JP7304631B2 - ポスピウイロイドの解析用ポジティブコントロール及びその利用 - Google Patents
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Description
1) ポスピウイロイドのポジティブコントロール用の核酸構築物であって、リアルタイムRT-PCR用であり、宿主に非感染性であり、ポスピウイロイドのcDNA増幅用のPCRプライマーセットで増幅可能であり、並びに前記PCRプライマーセットで増幅される領域は、ポスピウイロイドのcDNAにおける増幅される領域との比較で、異なる塩基配列を有し、塩基配列の長さの差が±5%の範囲内であり、かつ、塩基配列のGC含有率の差が±5%の範囲内である、核酸構築物。
2) (a)配列番号1から3のいずれかに示す塩基配列;(b)配列番号1から3のいずれかに示す塩基配列における、少なくとも1つの塩基が置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列;及び(c)配列番号1から3のいずれかに示す塩基配列との同一性が90%以上である塩基配列からなる群より選択されるいずれかの塩基配列からなる、1)に記載の核酸構築物。
3) ポスピウイロイドのcDNAの全長配列との同一性が80%以上の塩基配列からなる、1)又は2)に記載の核酸構築物。
4) 前記PCRプライマーセットで増幅される領域の塩基配列は、ポスピウイロイドのcDNAにおける増幅される領域の塩基配列との同一性が75%以上である、1)から3)のいずれかに記載の核酸構築物。
5) 前記ポスピウイロイドが、ジャガイモやせいもウイロイド、トマト黄化萎縮ウイロイド、カンキツエクソコーティスウイロイド、コルムネアラテントウイロイド、トマトアピカルスタントウイロイド、ペッパーチャットフルーツウイロイド、キク矮化ウイロイド、及びトマトプランタマッチョウイロイドからなる群より選択される、1)から4)のいずれかに記載の核酸構築物。
6) 前記PCRプライマーセットで増幅される領域は、制限酵素で処理された場合に、前記ポスピウイロイドのcDNAにおける増幅される領域とは異なる位置で切断される、1)から5)のいずれかに記載の核酸構築物。
7) 前記PCRプライマーセットで増幅される領域は、前記ポスピウイロイドのcDNAにおける増幅される領域には存在しない制限酵素認識配列を含む、1)から6)のいずれかに記載の核酸構築物。
8) 1)から7)のいずれかに記載の核酸構築物を含む、ベクター。
9) 1)から7)のいずれかに記載の核酸構築物及び被験植物由来のRNAを、リアルタイムRT-PCRにより増幅する増幅工程を包含する、ポスピウイロイドの解析方法。
10) 前記増幅工程において増幅した前記核酸構築物及び前記RNAの解離曲線を生成する生成工程をさらに包含する、9)に記載のポスピウイロイドの解析方法。
11) 1)から7)のいずれかに記載の核酸構築物と、ポスピウイロイドのcDNA増幅用のPCRプライマーセットとを備えた、ポスピウイロイドの解析キット。
12) 前記核酸構築物はベクターに組み込まれた形態である、11)に記載のポスピウイロイドの解析キット。
本発明の一実施形態に係る核酸構築物は、ポスピウイロイドのポジティブコントロール用の核酸構築物であって、リアルタイムRT-PCR用であり、宿主に非感染性であり、ポスピウイロイドのcDNA増幅用のPCRプライマーセットで増幅可能で、前記PCRプライマーセットで増幅される領域は、ポスピウイロイドのcDNAにおける増幅される領域との比較で、異なる塩基配列を有し、塩基配列の長さの差が±5%の範囲内であり、かつ、塩基配列のGC含有率の差が±5%の範囲内である。
ポスピウイロイドは、ポスピウイロイド科ポスピウイロイド属に属するウイロイドである。ウイロイドは、塩基数の短い環状の1本鎖RNAのみで構成され、高等植物に対して感染性を有する。ポスピウイロイドの例として、ジャガイモやせいもウイロイド(PSTVd)、トマト黄化萎縮ウイロイド(TCDVd)、カンキツエクソコーティスウイロイド(CEVd)、コルムネアラテントウイロイド(CLVd)、トマトアピカルスタントウイロイド(TASVd)、ペッパーチャットフルーツウイロイド(PCFVd)、キク矮化ウイロイド(CSVd)、及びトマトプランタマッチョウイロイド(TPMVd)が挙げられる。核酸構築物は、これらのポスピウイロイド検出の陽性判断の基準や、ポスピウイロイド定量の基準として用いることができる。
