에서는 TCDVd+PSTVd 혼합 RNA, 레인 2에서는 PSTVd-RNA, 레인 3에서는 TCDVd-RNA, 레인 4에서는 바이로이드 무접종 토마토로부터의 RNA 추출물, 레인 5에서는 물을 주형으로 사용하였다. 흰색 삼각형은 191 bp에 대응하는 증폭산물, 망점 삼각형은 281 bp에 대응하는 증폭산물을 나타낸다.
도 3은 프라이머 TCDVd-F 및 PSTVd-F의 조합 이외의 후보 정방향 프라이머의 조합과, 역방향 프라이머 PS+TCV-R을 이용하여 바이로이드 TCDVd 및/또는 PSTVd로부터 증폭한 RT-PCR 증폭산물의 전기영동 사진을 나타낸다. 도 3A는 정방향 프라이머로서 PSV-F4와 TCV-F10의 조합을 사용한 증폭 결과를 나타낸다. 도 3B는 정방향 프라이머로서 PSV-F6과 멀티플렉스 TCDVd-F의 조합(좌측) 및 PSV-F6과 TCV-F10의 조합(우측)을 사용한 증폭 결과를 나타낸다. 도 3C는 정방향 프라이머로서 PSV-F6과 TCV-F12의 조합(좌측) 및 PSV-F6과 TCV-F13의 조합(우측)을 사용한 증폭 결과를 나타낸다. 각 패널의 좌측에 나타낸 위의 화살표는 PSTVd에 특이적인 281 bp의 밴드, 아래 화살표는 TCDVd에 특이적인 191 bp의 밴드의 위치를 나타내고 있다. 각 실험에서 사용한 주형 RNA는 레인 1: TCDVd+PSTVd 혼합 RNA, 레인 2: PSTVd-RNA, 레인 3: TCDVd-RNA, 레인 4: 바이로이드 무접종 토마토(건전(健全) 개체)로부터의 RNA 추출물이었다. 도면 중, M은 도 2와 동일한 100 bp 래더 마커(분자량 마커)이다.
도 4는 MpR 프라이머 PS+TCV-R, MpTF 프라이머 TCDVd-F, 및 멀티플렉스 PSTVd 검출용 정방향 프라이머 MpPTAF, MpPTCF 및 MpPCTF로 이루어지는 프라이머 세트를 이용한 멀티플렉스 RT-PCR의 증폭산물에 대한 전기영동 사진을 나타낸다. M은 100 bp 래더 마커(분자량 마커)를 나타낸다. 레인 1에서는 TCDVd+PSTVd 혼합 RNA, 레인 2에서는 PSTVd-RNA, 레인 3에서는 TCDVd-RNA, 레인 4에서는 건전한 바이로이드 무접종 토마토로부터의 RNA 추출물, 레인 5에서는 RNase 불포함수를 주형으로 사용하였다. 흰색 삼각형은 191 bp에 대응하는 증폭산물, 흰색 화살표는 270 bp에 대응하는 증폭산물을 나타낸다.
도 5는 MpR 프라이머 PS+TCV-R, MpTF 프라이머 TCDVd-F, 및 멀티플렉스 PSTVd 검출용 정방향 프라이머 MpPTAF, MpPTCF 및 MpPCTF로 이루어지는 프라이머 세트를 이용한 멀티플렉스 RT-PCR에 의한, 4 패턴의 변이체 PSTVd RNA(PSTVd-UA, PSTVd-UC, PSTVd-CA, PSTVd-CU)의 검출 실험 결과를 나타내는 사진이다. M: 100 bp 래더 마커(분자량 마커), 레인 1: PSTVd-UA, 레인 2: PSTVd-UC, 레인 3: PSTVd-CA, 레인 4: PSTVd-CU, 레인 5: RNase 불포함수. 흰색 화살표는 270 bp에 대응하는 증폭산물을 나타낸다.
도 2는 프라이머 TCDVd-F, PSTVd-F 및 PS+TCV-R로 이루어지는 프라이머 세트를 이용한 멀티플렉스 RT-PCR의 증폭산물에 대한 전기영동 사진을 나타낸다. M은 100 bp 래더 마커(분자량 마커)를 나타낸다. 레인 1에서는 TCDVd+PSTVd 혼합 RNA, 레인 2에서는 PSTVd-RNA, 레인 3에서는 TCDVd-RNA, 레인 4에서는 바이로이드 무접종 토마토로부터의 RNA 추출물, 레인 5에서는 물을 주형으로 사용하였다. 흰색 삼각형은 191 bp에 대응하는 증폭산물, 망점 삼각형은 281 bp에 대응하는 증폭산물을 나타낸다.
도 3은 프라이머 TCDVd-F 및 PSTVd-F의 조합 이외의 후보 정방향 프라이머의 조합과, 역방향 프라이머 PS+TCV-R을 이용하여 바이로이드 TCDVd 및/또는 PSTVd로부터 증폭한 RT-PCR 증폭산물의 전기영동 사진을 나타낸다. 도 3A는 정방향 프라이머로서 PSV-F4와 TCV-F10의 조합을 사용한 증폭 결과를 나타낸다. 도 3B는 정방향 프라이머로서 PSV-F6과 멀티플렉스 TCDVd-F의 조합(좌측) 및 PSV-F6과 TCV-F10의 조합(우측)을 사용한 증폭 결과를 나타낸다. 도 3C는 정방향 프라이머로서 PSV-F6과 TCV-F12의 조합(좌측) 및 PSV-F6과 TCV-F13의 조합(우측)을 사용한 증폭 결과를 나타낸다. 각 패널의 좌측에 나타낸 위의 화살표는 PSTVd에 특이적인 281 bp의 밴드, 아래 화살표는 TCDVd에 특이적인 191 bp의 밴드의 위치를 나타내고 있다. 각 실험에서 사용한 주형 RNA는 레인 1: TCDVd+PSTVd 혼합 RNA, 레인 2: PSTVd-RNA, 레인 3: TCDVd-RNA, 레인 4: 바이로이드 무접종 토마토(건전(健全) 개체)로부터의 RNA 추출물이었다. 도면 중, M은 도 2와 동일한 100 bp 래더 마커(분자량 마커)이다.
도 4는 MpR 프라이머 PS+TCV-R, MpTF 프라이머 TCDVd-F, 및 멀티플렉스 PSTVd 검출용 정방향 프라이머 MpPTAF, MpPTCF 및 MpPCTF로 이루어지는 프라이머 세트를 이용한 멀티플렉스 RT-PCR의 증폭산물에 대한 전기영동 사진을 나타낸다. M은 100 bp 래더 마커(분자량 마커)를 나타낸다. 레인 1에서는 TCDVd+PSTVd 혼합 RNA, 레인 2에서는 PSTVd-RNA, 레인 3에서는 TCDVd-RNA, 레인 4에서는 건전한 바이로이드 무접종 토마토로부터의 RNA 추출물, 레인 5에서는 RNase 불포함수를 주형으로 사용하였다. 흰색 삼각형은 191 bp에 대응하는 증폭산물, 흰색 화살표는 270 bp에 대응하는 증폭산물을 나타낸다.
도 5는 MpR 프라이머 PS+TCV-R, MpTF 프라이머 TCDVd-F, 및 멀티플렉스 PSTVd 검출용 정방향 프라이머 MpPTAF, MpPTCF 및 MpPCTF로 이루어지는 프라이머 세트를 이용한 멀티플렉스 RT-PCR에 의한, 4 패턴의 변이체 PSTVd RNA(PSTVd-UA, PSTVd-UC, PSTVd-CA, PSTVd-CU)의 검출 실험 결과를 나타내는 사진이다. M: 100 bp 래더 마커(분자량 마커), 레인 1: PSTVd-UA, 레인 2: PSTVd-UC, 레인 3: PSTVd-CA, 레인 4: PSTVd-CU, 레인 5: RNase 불포함수. 흰색 화살표는 270 bp에 대응하는 증폭산물을 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 후술하는 특정한 프라이머의 조합을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여, 피검 RNA를 주형으로 하는 핵산 증폭을 행하여, 소정의 증폭산물의 증폭 유무를 판정함으로써, 바이로이드 PSTVd 및 TCDVd를 구별하여 검출하는 것을 가능하게 하는 방법에 관한 것이다. 바이로이드 PSTVd 및 TCDVd의 전체 게놈 서열의 정보는 유전자은행(GenBank) 서열 데이터 베이스에 있어서, 각각 승인 번호 EU862231 및 AB329668에 기초하여 입수할 수 있다. 바이로이드 PSTVd의 승인 번호 EU862231에서 개시된 전체 게놈 서열(DNA 서열로 표시되어 있음)을 서열번호 1에, 바이로이드 TCDVd의 승인 번호 AB329668에서 개시된 전체 게놈 서열(DNA 서열로 표시되어 있음)을 서열번호 2에 나타내었다.
본 발명의 방법에서는 임의의 피검 RNA를 주형으로 사용할 수 있지만, RNA 병원체인 감자 걀쭉 바이로이드(Potato spindle tuber viroid; PSTVd) 및/또는 토마토 황화 위축 바이로이드(Tomato chlorotic dwarf viroid; TCDVd)를 포함하거나 또는 포함할 가능성이 있는 RNA를 주형으로서 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법에서는 바이로이드 PSTVd 또는 TCDVd가 존재 또는 감염되었는지의 여부를 시험해야 할 식물(피검식물)의 시료(피검식물 시료)에서 유래하는 RNA를 주형으로서 시험에 제공할 수 있다.
본 발명의 방법에 이용하는 피검식물은 한정되는 것은 아니지만, 바이로이드 PSTVd 및 TCDVd에 대하여 피감염성을 가지는 식물이 바람직하다. 그와 같은 피검식물로서는 가지과 식물(예를 들면, 가지속, 페튜니아속, 고추속, 담배속), 마편초과 식물(예를 들면, 마편초속), 국화과 식물(예를 들면, 국화속, 쑥갓속) 등을 들 수 있다. 구체예로서는, 감자, 토마토, 페튜니아, 피망, 담배, 버베나, 쑥갓 등을 들 수 있다. 바이로이드 PSTVd 또는 TCDVd의 감염 가능성이 있는 식물은 본 발명의 방법의 적용 대상으로서 특히 바람직하다.
피검식물 시료는 이들 피검식물의 식물체 전체일 수도 있고, 이로부터 채취한 식물체의 일부(예를 들면, 잎, 줄기, 과실, 꽃받침, 꽃잎, 뿌리, 괴경 또는 종자 등)일 수도 있고, 그의 세포 또는 세포 배양물(배양세포, 캘러스 등)일 수도 있다.
피검식물 시료 유래의 RNA는 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 피검식물 시료로부터 추출한 RNA(예를 들면, 전체 RNA) 또는 그의 정제물이다. 피검식물 시료로부터의 RNA 추출은 식물분자생물학 분야에서 관용되고 있는 RNA 추출 기술에 따라 추출할 수 있다. 예를 들면, 싱글스텝 RNA 정제법, 유리 흡착법, 산성 페놀 추출법 등의 공지된 임의의 RNA 추출법을 사용할 수 있다. RNA 추출은, 예를 들면 TRIzol(등록상표) 시약(Invitrogen), RNAiso(TaKaRa), RNeasyTM(QIAGEN), ToTALLY RNATM(Ambion) 등의 시판되는 RNA 추출 시약이나 시판되는 RNA 추출 키트(예를 들면, TRIzol(등록상표) Plus RNA 정제 키트(Invitrogen), MaxwellTM16 Total RNA 정제 키트(Promega) 등)을 이용하여 행할 수도 있다. 추출한 RNA는 RT-PCR에 제공하기 전에, 필요에 따라 HPLC 정제 등의 주지 기술에 의해 정제할 수도 있다.
본 발명의 바람직한 실시 형태에서는 소정의 프라이머 세트를 이용하여, 피검식물 시료 유래의 RNA를 주형으로 하여 핵산 증폭을 행한다. 핵산 증폭은 RNA를 주형으로 사용할 수 있는 임의의 핵산 증폭법(예를 들면, RT-PCR, NASBA법, Ribo-SPIATM 증폭법 등)에 따라 행할 수 있지만, 특히 역전사 PCR(RT-PCR)를 실시하는 것이 바람직하다. RT-PCR은 통상적으로는 주형 RNA로부터 역전사 효소 및 제1쇄 cDNA 합성 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성하는 역전사 공정과, 역전사 공정에서 합성된 cDNA(제1쇄 cDNA)를 증폭하는 PCR(중합효소 연쇄반응) 공정을 포함한다. RT-PCR의 상세한 절차에 대해서는, 예를 들면 문헌 [Sambrook, J. AND RUSSEL, D. W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press] 등의 분자생물학 분야의 텍스트를 참조할 수 있다. 본 발명의 방법에서는 핵산 증폭으로서 역전사 공정과 멀티플렉스 PCR 공정을 포함하는 RT-PCR을 행하는 경우에 특히 적합하다. 본 발명에서 "멀티플렉스 PCR"이란, 정방향 프라이머를 2종 이상 포함하는 프라이머 세트를 동일 반응액 중에서 이용하는 PCR을 말한다. 본 발명에서 "프라이머 세트"이란, 각각 1종 또는 2종 이상의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 조합한 것을 말한다. 여기서 본 발명에 따른 프라이머 세트는 역방향 프라이머를 1종만 포함하는 경우이더라도, 그 역방향 프라이머가 2종 이상의 정방향 프라이머와의 조합으로(프라이머 쌍으로서) 각각 별개의 증폭산물을 생성할 때에는 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트로 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에서의 핵산 증폭은 피검식물 시료 유래의 RNA로부터 소정의 프라이머 세트에 의해 목적하는 증폭산물이 직접 증폭될 수도 있고, 상기 RNA로부터 역전사된 DNA(cDNA)로부터 소정의 프라이머 세트에 의해 목적하는 증폭산물이 증폭될 수도 있다.
본 발명의 방법에서 이용하는 프라이머 세트는, 구체적으로는 이하의 (i) 내지 (iii)의 프라이머를 포함하는 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트이다:
(i) 서열번호 1의 염기 위치 18번째부터 114번째의 염기 서열에 대한 상보 서열 중 16 내지 30 염기길이의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머,
(ii) 서열번호 1의 염기 위치 127번째부터 147번째의 영역 내에 3' 말단이 위치하도록 서열번호 1의 염기 서열 상에 설계한 16 내지 30 염기길이의 1종 이상의 PSTVd 검출용 정방향 프라이머, 및
(iii) 서열번호 1의 염기 위치 210번째부터 224번째의 영역 내에 3' 말단이 위치하도록 서열번호 1의 염기 서열 상에 설계한 16 내지 30 염기길이의 1종 이상의 TCDVd 검출용 정방향 프라이머.
여기서 "서열번호 1의 염기 서열 상에 설계한 프라이머"란, 서열번호 1의 염기 서열의 일부를 포함하며, 서열번호 1의 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에 대하여 엄격한 조건하에서 혼성화할 수 있도록 설계한 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 의미한다. "엄격한 조건"은, 예를 들면 1×SSC, 0.1％ SDS 중, 60℃에서 세정하는 조건이다. 서열번호 1의 염기 서열 상에 설계한 프라이머는 서열번호 1의 염기 서열 유래의 연속한 16 내지 30 염기의 서열로 이루어지는 것일 수도 있고, 그 서열에 대하여 80％ 이상, 바람직하게는 85％ 이상, 더욱 바람직하게는 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 염기 서열로 이루어지는 것일 수도 있다.
이 프라이머 세트를 사용하는 경우, 역방향 프라이머와 PSTVd 검출용 정방향 프라이머에 의한 특이적인 증폭산물이 검출되면, PSTVd의 존재가 나타난 것이 된다. 또한, 역방향 프라이머와 TCDVd 검출용 정방향 프라이머에 의한 특이적인 증폭산물이 검출되면, TCDVd의 존재가 나타난 것이 된다.
또한, 본 발명에서 역방향 프라이머, PSTVd 검출용 정방향 프라이머 및 TCDVd 검출용 정방향 프라이머를 각각 1종씩 사용하는 경우, 각각 "제1의 프라이머", "제2의 프라이머" 및 "제3의 프라이머"라 칭할 수 있다.
본 발명의 방법에서 이용하는 프라이머 세트의 바람직한 일 실시 형태에서는, 상기 (i)의 역방향 프라이머는 서열번호 3의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머인 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 프라이머 세트는 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 상기 (i)의 역방향 프라이머를 1종 포함한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트에서는 1종 이상의 PSTVd 검출용 정방향 프라이머는 서열번호 15의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머, 서열번호 16의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 서열번호 17의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개, 바람직하게는 2개 이상, 보다 바람직하게는 전부의 프라이머를 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 프라이머 세트에서는 1종 이상의 TCDVd 검출용 정방향 프라이머는 서열번호 5의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 것이 바람직하다.
더욱 바람직한 실시 형태에서는 (i)의 역방향 프라이머로서 서열번호 3의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머, (ii)의 1종 이상의 PSTVd 검출용 정방향 프라이머로서 서열번호 15의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머, 서열번호 16의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 서열번호 17의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머, 그리고 (iii)의 1종 이상의 TCDVd 검출용 정방향 프라이머로서 서열번호 5의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 프라이머 세트를 바이로이드 검출에 이용할 수 있다. 이 프라이머 세트를 사용함으로써, 서열번호 1의 염기 위치 140번째 내지 141번째에 대응하는 게놈 서열로서 "UA", "UC", "CA", "CU"의 4 패턴 중 어느 하나를 가지는 다양한 계통의 PSTVd를 넓게 검출할 수 있다.
바람직한 다른 실시 형태에서는 본 발명의 방법에서 이용하는 프라이머 세트는 (i)의 역방향 프라이머로서의 서열번호 3의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머(제1의 프라이머: 5'-TCAGGTGTGAACCACAGGAA-3')와, (ii)의 1종 이상의 PSTVd 검출용 정방향 프라이머로서의 서열번호 4의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머(제2의 프라이머: 5'-TGGCAAAAGGCGCGGTG-3')와, (iii)의 1종 이상의 TCDVd 검출용 정방향 프라이머로서의 서열번호 5의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머(제3의 프라이머: 5'-CTTCCTTTGCGCGCCACT-3')를 포함하는 프라이머 세트이다.
본 발명의 "올리고뉴클레오티드 프라이머"는 편의상 서열번호 1, 3 내지 5 및 15 내지 17로 표시되는 DNA 서열을 인용하여 규정되어 있지만, DNA 프라이머뿐만 아니라 RNA 프라이머도 포함하는 것으로 한다. 그 올리고뉴클레오티드 프라이머가 RNA인 경우에는, 인용된 DNA 서열 중의 "T(티민)"은 "U(우라실)"로 바꿔 읽기로 한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 또한, DNA와 RNA의 키메라도 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 천연 염기만을 포함할 수도 있지만, 수식 염기를 포함할 수도 있다. 수식 염기로서는, 데옥시이노신, 데옥시우라실, S화 염기 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 수식 염기를 포함하는 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 그 수식 염기에 대응하는 천연 염기로 표시된 염기 서열로 규정되는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 범위에 포함되는 것으로 한다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 당업자라면 포스포아미다이트법 등의 통상법에 따라 합성할 수 있고, 예를 들면 시판되는 올리고뉴클레오티드 자동 합성 장치를 이용하여 화학 합성할 수도 있다.