リアルタイムRT-PCRは、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を意味しており、RNAを逆転写したcDNAを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応による増幅を経時的(リアルタイム)に測定するものである。核酸構築物は、cDNA又はRNAである。核酸構築物がcDNAである場合、RNAに転写してリアルタイムRT-PCRに用いる。
核酸構築物は、ポスピウイロイドのcDNA増幅用のPCRプライマーセットで増幅可能である。すなわち、核酸構築物は、ポスピウイロイドのcDNAを増幅するために用いられるPCRプライマーセットと同一のPCRプライマーセットに相補的な配列を有し、当該相補配列にPCRプライマーセットが結合することで増幅されるものである。
PCRプライマーセットで増幅される領域(増幅領域)は、PCRプライマーセットに対する相補配列の領域と、これらの相補配列に挟まれた領域とを含む。核酸構築物及びポスピウイロイドのcDNAにおける増幅領域の長さは、一例では、80塩基長~300塩基長の範囲内であり、100塩基長~300塩基長の範囲内であり、100塩基長~270塩基長の範囲内であり、130塩基長~270塩基長の範囲内であり、又は135塩基長~265塩基長の範囲内である。また、核酸構築物及びポスピウイロイドのcDNAにおける増幅領域は、一例では、それらの全長配列における第20番目の塩基から第350番目の塩基までの範囲内、第25番目の塩基から第300番目の塩基までの範囲内、第28番目の塩基から第290番目の塩基までの範囲内、又は、第30番目の塩基から第290番目の塩基までの範囲内の領域である。
核酸構築物において、PCRプライマーセットで増幅される領域は、制限酵素で処理された場合に、ポスピウイロイドのcDNAにおいて増幅される領域とは異なる位置で切断されることが好ましい。すなわち、核酸構築物において増幅される領域の制限酵素認識配列は、ポスピウイロイドのcDNAにおいて増幅される領域の制限酵素認識配列とは異なることが好ましい。これにより、核酸構築物とポスピウイロイドのcDNAとを制限酵素で処理した場合に、切断された核酸断片の長さが異なる。したがって、核酸断片の長さを比較するのみで、核酸構築物をポスピウイロイドと容易に区別することができる。
核酸構築物において、PCRプライマーセットで増幅される領域は、ポスピウイロイドのcDNAにおける増幅される領域との比較において、塩基配列の長さ(bp)の差が±5%の範囲内である。これにより、核酸構築物を、例えば、ポスピウイロイドの定量のポジティブコントロールとして用いた場合に、ポスピウイロイドとの増幅曲線の類似性が高いため、精度よく定量することができる。PCRプライマーセットで増幅される領域の塩基配列の長さは、ポスピウイロイドのcDNAにおける増幅される領域の塩基配列の長さと概ね同一であることが好ましい。
核酸構築物の塩基配列は、PCRプライマーセットで増幅される領域は、ポスピウイロイドのcDNAにおける増幅される領域との比較において、塩基配列のGC含有率の差が±5%の範囲内である。これにより、核酸構築物を、例えば、ポスピウイロイドの検出のポジティブコントロールとして用いた場合に、ポスピウイロイドと解離曲線のピーク値の類似性が高いため、精度よく検出することができる。PCRプライマーセットで増幅される領域の塩基配列のGC含有率は、ポスピウイロイドのcDNAにおける増幅される領域の塩基配列のGC含有率と概ね同一であることが好ましい。
核酸構築物は、(a)配列番号1から3のいずれかに示す塩基配列;(b)配列番号1から3のいずれかに示す塩基配列における、少なくとも1つの塩基が置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列;及び(c)配列番号1から3のいずれかに示す塩基配列との同一性が90%以上である塩基配列からなる群より選択されるいずれかの塩基配列からなっていてもよい。
核酸構築物は、鋳型となるcDNAと、適切なプライマーセットとを用いてPCR増幅することにより作製することができる。また、核酸構築物は、公知の他のポリヌクレオチド合成方法により作製してもよい。
本発明の一実施形態に係るベクターは、上述した核酸構築物のいずれかを含む。核酸構築物が挿入されるベクターとして、例えば、pUC系プラスミド、pHSG系プラスミド(TaKaRa)、pCR系プラスミド(Invitrogen)、pGEM系プラスミド(Promega)等の公知のクローニングベクターが挙げられるがこれに限定されない。上述した核酸構築物のいずれかを含むベクターは、核酸構築物の作製に有用である。
本発明の一実施形態に係るポスピウイロイドの解析方法は、上述したいずれかの核酸構築物及び被験植物由来のRNAを、リアルタイムRT-PCRにより増幅する増幅工程を包含する。