본 발명에서는 상기 프라이머 세트에 포함되는 역방향 프라이머, PSTVd 검출용 정방향 프라이머 및 TCDVd 검출용 정방향 프라이머 중 적어도 1개가, 해당 올리고뉴클레오티드에 표지 물질을 부가하여 얻어지는 표지 프라이머인 것도 바람직하다. 역방향 프라이머(제1의 프라이머), PSTVd 검출용 정방향 프라이머(제2의 프라이머) 및 TCDVd 검출용 정방향 프라이머(제3의 프라이머)를 각각 1 종류씩 포함하는 프라이머 세트를 사용하는 경우, 예를 들면 서열번호 3의 염기 서열로 이루어지는 제1의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 서열번호 4의 염기 서열로 이루어지는 제2의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 및 서열번호 5의 염기 서열로 이루어지는 제3의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트를 이용하는 경우에는, 프라이머 세트에 포함되는 제1, 제2 및 제3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 중 적어도 1개가, 해당 올리고뉴클레오티드에 표지 물질을 부가하여 얻어지는 표지 프라이머인 것도 바람직하다. 표지 물질은 통상적으로는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단에 부가된다. 표지 물질로서는, 분자생물학 분야 또는 생화학 분야 등에서 일반적으로 사용되는 다양한 표지 물질을 사용할 수 있고, 예를 들면 형광 분자, 색소 분자, 방사성 동위원소, 비오틴, 디곡시게닌, 인산기, 아미노기, 펩티드 핵산(PNA)의 펩티드 부분, 및 태그 서열 등을 들 수 있다. 표지 프라이머를 사용함으로써, 얻어진 증폭산물의 검출이나 정제 등을 보다 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 예를 들면 RT-PCR에 의해 핵산 증폭을 행하는 경우에는, 역전사 공정은 역전사 효소 및 제1쇄 cDNA 합성 프라이머 등을 이용하여 통상법에 따라 행할 수 있다. 바이로이드는 환상 RNA이기 때문에, 역전사에는 바이로이드 PSTVd 및 TCDVd에 특이적인 상보 서열을 가지는 역방향 프라이머를 제1쇄 cDNA 합성 프라이머로서 이용하는 것이 바람직하다. 그와 같은 제1쇄 cDNA 합성 프라이머로서는, 바이로이드 PSTVd 및 TCDVd의 전체 게놈 서열을 나타내는 서열번호 1 및 2의 염기 위치 18번째 내지 114번째의 염기 서열에 대한 상보 서열 중 예를 들면 16 내지 30 염기의 서열, 보다 바람직하게는 18 내지 25 염기의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머가 바람직하다. 그와 같은 역방향 프라이머는 본 발명에 따른 프라이머 세트에 있어서 PSTVd 검출용 정방향 프라이머 및 TCDVd 검출용 정방향 프라이머와 조합하여 핵산 증폭에도 사용할 수 있다. 편리성이나 감도 등의 면에서 특히 바람직한 제1쇄 cDNA 합성 프라이머는 상기 프라이머 세트에 포함될 수 있는 서열번호 3의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머이다. 본 발명에서 "상보 서열"이란, 어느 염기 서열의 전장에 상보적인 염기 서열만으로 이루어지는 서열을 말한다. 역전사 반응은 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 주형 RNA, 제1쇄 cDNA 합성 프라이머, 역전사 효소, 및 dNTPs 등을 포함하는 역전사 반응액을, 42℃에서 30분, 99℃에서 5분 처리한 후, 4℃에서 유지함으로써 행할 수 있다.
RT-PCR을 실시하는 경우, 역전사 공정 후의 PCR 공정에서 상기 프라이머 세트를 이용하는 것이 바람직하다. 그 경우, 역방향 프라이머, PSTVd 검출용 정방향 프라이머 및 TCDVd 검출용 정방향 프라이머를 포함하는 상기 프라이머 세트(또는 제1 내지 제3의 프라이머를 포함하는 상기 프라이머 세트), 역전사 공정에서 얻어진 주형 cDNA, DNA 중합효소, 및 dNTPs 등을 함유하는 PCR 반응액을 제조하고, 그 반응액을 핵산 변성 온도, 어닐링 온도 및 신장 온도에서 복수 사이클 처리함으로써 PCR 반응을 실시할 수 있다. 바람직한 반응 조건의 상세예는 후술하는 실시예에 기재하고 있지만, 예를 들면, 반응액을 98℃에서 3분 후, 98℃에서 45초, 62℃에서 10초, 74℃에서 45초를 1 사이클로 하여 35 사이클 행하고, 이어서 74℃에서 5분, 그 후 바람직하게는 4℃에서 유지하는 사이클링 조건이다. 또한, 역전사 공정에서 제1쇄 cDNA 합성 프라이머로서 서열번호 3의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머 등의 프라이머 세트 중의 역방향 프라이머를 이용한 경우, 역전사 반응 완료 후의 반응액(역전사 산물)을 정제하지 않고 이용하여 PCR 반응액을 제조하면, 그 PCR 반응액 중에는 역방향 프라이머가 통상 잔존하기 때문에, PCR 반응액을 제조할 때에 제1의 프라이머를 다시 첨가하지 않아도 된다. 이와 같이 하여 행하는 RT-PCR에서는, 역전사 공정에서는 역방향 프라이머가 핵산 증폭에 사용되고, 계속되는 멀티플렉스 PCR 공정에서는 역전사 공정과 동일한 역방향 프라이머, 그리고 1종 이상의 PSTVd 검출용 정방향 프라이머, 및 1종 이상의 TCDVd 검출용 정방향 프라이머가 핵산 증폭에 사용된다.
본 발명에서는 상기 프라이머 세트를 이용한 핵산 증폭을 행한 후, 바이로이드 PSTVd에 특이적인 핵산 증폭이 발생했는지의 여부(프라이머 세트 중의 역방향 프라이머와 PSTVd 검출용 정방향 프라이머에 의한 핵산 증폭의 유무)와, 바이로이드 TCDVd에 특이적인 핵산 증폭이 발생했는지의 여부(프라이머 세트 중의 역방향 프라이머와 TCDVd 검출용 정방향 프라이머에 의한 핵산 증폭의 유무)를 판정함으로써, 바이로이드 PSTVd 및 TCDVd를 검출할 수 있다.
이들 핵산 증폭의 유무는 한정되는 것은 아니지만, 역방향 프라이머와 PSTVd 검출용 정방향 프라이머에 의해 특이적으로 증폭된 핵산 단편, 및 역방향 프라이머와 TCDVd 검출용 정방향 프라이머에 의해 특이적으로 증폭된 핵산 단편이 생성되었는지의 여부를 조사함으로써 판정할 수 있다. 예를 들면, 역방향 프라이머와 1종 이상의 PSTVd 검출용 정방향 프라이머 중 어느 하나를 이용하여 얻어지는 증폭산물이 반응액 중에 양성 검출되면, 이들 프라이머에 의한 핵산 증폭이 "유"라 판정되고, 그 결과는 피검식물 중에 바이로이드 PSTVd가 검출되었음을 의미한다. 한편, 역방향 프라이머와 1종 이상의 TCDVd 검출용 정방향 프라이머 중 어느 하나를 이용하여 얻어지는 증폭산물이 반응액 중에 양성 검출되면, 이들 프라이머에 의한 핵산 증폭이 "유"라 판정되고, 그 결과는 피검식물 중에 바이로이드 TCDVd가 검출되었음을 의미한다. 반대로, 이들 증폭산물이 반응액 중에 검출되지 않으면, 이들 프라이머에 의한 핵산 증폭은 "무"라 판정되고, 그 결과는 피검식물 중에 각 바이로이드가 검출되지 않았음을 의미한다.
역방향 프라이머와 PSTVd 검출용 정방향 프라이머에 의해 얻어지는 증폭 단편, 및 역방향 프라이머와 TCDVd 검출용 정방향 프라이머에 의해 얻어지는 증폭 단편은 임의의 핵산 검출법을 이용하여 검출할 수 있다. 그와 같은 핵산 검출법으로서는 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 겔 전기영동 해석, 모세관 전기영동 해석, 자동 서열분석기 등을 이용한 염기서열 결정해석, MALDI-TOF/MS 해석 등을 들 수 있다.
역방향 프라이머와 PSTVd 검출용 정방향 프라이머 또는 TCDVd 검출용 정방향 프라이머에 의해 얻어지는 증폭 단편의 크기는, 당업자라면 서열번호 1(PSTVd 게놈) 및 서열번호 2(TCDVd 게놈)의 염기 서열에 기초하여 예측할 수 있다. 바이로이드는 환상 RNA이기 때문에, 서열번호 1 (및 2)의 염기 위치 1번째부터 역방향 프라이머의 5' 말단을 설계한 염기 위치까지와, 서열번호 1 (및 2)의 PSTVd 검출용 정방향 프라이머 또는 TCDVd 검출용 정방향 프라이머의 5' 말단 염기를 설계한 염기 위치로부터 서열번호 1 (및 2)의 염기 위치 358번째(PSTVd) 또는 359번째(TCDVd)까지가, 연속한 영역으로서 증폭되게 된다.
예를 들면, 역방향 프라이머로서의 서열번호 3의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머; 1종 이상의 PSTVd 검출용 정방향 프라이머로서의 서열번호 15의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머, 서열번호 16의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 서열번호 17의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 프라이머, 바람직하게는 이들 3종의 프라이머; 및 1종 이상의 TCDVd 검출용 정방향 프라이머로서의 서열번호 5의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트를 사용한 경우, PSTVd RNA로부터는 270 bp의 단편이 증폭된다. 한편, TCDVd RNA로부터는 191 bp의 단편이 증폭된다.