本発明の一実施形態に係るポスピウイロイドの解析キットは、上述したいずれかの核酸構築物と、ポスピウイロイドのcDNA増幅用のPCRプライマーセットとを備えている。また、ポスピウイロイドの解析キットにおいて、核酸構築物はベクターに組み込まれた形態である。
DNA合成メーカーに依頼し、配列番号1~3の塩基配列が挿入されたクローニングベクター(pUC19)を入手した。このクローニングベクターを鋳型として、以下に示すプライマーセットを用い、以下に示すPCR反応液中で以下に示すPCR反応条件でPCR増幅した。
PCR反応液組成
KOD One Master Mix TOYOBO 25μl
DNA (1ng/ul) 2μl
フォワードプライマー(20uM) 2μl
リバースプライマー(20uM) 2μl
蒸留水 19μl
計 50μl
1.で作成したポジティブコントロール及び野生型ポスピウイロイドについて、Power SYBR Green RNA-to-Ct 1-Step Kit(Applied Biosystems,Foster City,USA)を用いてリアルタイムRT-PCRを行った。PCR反応液として、2μLのRNA、10μLのRT-PCR Master Mix、200nMのフォワードプライマー溶液及びリバースプライマー溶液、0.16μLのRT-Enzyme Mixを含み、蒸留水により20μLとしたPCR反応液を用いた。プライマーダイマーの抑制を、PCRサイクルを比較することで確認した。
(配列番号9)を用いて増幅した。
Claims (8)
- ポスピウイロイドのポジティブコントロール用の核酸構築物であって、
リアルタイムRT-PCR用であり、
宿主に非感染性であり、
ポスピウイロイドのcDNA増幅用のPCRプライマーセットで増幅可能であり、並びに
前記PCRプライマーセットで増幅される領域は、ポスピウイロイドのcDNAにおける増幅される領域との比較で、異なる塩基配列を有し、塩基配列の長さの差が±5%の範囲内であり、かつ、塩基配列のGC含有率の差が±5%の範囲内であり、
前記核酸構築物は、
(a)配列番号1から3のいずれかに示す塩基配列;
(b)配列番号1から3のいずれかに示す塩基配列における、1塩基以上、20塩基以内の塩基が置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列;及び
(c)配列番号1から3のいずれかに示す塩基配列との同一性が90%以上である塩基配列
からなる群より選択されるいずれかの塩基配列からなり、
前記PCRプライマーセットで増幅される領域は、制限酵素で処理された場合に、前記ポスピウイロイドのcDNAにおける増幅される領域とは異なる位置で切断される、
核酸構築物。 - 前記ポスピウイロイドが、ジャガイモやせいもウイロイド、トマト黄化萎縮ウイロイド、カンキツエクソコーティスウイロイド、コルムネアラテントウイロイド、トマトアピカルスタントウイロイド、ペッパーチャットフルーツウイロイド、キク矮化ウイロイド、及びトマトプランタマッチョウイロイドからなる群より選択される、請求項1に記載の核酸構築物。
- 前記PCRプライマーセットで増幅される領域は、前記ポスピウイロイドのcDNAにおける増幅される領域には存在しない制限酵素認識配列を含む、請求項1又は2に記載の核酸構築物。
- 請求項1から3のいずれか1項に記載の核酸構築物を含む、ベクター。
- 請求項1から3のいずれか1項に記載の核酸構築物及び被験植物由来のRNAを、リアルタイムRT-PCRにより増幅する増幅工程を包含する、ポスピウイロイドの解析方法。
- 前記増幅工程において増幅した前記核酸構築物及び前記RNAの解離曲線を生成する生成工程をさらに包含する、請求項5に記載のポスピウイロイドの解析方法。
- 請求項1から3のいずれか1項に記載の核酸構築物と、
ポスピウイロイドのcDNA増幅用のPCRプライマーセットと
を備えた、ポスピウイロイドの解析キット。 - 前記核酸構築物はベクターに組み込まれた形態である、請求項7に記載のポスピウイロイドの解析キット。
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WO2010140518A1 (ja) | 2009-06-02 | 2010-12-09 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 | ウイロイドPSTVd及びTCDVdの同時検出方法 |
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Non-Patent Citations (4)
Title |
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