그러나, 역방향 프라이머와 PSTVd 검출용 정방향 프라이머에 의한 증폭 단편, 및 역방향 프라이머와 TCDVd 검출용 정방향 프라이머에 의한 증폭 단편은, 예를 들면 검출 대상의 바이로이드 PSTVd 또는 TCDVd RNA에 염기의 결실이나 부가 등의 변이가 존재하는 경우에는 증폭 단편은 상기 예측 크기보다 다소(한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 1 내지 5 염기) 짧거나 또는 길 수도 있다. 그러나, 그와 같은 변이를 가지는 경우라도, 예를 들면 전기영동 해석에 의해 상기 예측 크기 부근에 명료한 증폭 밴드가 검출되면, 목적하는 증폭산물이 양성 검출된 것으로 판단할 수 있다. 혹은, 또는 추가로, 얻어진 증폭 단편의 염기서열 결정을 행하고, 서열번호 1로 표시되는 염기 서열과 비교함으로써, 그의 증폭 단편이 역방향 프라이머와 PSTVd 검출용 정방향 프라이머에 의한 증폭 단편 또는 역방향 프라이머와 TCDVd 검출용 정방향 프라이머에 의한 증폭 단편인지의 여부는 명확하면서 용이하게 판단할 수 있다.
바람직한 일 실시 형태에서는 핵산 증폭의 반응 종료 후의 반응액을 전기영동 해석, 예를 들면 1×TBE 버퍼 중에서의 1％ 아가로스 겔로의 전기영동 해석에 제공하고, 증폭 단편의 크기를 분자량 마커와 비교함으로써, 핵산 증폭 유무를 판정하면 좋다. 그 결과, 역방향 프라이머와 PSTVd 검출용 정방향 프라이머에 의한 증폭 단편의 예측 크기(예를 들면, 상기 예에서는 270 bp)에 대응하는 명료한 증폭 밴드가 검출된 경우에는 역방향 프라이머와 PSTVd 검출용 정방향 프라이머에 의한 핵산 증폭이 발생한 것으로 판정하여, 바이로이드 PSTVd가 검출된 것으로 결론지을 수 있다. 한편, 역방향 프라이머와 TCDVd 검출용 정방향 프라이머에 의한 증폭 단편의 예측 크기(예를 들면, 상기 예에서는 191 bp)에 대응하는 명료한 증폭 밴드가 검출된 경우에는, 역방향 프라이머와 TCDVd 검출용 정방향 프라이머에 의한 핵산 증폭이 발생한 것으로 판정하여, 바이로이드 TCDVd가 검출된 것으로 결론지을 수 있다. PSTVd에 특이적인 크기의 증폭 밴드와 TCDVd에 특이적인 크기의 증폭 밴드 둘 다가 검출된 경우에는, 바이로이드 PSTVd와 바이로이드 TCDVd 둘 다가 검출된 것으로 결론지을 수 있다. 이들 증폭 밴드는 비교적 짧은 증폭 단편을 충분히 분리 가능한 전기영동 겔(예를 들면 1％ 아가로스 겔)을 이용함으로써, 명확히 다른 증폭 밴드 패턴으로서 용이하게 인식할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시 형태에서는 역방향 프라이머, PSTVd 검출용 정방향 프라이머 및 TCDVd 검출용 정방향 프라이머를 각각 1종씩 사용하는 경우, 예를 들면 서열번호 3의 염기 서열로 이루어지는 제1의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 서열번호 4의 염기 서열로 이루어지는 제2의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 및 서열번호 5의 염기 서열로 이루어지는 제3의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하는 경우, 상기 프라이머 세트를 이용한 핵산 증폭을 행한 후, 바이로이드 PSTVd에 특이적인 핵산 증폭이 발생했는지의 여부(제1의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 제2의 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의한 핵산 증폭 유무)와, 바이로이드 TCDVd에 특이적인 핵산 증폭이 발생했는지의 여부(제1의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 제3의 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의한 핵산 증폭 유무)를 판정함으로써, 바이로이드 PSTVd 및 TCDVd를 검출한다.
이들 핵산 증폭의 유무는 한정되는 것은 아니지만, 제1의 프라이머(서열번호 3)와 제2의 프라이머(서열번호 4)를 이용한 특이적 증폭산물, 및 제1의 프라이머(서열번호 3)와 제3의 프라이머(서열번호 5)를 이용한 특이적 증폭산물이 얻어졌는지의 여부를 조사함으로써 판정할 수 있다. 예를 들면, 제1의 프라이머와 제2의 프라이머를 이용한 특이적 증폭산물이 반응액 중에 양성 검출되면, 이들 프라이머에 의한 핵산 증폭이 "유"라 판정되고, 그 결과는 피검식물 중의 바이로이드 PSTVd가 검출되었음을 의미한다. 한편, 제1의 프라이머와 제3의 프라이머를 이용한 특이적 증폭산물이 반응액 중에 양성 검출되면, 이들 프라이머에 의한 핵산 증폭이 "유"라 판정되고, 그 결과는 피검식물 중의 바이로이드 TCDVd가 검출되었음을 의미한다. 반대로, 이들의 특이적 증폭산물이 반응액 중에 검출되지 않으면, 이들 프라이머에 의한 핵산 증폭은 "무"라 판정되고, 그 결과는 피검식물 중의 각 바이로이드가 검출되지 않았음을 의미한다.
제1의 프라이머와 제2의 프라이머를 이용한 특이적 증폭산물, 및 제1의 프라이머와 제3의 프라이머를 이용한 특이적 증폭산물은 임의의 DNA 검출법을 이용하여 검출할 수 있다. 그와 같은 DNA 검출법으로서는, 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 겔 전기영동 해석, 모세관 전기영동 해석, 자동 서열분석기 등을 이용한 염기서열 결정해석, MALDI-TOF/MS 해석 등을 들 수 있다.
제1의 프라이머와 제2의 프라이머를 이용한 특이적 증폭산물은, 전형적으로는 서열번호 1(바이로이드 PSTVd 서열)의 염기 위치 115번째 내지 358번째 및 1번째 내지 37번째의 영역(환상 바이로이드 RNA 상에서는 실제로는 연속한 영역임)의 염기 서열로 이루어지는 281 bp의 핵산 증폭 단편이다.
그러나, 해당 증폭 단편의 염기 서열은, 예를 들면 검출 대상의 바이로이드 PSTVd가 다른 변이체인 경우 등에는 염기 서열 중에 다소의 변이를 포함할 수 있다. 따라서, 변이로서 염기의 결실이나 부가가 존재하는 경우에는, 그의 증폭 단편은 281 bp보다 다소(한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 1 내지 5 염기) 짧거나 또는 길 수도 있다. 그와 같은 변이를 가지는 경우라도, 예를 들면 전기영동 해석에 의해 281 bp 부근에 명료한 증폭 밴드가 검출되면, 제1의 프라이머와 제2의 프라이머를 이용한 특이적 증폭산물이 양성 검출된 것으로 판단할 수 있다. 또는, 얻어진 증폭 단편의 염기서열 결정을 행하여, 서열번호 1로 표시되는 염기 서열과 비교함으로써, 그의 증폭 단편이 제1의 프라이머와 제2의 프라이머를 이용한 바이로이드 PSTVd로부터의 특이적 증폭산물인지의 여부는 명확하면서 용이하게 판단할 수 있다.
한편, 제1의 프라이머와 제3의 프라이머를 이용한 특이적 증폭산물은, 전형적으로는 서열번호 2(바이로이드 TCDVd 서열)의 염기 위치 206번째 내지 359번째 및 1번째 내지 37번째의 영역(환상 바이로이드 RNA 상에서는 실제로는 연속한 영역임)의 염기 서열로 이루어지는 191 bp의 핵산 증폭 단편이다. 그러나, 해당 증폭 단편의 염기 서열은, 예를 들면 검출 대상의 바이로이드 TCDVd가 변이체인 경우 등에는, 염기 서열 중에 다소의 변이를 포함할 수 있다. 따라서, 변이로서 염기의 결실이나 부가가 존재하는 경우에는 그의 증폭 단편은 191 bp보다 다소(한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 1 내지 5 염기) 짧거나 또는 길 수도 있다. 그와 같은 변이를 가지는 경우라도, 예를 들면 전기영동 해석에 의해 191 bp 부근에 명료한 증폭 밴드가 검출되면, 제1의 프라이머와 제3의 프라이머를 이용한 특이적 증폭산물이 양성 검출된 것으로 판단할 수 있다. 또는, 얻어진 증폭 단편의 염기서열 결정을 행하여, 서열번호 2로 표시되는 염기 서열과 비교함으로써, 그의 증폭 단편이 제1의 프라이머와 제3의 프라이머를 이용한 바이로이드 TCDVd로부터의 특이적 증폭산물인지의 여부는 명확하면서 용이하게 판단할 수 있다.
바람직한 일 실시 형태에서는 핵산 증폭의 반응 종료 후의 반응액을 전기영동 해석, 예를 들면 1×TBE 버퍼 중에서의 1％ 아가로스 겔로의 전기영동 해석에 제공하고, 분자량 마커와 비교함으로써, 핵산 증폭의 유무를 판정하면 된다. 그 결과, 281 bp에 대응하는 명료한 증폭 밴드가 검출된 경우에는, 제1의 프라이머와 제2의 프라이머에 의한 핵산 증폭이 발생한 것으로 판정하여, 바이로이드 PSTVd가 검출된 것으로 결론지을 수 있다. 한편, 191 bp에 대응하는 명료한 증폭 밴드가 검출된 경우에는, 제1의 프라이머와 제3의 프라이머에 의한 핵산 증폭이 발생한 것으로 판정하여, 바이로이드 TCDVd가 검출된 것으로 결론지을 수 있다. 281 bp에 대응하는 명료한 증폭 밴드와 191 bp에 대응하는 증폭 밴드 둘 다가 검출된 경우에는, 바이로이드 PSTVd와 바이로이드 TCDVd 둘 다가 검출된 것으로 결론지을 수 있다. 281 bp와 191 bp에 대응하는 이들 증폭 밴드는 비교적 짧은 증폭 단편을 충분히 분리 가능한 전기영동 겔(예를 들면, 1％ 아가로스 겔)을 이용함으로써, 명확히 다른 증폭 밴드 패턴으로서 용이하게 인식할 수 있다.
본 발명에서는 이상과 같이 하여, 프라이머 세트에 포함되는 상기와 같은 2 세트 이상의 프라이머 쌍에 의한 핵산 증폭 유무의 판정 결과에 기초하여, 피검식물 중의 바이로이드 PSTVd 및 TCDVd를 구별하여 검출할 수 있다. 본 발명의 검출 방법을 이용하면, 바이로이드 PSTVd와 TCDVd를 서로 식별하는 것이 가능하다.
본 발명의 이러한 바이로이드 검출 방법은 한정되는 것은 아니지만, 상기 프라이머 세트를 하나의 반응 중에서 이용하여 핵산 증폭을 행하는 경우에 특히 적합하다. 이러한 핵산 증폭에 있어서, 역방향 프라이머와 PSTVd 검출용 정방향 프라이머, 및 역방향 프라이머와 TCDVd 검출용 정방향 프라이머를 따로 따로의 반응액에 함유시켜 별개의 핵산 증폭 반응(예를 들면 PCR 반응)을 행할 수도 있지만, 프라이머 세트를 구성하는 역방향 프라이머, PSTVd 검출용 정방향 프라이머 및 TCDVd 검출용 정방향 프라이머는 하나의 반응액 중에 포함시켜 이용함으로써 멀티플렉스 PCR을 행하는 것이 보다 바람직하다. 본 발명에서는 이러한 핵산 증폭에 있어서, 예를 들면 서열번호 3의 염기 서열로 이루어지는 제1의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 서열번호 4의 염기 서열로 이루어지는 제2의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 및 서열번호 5의 염기 서열로 이루어지는 제3의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하는 경우에는, 제1의 프라이머와 제2의 프라이머의 프라이머 쌍과, 제1의 프라이머와 제3의 프라이머 쌍을 따로 따로의 반응액에 함유시켜 별개의 핵산 증폭 반응(예를 들면 PCR 반응)을 행할 수도 있지만, 제1, 제2 및 제3의 프라이머를 포함하는 하나의 반응액을 이용함으로써 하나의 반응 중에서 PCR 반응을 행하는 것이 보다 바람직하다.
일반적으로, 3종 이상의 프라이머를 하나의 반응 중에서 동시에 사용하는 멀티플렉스 PCR은 동시해석이 가능해지기 때문에 편리하지만, 프라이머마다 특이적 반응 조건이 다르기 때문에, 복수의 특이적 증폭산물을 얻는 것이 곤란한 경우가 많다. 특히, 개개의 근연종에 특이적인 복수의 프라이머를 멀티플렉스 PCR에 사용하는 경우, 교차 반응의 가능성이 높아지기 때문에, 특이적 증폭산물을 얻는 것은 더욱 곤란해진다. 그러나, 본 발명의 방법에서는 서열 상동성이 높은 근연종 바이로이드 PSTVd와 TCDVd의 각각에 특이적인 프라이머를 하나의 반응 중에서 동시 사용하더라도, PSTVd와 TCDVd의 쌍방을 특이적으로 증폭할 수 있어, 각각의 바이로이드를 고감도로 서로 구별하여 검출할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 바이로이드 PSTVd와 TCDVd 둘 다를 주형 RNA로서 포함하는 샘플에 대해서도 각각의 바이로이드를 고감도이면서 특이적으로 검출할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 검출 방법에서 사용되는 상기 프라이머 세트도 제공한다. 본 발명에 따른 프라이머 세트는 (i) 서열번호 1의 염기 위치 18번째부터 114번째의 염기 서열에 대한 상보 서열 중 16 내지 30 염기길이의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머와, (ii) 서열번호 1의 염기 위치 127번째부터 147번째의 영역 내에 3' 말단이 위치하도록 서열번호 1의 염기 서열 상에 설계한 16 내지 30 염기길이의 1종 이상의 PSTVd 검출용 정방향 프라이머와, (iii) 서열번호 1의 염기 위치 210번째부터 224번째의 영역 내에 3' 말단이 위치하도록 서열번호 1의 염기 서열 상에 설계한 16 내지 30 염기길이의 1종 이상의 TCDVd 검출용 정방향 프라이머를 포함하는, 바이로이드 PSTVd 및 TCDVd 검출용 프라이머 세트이다.
본 발명에 따른 프라이머 세트는, 예를 들면 서열번호 3의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머인 역방향 프라이머와; 서열번호 15의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머, 서열번호 16의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 서열번호 17의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개(바람직하게는 전부)의 프라이머를 포함하는 1종 이상의 PSTVd 검출용 정방향 프라이머와; 서열번호 5의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 1종 이상의 TCDVd 검출용 정방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트일 수도 있다. 이 프라이머 세트는 각종 계통의 PSTVd를 TCDVd와 구별하여 검출할 수 있다. 본 발명에 따른 프라이머 세트에 포함되는 각 프라이머의 상세한 사항은 상기와 같으며, 예를 들면 각 프라이머는 표지 프라이머일 수도 있다. 역방향 프라이머, PSTVd 검출용 정방향 프라이머, 및 TCDVd 검출용 정방향 프라이머의 적어도 1개가 표지 프라이머인 프라이머 세트도, 본 발명의 바람직한 프라이머 세트의 예이다. 본 발명에 따른 이 프라이머 세트는 핵산 증폭, 예를 들면 역전사 공정과 멀티플렉스 PCR 공정을 포함하는 RT-PCR에 기초하여 바이로이드 PSTVd 및 TCDVd 검출을 행하는 경우에 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 프라이머 세트는 또한, 예를 들면 서열번호 3의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머(제1의 프라이머), 서열번호 4의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머(제2의 프라이머), 및 서열번호 5의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머(제3의 프라이머)를 포함하는 프라이머 세트일 수 있다. 이 프라이머 세트는 한정되는 것은 아니지만, 특히 바이로이드 PSTVd 및 TCDVd 검출용으로 바람직하다. 이 프라이머 세트에 포함되는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 상기와 같으며, 예를 들면 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 표지 프라이머일 수도 있다. 적어도 1개가 표지 프라이머인 상기 제1의 프라이머, 제2의 프라이머, 및 제3의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트도, 본 발명의 바람직한 프라이머 세트의 예이다. 본 발명에 따른 이 프라이머 세트는 핵산 증폭, 예를 들면 역전사 공정과 멀티플렉스 PCR 공정을 포함하는 RT-PCR에 기초하여 바이로이드 PSTVd 및 TCDVd 검출을 행하는 경우에 특히 바람직하다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기와 같은 프라이머 세트를 포함하는 바이로이드 검출용 키트도 제공한다. 본 발명에 따른 이 키트는 바이로이드 PSTVd 및 TCDVd 검출용 키트일 수도 있지만, 바이로이드 PSTVd 및 TCDVd를 포함하는 각종 바이로이드를 검출할 수 있는 키트일 수도 있다. 본 발명의 바이로이드 검출용 키트는 또 다른 시약, 용기, 사용설명서 등을 포함할 수도 있다. 상기 키트는, 예를 들면 역전사 효소, DNA 중합효소, dNTP 혼합액, 및 핵산 증폭 반응 버퍼 등의 역전사 시약 및 핵산 증폭용 시약, 및 RNA 추출용 시약 등을 포함할 수도 있다. 본 발명의 바이로이드 검출용 키트는 다양한 바이로이드(예를 들면 가지과 식물 감염성 바이로이드)에 대한 다른 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머 등의 바이로이드 검출용 시약을 포함할 수도 있다.
<실시예>
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명의 기술적 범위는 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
1. RNA의 추출
감자 걀쭉 바이로이드(Potato spindle tuber viroid; PSTVd)에만 감염된 토마토잎, 및 토마토 황화 위축 바이로이드(Tomato chlorotic dwarf viroid; TCDVd)에만 감염된 토마토잎으로부터 각각 이하와 동일한 절차로 RNA를 추출하였다.
우선, 상기 감염 잎 50 내지 100 mg에 TRIzol(등록상표) 시약(Invitogen) 1 mL를 첨가하여 마쇄하였다. 여기에 클로로포름 200 mL를 첨가하여 볼텍스에 건 후, 12000 g으로 15분간 원심 분리하였다. 얻어진 상청을 채취하고, 거기에 이소프로판올 200 mL를 가하여 혼합하고, 12000 g으로 10분간 원심 분리하였다. 상청을 폐기하고, 75％ 에탄올을 1 mL 가하고, 7500 g으로 5분간 원심 분리하였다. 또한, 이상의 조작에서의 원심 분리는 모두 2 내지 8℃에서 행하였다. 얻어진 침전을 건조시킨 후, RNA 프리수(Free water)(Sigma) 50 내지 100 mL를 농도에 따라 첨가하였다. 전체 RNA(total RNA)를 포함하는 이 용액을 후술하는 역전사 반응(RT-PCR)의 주형으로서 이용하였다.
2. 프라이머의 설계 및 RT-PCR
바이로이드 PSTVd와 TCDVd를 구별하여 검출하기 위한 멀티플렉스 RT-PCR 프라이머 후보는 PSTVd와 TCDVd의 전체 게놈 서열(각각 서열번호 1 및 2)에 기초하여 컴퓨터를 이용하여 설계하였다. 본 발명자들은 양 바이로이드의 상동성이 낮은 영역 중 특정 영역(PSTVd의 전체 게놈 서열을 나타내는 서열번호 1의 염기 위치 127번째부터 147번째의 영역 및 210번째부터 224번째의 영역)에 주목하여, 3' 말단이 그의 영역 내에 위치하도록, 정방향 프라이머로서 이용하는 PSTVd 검출용 프라이머 후보 및 TCDVd 검출용 프라이머 후보를 설계하였다. PSTVd의 전체 게놈 서열(서열번호 1)의 염기 위치 115번째 내지 131번째의 염기 서열에 기초하여 설계한 PSTVd 검출용 프라이머 후보 5'-TGGCAAAAGGCGCGGTG-3'(서열번호 4)는 멀티플렉스 프라이머 PSTVd-F로 명명하였다(도 1). 또한, TCDVd의 게놈 서열(서열번호 2)의 염기 위치 206번째 내지 223번째의 염기 서열에 기초하여 설계한 TCDVd 검출용 프라이머 후보 5'-CTTCCTTTGCGCGCCACT-3'(서열번호 5)는 멀티플렉스 프라이머 TCDVd-F라 명명하였다(도 1). 설계한 프라이머는 통상법에 의해 합성한 DNA 프라이머를 이용하였다.
또한, PSTVd와 TCDVd의 전체 게놈 서열(서열번호 1 및 2)의 염기 위치 18번째 내지 37번째 영역의 상보 서열에 기초하여 설계한 역방향 프라이머 5'-TCAGGTGTGAACCACAGGAA-3'(서열번호 3)는 멀티플렉스 역방향 프라이머 PS+TCV-R로 명명하였다. 이 역방향 프라이머는 통상법에 의해 DNA 프라이머로서 합성한 것을, RT-PCR에서의 역전사 반응(RT)을 위한 제1쇄 cDNA 합성용 프라이머로서, 또한 역전사 반응 후의 반응액 중의 잔존 프라이머를 계속되는 PCR 공정을 위한 PCR 프라이머로서 이용하였다.
역전사 반응액은 이하의 조성으로 제조하였다.
역전사
반응액 조성
RT 버퍼(TOYOBO) 2 μl
dNTPs(10 mM)(TOYOBO) 1 μl
RNase 저해제(1 U)(TOYOBO) 0.5 μl
역전사 효소 RverTra Ace(등록상표) (20 μM)(TOYOBO) 0.5 μl
멀티플렉스 역방향 프라이머 PS+TCV-R(20 μM) 0.5 μl
RNase 프리수 4.5 μl
전체
RNA
(주형) 1 μl
합계 10 μl
여기서 전체 RNA로서는 3종의 주형을 이용하였다. 즉, TCDVd 감염 잎 유래 전체 RNA만(TCDVd-RNA), PSTVd 감염 잎 유래 전체 RNA만(PSTVd-RNA), 및 이들의 등량 혼합물(TCDVd+PSTVd 혼합 RNA)이다.
역전사 반응은 상기 반응액을 42℃에서 30분, 99℃에서 5분 처리한 후, 4℃에서 보존함으로써 실시하였다. 역전사 반응 완료 후, 역전사 산물 1 μl를 PCR 튜브에 분주하여, 이하의 조성의 PCR 반응액을 제조하였다.
PCR
반응액 조성
KOD Dash 버퍼(TOYOBO) 1 μl
DNA 중합효소 KOD Dash(TOYOBO) 0.1 μl
dNTPs(2 mM)(TOYOBO) 1 μl
멀티플렉스 프라이머 PSTVd-F(10 μM) 0.1 μl
멀티플렉스 프라이머 TCDVd-F(10 μM) 0.1 μl
물 6.7 μl
역전사
(
RT
) 산물(주형
cDNA
,
프라이머
PS
+
TCV
-R 포함) 1 μl
합계 10 μl
PCR 반응은 98℃에서 3분의 변성 처리 후, 98℃에서 45초, 62℃에서 10초, 74℃에서 45초를 1 사이클로 하여 35 사이클 행하고, 74℃에서 5분, 계속해서 4℃에서 보존함으로써 행하였다.
PCR 완료 후, PCR 산물과 로딩 색소를 1 방울씩 혼합하고, 1％ 아가로스 겔에 주입하여 1×TBE 버퍼를 사용하여 전기영동을 행하였다. 전기영동 후, UV 광을 사용하여 색소를 발광시켜 증폭 밴드의 유무를 확인하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다. 양 바이로이드 RNA를 이용하여 상기와 같이 멀티플렉스 RT-PCR을 행한 바, TCDVd-RNA에 대해서는 191 bp(레인 3), PSTVd-RNA에 대해서는 281 bp(레인 2)의 예측대로의 크기에 대응하는 명료한 특이적 밴드가 확인되었다. TCDVd-RNA에 대한 191 bp의 밴드는 서열번호 2의 염기 위치 206번째 내지 359번째 및 1번째 내지 37번째 영역(환상 바이로이드 RNA 상에서는 실제로는 연속한 영역임)을 증폭한 단편이다(도 2 중, 흰색 삼각형). 마찬가지로, PSTVd-RNA에 대한 281 bp의 밴드는 서열번호 1의 염기 위치 115번째 내지 358번째 및 1번째 내지 37번째 영역(환상 바이로이드 RNA 상에서는 실제로는 연속한 영역임)을 증폭한 단편이다(도 2 중, 망점 삼각형).
도 2에 나타난 바와 같이, TCDVd+PSTVd 혼합 RNA에서는 TCDVd 및 PSTVd의 쌍방의 밴드(191 bp 및 281 bp)가 확인되었고(레인 1), PSTVd-RNA에서는 PSTVd에 특이적인 밴드(281 bp)가 확인되었으며(레인 2), TCDVd-RNA에서는 TCDVd에 특이적인 밴드(191 bp)가 확인되었다(레인 3). 한편, 대조군인, 건전한 바이로이드 무접종 토마토잎 유래 RNA(레인 4) 및 물만(레인 5)에서는 그 어느 밴드도 확인되지 않았다.
이와 같이, 상기 멀티플렉스 프라이머 TCDVd-F, 멀티플렉스 프라이머 PSTVd-F 및 멀티플렉스 역방향 프라이머 PS+TCV-R을 이용한 RT-PCR에 의해, TCDVd와 PSTVd의 존재를 명료하게 식별할 수 있는 것으로 나타났다. 이 방법에서는 TCDVd와 PSTVd 중 어느 한쪽에만 특이적인 밴드가 증폭되고, 쌍방의 바이로이드에 공통되는 밴드는 거의 증폭되지 않았기 때문에, 의양성을 잘 나타내지 않는 것으로 나타났다.
또한, RT-PCR에서의 PCR 반응의 어닐링 온도(55, 58, 60, 62℃) 및 각 정방향 프라이머의 최종 농도(0.2, 0.1, 0.05 μM)를 변경하여 상기와 동일한 검출을 행함으로써, 양 바이로이드의 동시 검출에 보다 적합한 RT-PCR 반응 조건을 검토하였다. 그 결과, 검출 감도 면에서, PCR 반응의 어닐링 온도는 62℃가 가장 적합하고, 각 정방향 프라이머의 최종 농도는 0.1 μM가 가장 적합한 것으로 나타났다.
[실시예 2]
실시예 1의 검출 결과와의 비교를 위해, 멀티플렉스 프라이머 PSTVd-F 및 TCDVd-F와 유사한 위치에 설계한 다른 여러 종류의 PSTVd 검출용 프라이머 후보 및 TCDVd 검출용 프라이머 후보를 이용하여, 실시예 1과 동일한 절차 및 조건으로 멀티플렉스 RT-PCR을 행함으로써, PSTVd 및 TCDVd의 검출을 행하였다.
역전사 반응에는 실시예 1과 동일한 멀티플렉스 역방향 프라이머 PS+TCV-R을 사용하였고, PCR 반응에는 멀티플렉스 역방향 프라이머 PS+TCV-R에 더하여 표 1에 나타내는 PSTVd 검출용 프라이머 후보 및 TCDVd 검출용 프라이머 후보를 다양한 조합으로 사용하였다(표 2). 또한, 표 1 및 표 2 중, 멀티플렉스 PSTVd-F는 멀티플렉스 프라이머 PSTVd-F, 멀티플렉스 TCDVd-F는 멀티플렉스 프라이머 TCDVd-F를 나타낸다.
표 2에는 상기 RT-PCR에 의해 얻어진 증폭 결과를 나타내었다. 표 2에 나타난 바와 같이, 멀티플렉스 PSTVd-F와 멀티플렉스 TCDVd-F의 조합에서는 하나의 반응 중에서 TCDVd와 PSTVd의 쌍방으로부터 각각에 특이적인 증폭 밴드를 증폭할 수 있고, 이에 따라 양자를 구별하여 양성 검출할 수 있는 것으로 나타났다(표 2의 P&T). 한편, 그 이외의 후보 프라이머의 조합에서는 명료한 특이적 밴드는 증폭되지 않거나 또는 TCDVd와 PSTVd의 어느 한쪽에서밖에 특이적 밴드를 증폭할 수 없어, 양자를 양성 검출할 수는 없었다. 특히 TCDVd와 PSTVd의 혼합 RNA를 주형으로 한 경우에는 멀티플렉스 PSTVd-F와 멀티플렉스 TCDVd-F의 조합을 이용하여 TCDVd와 PSTVd의 각각에 특이적인 증폭 밴드가 명료하게 검출된 것과는 대조적으로, 그 이외의 후보 정방향 프라이머의 조합에서는 TCDVd와 PSTVd 중 어느 단독을 주형으로 하여 검출한 경우보다 훨씬 불명료한 증폭 밴드밖에 검출되지 않았다.
일례로서, 표 2에 나타낸 결과의 일부에 대한 전기영동 사진을 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타낸 후보 프라이머의 조합에 의한 RT-PCR에서는 TCDVd RNA 또는 PSTVd RNA의 한편 또는 양쪽의 주형에 대하여 명료한 특이적 증폭 밴드를 검출할 수 없었고, 또한 TCDVd와 PSTVd의 혼합 RNA를 주형으로 한 경우에는 어느 특이적 증폭 밴드도 명료하게 검출되지 않았다(도 3). 이 결과로부터는 멀티플렉스 PSTVd-F와 멀티플렉스 TCDVd-F의 조합 이외의 상기 후보 프라이머의 조합은 TCDVd와 PSTVd를 구별하여 검출하는 방법에는 적합하지 않고, 특히 TCDVd 또는 PSTVd의 혼재가 의심되는 RNA 시료에 대한 TCDVd와 PSTVd의 검출에는 특히 적합하지 않은 것으로 나타났다.
따라서, 멀티플렉스 RT-PCR에 기초한 TCDVd 및 PSTVd의 검출 시험에는 멀티플렉스 PSTVd-F와 멀티플렉스 TCDVd-F가, 정방향 프라이머의 최적의 조합인 것으로 판명되었다. TCDVd와 PSTVd의 전체 염기 서열은 서로 85％ 이상의 상동성이 있는 점에서, 양 바이로이드를 구별하여 양성 검출할 수 있는 멀티플렉스 프라이머 세트의 제작은 매우 곤란한 것으로 예측되었지만, 실제 유사한 위치에 설계한 프라이머 후보의 다수의 조합 중에서 상기 멀티플렉스 PSTVd-F와 멀티플렉스 TCDVd-F의 조합을 포함하는 프라이머 세트만이, TCDVd와 PSTVd의 쌍방을 각각 특이적으로 양성 검출할 수 있는 멀티플렉스 RT-PCR에 최적의 프라이머 세트인 것으로 나타났다.
또한, 상기에서 이용한 본원 발명에 따른 프라이머 세트(멀티플렉스 프라이머 PSTVd-F, 멀티플렉스 프라이머 TCDVd-F, 및 역방향 프라이머 PS+TCV-R)는 PSTVd 및 TCDVd의 각각에 대하여 보고되어 있는 각종 변이체의 대부분에서 일치하는 염기를 포함하도록 설계되어 있는 점에서, PSTVd와 TCDVd의 식별에 널리 사용할 수 있다. 구체적으로는, 본원 발명에 따른 프라이머 세트의 각 프라이머는 PSTVd의 서열번호 1의 서열 및 TCDVd의 서열번호 2의 서열에 더하여, 기보된 TCDVd 변이체의 염기 서열(예를 들면, 유전자은행 승인 번호 DQ859013[Plant Dis., 91, p.324 (2007)], AF162131[J. Gen. Virol., 80, p.2823-2828 (1999)], EF582392[Plant Pathol., 57, p.400 (2008)], EF582393[Plant Pathol., 57, p.400 (2008)], AY372399[Eur. J. Plant Pathol., 110, p.823-831 (2004)]) 및 기보된 PSTVd 변이체의 염기 서열(예를 들면, 유전자은행 승인 번호 Z34272[EMBO J., 13(24), p.6172-6177 (1994)], M25199[Nucleic Acids Res., 10 (24), p.7947-7957 (1982)], AF458986[J. Gen. Virol., 84, p.751-756 (2003)], AF459005[Virology, 187 (2), p.654-662 (1992)], AY937179[J. Gen. Virol., 86, p.1835-1839 (2005)], M88677[EMBO J., 4, p.2181-2190 (1985)], M88678[Nature, 273 (5659), p.203-208 (1978)], M88681[EMBO J., 4, p.2181-2190 (1985)], U23058[Nature, 273 (5659), p.203-208 (1978)], U23059[Nature, 273(5659), p.203-208 (1978)], V01465[Nature, 273(5659), p.203-208(1978)], X97387[Virology, 226(2), p.191-197 (1996)], M16826[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, p.3967-3971 (1987)])을 고려하여 설계되어 있고, 이들 변이체를 비롯한 많은 변이체의 식별에 이용할 수 있다.
이상의 결과로부터, 멀티플렉스 프라이머 TCDVd-F, 멀티플렉스 프라이머 PSTVd-F 및 멀티플렉스 역방향 프라이머 PS+TCV-R을 이용한 RT-PCR을 행하여, TCDVd에 특이적인 증폭 단편(191 bp의 밴드에 대응)과 PSTVd에 특이적인 증폭 단편(281 bp의 밴드에 대응)의 유무를 확인함으로써, 바이로이드 PSTVd와 TCDVd를 명료하게 구별하여 검출할 수 있는 것으로 나타났다.
[실시예 3]
바이로이드 PSTVd에는 다수의 계통이 존재한다. 이 때문에, 더 많은 계통의 PSTVd를 검출 가능하게 하기 위해, 정방향 프라이머로서 이용하는 PSTVd 검출용 프라이머의 서열을, 실시예 1과 동일하게 PSTVd의 전체 게놈 서열을 나타내는 서열번호 1의 염기 위치 127번째부터 147번째의 영역 내에 3' 말단이 위치하는 범위 내에서 추가로 검토하여, 추가적인 PSTVd 및 TCDVd 동시 검출용 프라이머 세트의 제작을 시도하였다. 새로운 PSTVd 검출용 프라이머 후보를 사용하여 실시예 1과 동일하게 멀티플렉스 RT-PCR을 행함으로써, PSTVd 및 TCDVd의 동시 검출이 가능한지의 여부를 조사하였다.
이하에는 이와 같이 하여 새롭게 설계된 PSTVd 검출용 정방향 프라이머를 포함하는 특정 프라이머 세트를 이용한 PSTVd 및 TCDVd의 양호한 검출 결과의 예를 나타내겠다.
우선, 역전사 반응의 주형으로는 실시예 1과 동일한 방법으로 추출한 PSTVd 및 TCDVd의 각각의 RNA를 사용하였다. 역전사 반응은 실시예 1과 동일한 멀티플렉스 역방향 프라이머(이하에서는 MpR이라로도 칭함) PS+TCV-R(서열번호 3)을 사용하여 실시예 1과 동일한 절차 및 조건으로 행하였다.
계속된 PCR 반응에는 멀티플렉스 역방향 프라이머 PS+TCV-R을, PSTVd 검출용 정방향 프라이머 및 TCDVd 검출용 정방향 프라이머와 조합하여 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트로 사용하였다(표 3). 멀티플렉스 TCDVd 검출용 정방향 프라이머(이하에서는 MpTF라고도 칭함)로서는 실시예 1과 동일한 멀티플렉스 프라이머 TCDVd-F(서열번호 5)를 사용하였다. PSTVd의 다양한 계통을 넓게 검출하기 위해, 3' 말단의 서열이 상이한 3 종류의 멀티플렉스 PSTVd 검출용 정방향 프라이머를 새롭게 설계하여 사용하였다. 이들 멀티플렉스 PSTVd 검출용 정방향 프라이머의 3' 말단은 각종 계통의 PSTVd 사이에서 상이한 서열번호 1의 염기 위치 140번째 내지 141번째의 서열을 검출할 수 있도록 "TA", "TC", 및 "CT"의 3 패턴으로 하였다.
PCR 반응액은 이하의 조성으로 제조하였다.
PCR
반응액 조성
KOD Dash 버퍼(TOYOBO) 1 μl
DNA 중합효소 KOD Dash(TOYOBO) 0.1 μl
dNTPs(2 mM)(TOYOBO) 1 μl
MpTF 프라이머(TCDVd-F)(10 μM) 0.1 μl
프라이머 MpPTAF(10 μM) 0.1 μl
프라이머 MpPTCF(10 μM) 0.1 μl
프라이머 MpPCTF(10 μM) 0.1 μl
물 6.5 μl
역전사
(
RT
) 산물(주형
cDNA
,
프라이머
PS
+
TCV
-R 포함) 1 μl
합계 10 μl
PCR 반응은 실시예 1과 마찬가지로, 98℃에서 3분의 변성 처리 후, 98℃에서 45초, 62℃에서 10초, 74℃에서 45초를 1 사이클로 하여 35 사이클 행하고, 74℃에서 5분, 계속해서 4℃에서 보존함으로써 행하였다.
PCR 완료 후, PCR 산물과 로딩 색소를 1 방울씩 혼합하고, 1％ 아가로스 겔에 주입하여 1×TBE 버퍼를 사용하여 전기영동을 행하였다. 전기영동 후, UV광을 사용하여 색소를 발광시켜 증폭 밴드의 유무를 확인하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다. 양 바이로이드 RNA를 이용하여 상기와 같이 멀티플렉스 RT-PCR을 행한 바, TCDVd-RNA에 대해서는 191 bp(레인 3), PSTVd-RNA에 대해서는 270 bp(레인 2)의 예측대로의 크기에 대응하는 명료한 특이적 밴드가 확인되었다. TCDVd-RNA에 대한 191 bp의 밴드는 서열번호 2의 염기 위치 206번째 내지 359번째 및 1번째 내지 37번째의 영역(환상 바이로이드 RNA 상에서는 실제로는 연속한 영역임)을 증폭한 단편이다(도 4 중, 흰색 삼각형). 마찬가지로, PSTVd-RNA에 대한 270 bp의 밴드는 서열번호 1의 염기 위치 126번째 내지 358번째 및 1번째 내지 37번째의 영역(환상 바이로이드 RNA 상에서는 실제로는 연속한 영역임)을 증폭한 단편이다(도 4 중, 흰색 화살표).
도 4에 나타난 바와 같이, 여기서 사용한 새로운 프라이머 세트를 사용한 멀티플렉스 PCR에서도, 실시예 1과 마찬가지로 TCDVd+PSTVd 혼합 RNA 샘플에 대하여 TCDVd 및 PSTVd의 쌍방의 밴드(191 bp 및 270 bp)(레인 1), PSTVd-RNA 샘플에 대하여 PSTVd에 특이적인 밴드(270 bp)(레인 2), TCDVd-RNA 샘플에 대하여 TCDVd에 특이적인 밴드(191 bp)(레인 3)를 확인할 수 있었다. 한편, 대조군인, 건전한 바이로이드 무접종 토마토잎 유래 RNA(레인 4) 및 물만(레인 5)에서는 그 어느 밴드도 확인되지 않았다.
이에 추가로, 표 3에 나타낸 멀티플렉스 RT-PCR 프라이머 세트를 사용하여 각종 계통의 PSTVd를 검출할 수 있는지의 여부를 시험하였다. 바이로이드 PSTVd의 서열번호 1의 염기 위치 140번째 내지 141번째의 서열에는 계통에 따라 "UA", "UC", "CA", "CU"의 4 패턴이 존재한다. 이에 PSTVd의 계통 X76844를 이용하여, 서열번호 1의 염기 위치 140번째 내지 141번째에 해당하는 게놈 서열이 "UA", "UC", "CA", 또는 "CU"인 4 패턴의 변이체 PSTVd의 RNA(각각 PSTVd-UA, PSTVd-UC, PSTVd-CA, PSTVd-CU라 명명함)를 제작하고, 이들 RNA를 주형으로 하여, MpPTAF, MpTCF, MpCTF의 혼합 프라이머를 포함하는 멀티플렉스 RT-PCR 프라이머 세트(표 3)를 사용하여 상기와 동일한 절차 및 조건으로 멀티플렉스 RT-PCR에 기초한 검출 시험을 행하였다. 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 이 멀티플렉스 RT-PCR 프라이머 세트를 사용함으로써, PSTVd의 4 패턴의 변이체 RNA 중 어느 것에 대해서도 동일한 크기(270 bp)의 증폭산물이 확인되었다. 즉, PSTVd의 4 패턴의 변이체 RNA 모두가 검출 가능하였다(레인 1 내지 4). 한편, 물만의 대조 샘플(레인 5)에서는 밴드는 전혀 확인되지 않았다.
이와 같이, 멀티플렉스 역방향 프라이머 PS+TCV-R, 멀티플렉스 TCDVd 검출용 정방향 프라이머 TCDVd-F, 및 멀티플렉스 PSTVd 검출용 정방향 프라이머 MpPTAF, MpTCF, 및 MpCTF로 구성되는 프라이머 세트를 이용한 멀티플렉스 RT-PCR에 의해, TCDVd와 PSTVd의 존재를 명료하게 식별할 수 있고, 게다가 다양한 계통의 PSTVd를 검출할 수 있는 것으로 나타났다. 이 방법에서도 TCDVd와 PSTVd 중 어느 한쪽에만 특이적인 밴드가 증폭되고, 쌍방의 바이로이드에 공통되는 특이적 밴드는 거의 증폭되지 않았기 때문에, 이 멀티플렉스 RT-PCR 프라이머 세트도 바이로이드 TCDVd 및 PSTVd의 동시 검출에 최적인 것으로 나타났다.
<산업상의 이용 가능성>
본 발명의 방법은 주로 가지과 식물에 감염되는 병원체 바이로이드 TCDVd와 PSTVd를 서로 구별하여 검출하기 위해 사용할 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하면, TCDVd와 PSTVd를 하나의 반응계에서 식별할 수 있다. 본 발명의 방법은 바이로이드 TCDVd 및 PSTVd의 국내 침입에 대한 방어에 이바지할 뿐만 아니라, 국내 검역에서의 신속한 진단에 활용함으로써, 방역 체제의 강화에 도움이 될 수 있다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 그대로 참조로써 본 명세서에 도입되는 것으로 한다.
<서열표 프리텍스트>
서열번호 3 내지 17은 프라이머이다.
SEQUENCE LISTING
<110> Incorporated Administrative Agency National Agriculture and Food Research Organization
<120> Method of simultaneous detection of viroids TCDVd and PSTVd
<130> PH-4044-PCT
<150> JP 2009-133144
<151> 2009-06-02
<160> 17
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 358
<212> DNA
<213> Potato spindle tuber viroid PSTVd
<220>
<223> Inventor: Matsushita, Yousuke; Tsuda, Shinya
<400> 1
cggaactaaa ctcgtggttc ctgtggttca cacctgacct cctttccaga aaagaaaaaa 60
gataggcggc tcggaggagc gcttcaggga tccccgggga aacctggagc gaactggcaa 120
aaggcgcggt ggggagtgcc tcgcggccga caggagtaat tcctgctgaa acagggtttt 180
cacccttcct ttcttcaggt ttccttcctc gcgcccgcag gatcacccct cgcccccttg 240
cgctgtcgct tcggctacta cccggtggaa acaactgaag ctcccgagaa ccgctttttc 300
tctatcttgc tggtatcggg gcgagggtgt ttagcccttg gaaccgcagt tggttcct 358
<210> 2
<211> 359
<212> DNA
<213> Tomato chlorotic dwarf viroid TCDVd
<400> 2
cggaactaaa ctcgtggttc ctgtggttca cacctgacct cctgtgcaga aaagaaaaaa 60
gataggcggc tcggaggagc gcttcaggga tccccgggga aacctggagc gaactggcaa 120
aaggcggcag ggagcttgtg gaaggcgaaa caggagtaat cccgagagaa acagggtttt 180
cacccttcct ttctgattcg gtttccttcc tttgcgcgcc actcgacccc tcgccccctt 240
gcgctgtcgc ttcggcaact acccggtgga aacaactgaa gctcccgaga accgcttttt 300
ctctatcttg ctgctaccgg ggcgagggtg tttagccctt ggaaccgcag ttggttcct 359
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 3
tcaggtgtga accacaggaa 20
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 4
tggcaaaagg cgcggtg 17
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 5
cttcctttgc gcgccact 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 6
ctggcaaaag gcgcggtg 18
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 7
actggcaaaa ggcgcggtg 19
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 8
tggcaaaagg cgcggtgg 18
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 9
aactggcaaa aggcgcggtg 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 10
ctggcaaaag gcgcggtgg 19
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 11
ttcctttgcg cgccact 17
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<212> DNA
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<220>
<223> primer
<400> 12
cttcctttgc gcgccactc 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
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<220>
<223> primer
<400> 13
ccttcctttg cgcgccact 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 14
cttcctttgc gcgccactcg 20
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 15
cggtggggag tgccta 16
<210> 16
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 16
cggtggggag tgcctc 16
<210> 17
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 17
cggtggggag tgccct 16
Claims (13)
- 피검식물 시료 유래의 RNA를 주형으로 하여, (i) 서열번호 1의 염기 위치 18번째부터 114번째의 염기 서열에 대한 상보 서열 중 16 내지 30 염기길이의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머와, (ii) 서열번호 1의 염기 위치 127번째부터 147번째의 영역 내에 3' 말단이 위치하도록 서열번호 1의 염기 서열 상에 설계한 16 내지 30 염기길이의 1종 이상의 PSTVd 검출용 정방향 프라이머와, (iii) 서열번호 1의 염기 위치 210번째부터 224번째의 영역 내에 3' 말단이 위치하도록 서열번호 1의 염기 서열 상에 설계한 16 내지 30 염기길이의 1종 이상의 TCDVd 검출용 정방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 이용한 핵산 증폭을 행하여, 상기 역방향 프라이머와 PSTVd 검출용 정방향 프라이머에 의한 핵산 증폭 및 상기 역방향 프라이머와 TCDVd 검출용 정방향 프라이머에 의한 핵산 증폭의 유무를 판정함으로써, 피검식물 중의 바이로이드 PSTVd 및 TCDVd를 구별하여 검출하는 것을 포함하는, 바이로이드의 검출 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 역방향 프라이머가 서열번호 3의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머이고 1종 이상의 PSTVd 검출용 정방향 프라이머가 서열번호 15의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머, 서열번호 16의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 서열번호 17의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 프라이머를 포함하고, 또한 1종 이상의 TCDVd 검출용 정방향 프라이머가 서열번호 5의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 역방향 프라이머가 서열번호 3의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 1종 이상의 PSTVd 검출용 정방향 프라이머가, 서열번호 4의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하고, 또한 1종 이상의 TCDVd 검출용 정방향 프라이머가 서열번호 5의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프라이머 세트를 하나의 반응액 중에서 이용하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 피검식물이 가지과 식물인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 증폭이 역전사 공정과 멀티플렉스 PCR 공정을 포함하는 RT-PCR인 방법.
- 제6항에 있어서, 역전사 공정에서는 상기 역방향 프라이머가 핵산 증폭에 사용되며, 멀티플렉스 PCR 공정에서는 상기 역방향 프라이머, 1종 이상의 PSTVd 검출용 정방향 프라이머, 및 1종 이상의 TCDVd 검출용 정방향 프라이머가 핵산 증폭에 사용되는 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역방향 프라이머, PSTVd 검출용 정방향 프라이머 및 TCDVd 검출용 정방향 프라이머 중 적어도 1개가 표지 프라이머인 방법.
- (i) 서열번호 1의 염기 위치 18번째부터 114번째의 염기 서열에 대한 상보 서열 중 16 내지 30 염기길이의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머와, (ii) 서열번호 1의 염기 위치 127번째부터 147번째의 영역 내에 3' 말단이 위치하도록 서열번호 1의 염기 서열 상에 설계한 16 내지 30 염기길이의 1종 이상의 PSTVd 검출용 정방향 프라이머와, (iii) 서열번호 1의 염기 위치 210번째부터 224번째의 영역 내에 3' 말단이 위치하도록 서열번호 1의 염기 서열 상에 설계한 16 내지 30 염기길이의 1종 이상의 TCDVd 검출용 정방향 프라이머를 포함하는, 바이로이드 PSTVd 및 TCDVd 검출용 프라이머 세트.
- 제9항에 있어서, 상기 역방향 프라이머가 서열번호 3의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 1종 이상의 PSTVd 검출용 정방향 프라이머가 서열번호 15의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머, 서열번호 16의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 서열번호 17의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 프라이머를 포함하고, 그리고 1종 이상의 TCDVd 검출용 정방향 프라이머가 서열번호 5의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 프라이머 세트.
- 제9항에 있어서, 상기 역방향 프라이머가 서열번호 3의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 1종 이상의 PSTVd 검출용 정방향 프라이머가 서열번호 4의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하고, 그리고 1종 이상의 TCDVd 검출용 정방향 프라이머가 서열번호 5의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 프라이머 세트.
- 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역방향 프라이머, PSTVd 검출용 정방향 프라이머 및 TCDVd 검출용 정방향 프라이머 중 적어도 1개가 표지 프라이머인 프라이머 세트.
- 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 프라이머 세트를 포함하는, 바이로이드 검출용 키트.
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| E601 | Decision to refuse application |