JP2021153422A - ポスピウイロイドの解析用ポジティブコントロール及びその利用 - Google Patents
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Abstract
【課題】ポスピウイロイドの非感染性のポジティブコントロールを提供する。【解決手段】核酸構築物は、リアルタイムＲＴ-ＰＣＲ用であり、宿主に非感染性であり、ポスピウイロイドのｃＤＮＡ増幅用のＰＣＲプライマーセットで増幅可能あり、ならびに、増幅される領域は、ポスピウイロイドと異なる塩基配列を有し、塩基配列の長さの差が±５％の範囲内、塩基配列のＧＣ含有率の差が±５％の範囲内である。【選択図】なし
Description
本発明は、ポスピウイロイドの解析用ポジティブコントロール及びその利用に関する。
ポスピウイロイドには、トマト、ジャガイモ等のナス科作物に経済的被害を引き起こすものもある。ポスピウイロイドの多くは種子伝染し、観葉植物では無病徴感染するため、発生地域の拡大が懸念されている。特に、感染種子の流通による拡散は、国際的な問題とされている。そのため、ポスピウイロイドの国内未発生種の国内への侵入を防止すると共に感染植物の流通を阻止するため、植物検疫当局、種苗会社等では、ポスピウイロイドの宿主となり得る植物及び種苗の検査技術が求められている。
ポスピウイロイドの検出技術として、特許文献１及び非特許文献１〜３に記載された技術が知られている。特許文献１並びに非特許文献１及び２には、複数種のポスピウイロイドを検出及び識別する技術が記載されている。
非特許文献３には、ポスピウイロイドの１種であるジャガイモやせいもウイロイド（Potato spindle tuber viroid：ＰＳＴＶｄ）をＲＴ−ＰＣＲ法により検出する際のポジティブコントロールが記載されている。非特許文献３には、このポジティブコントロールが、野生型のＰＳＴＶｄの配列を２塩基欠損させて、３６塩基の挿入配列を組込み、非感染性となったＲＮＡであることが記載されている。
柳澤 広宣、志岐 悠介、植物防疫所調査研究報告、第51号：1-6（2015）
Yanagisawa et al., Eur. J. Plant Pathol. DOI 10.1007/s10658-017-1157-1, 2017
Tatsuji Hataya, J. Gen. Plant Pathol., (2009) vol.75:167-172
特許文献１並びに非特許文献１及び２に記載されたポスピウイロイドの検出技術は、植物防疫所の輸出検疫における種子検査法として実装されており、さらに、民間種苗メーカーにおける品質検査にも用いられはじめている。
植物防疫所や民間種苗メーカーでは、迅速に大量の種子を抜き取り検査することが求められており、このような検査にはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲが最も適している。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおいてはポジティブコントロールが必要になるが、現状適切なポジティブコントロールが存在せず、ポスピウイロイド自体がポジティブコントロールとして用いられている。
非特許文献３に記載されたＰＳＴＶｄのポジティブコントロールは、野生型のＰＳＴＶｄの配列と長さが異なるため、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで得られる増幅曲線及び解離曲線が野生型のＰＳＴＶｄと大きく異なり、陽性判断の基準として利用することができない。
ポスピウイロイドの多くが国内未発生であるため、感染性を有する野生型のポスピウイロイドの所持は規制されている。また、検査課程におけるコンタミネーションが生じた場合、真の陽性か否かを判断するのが困難な場合もあり、野生型のポスピウイロイドと区別できるポジティブコントロールが求められている。このようなポジティブコントロールを用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析によれば、既存のポスピウイロイドの検査技術の精度管理が容易となり、当該技術の普及がより加速すると共に、輸出入される種子及び植物流通の円滑化に貢献することが期待される。
本発明の一態様は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応により増幅したポスピウイロイドを解析するためのポジティブコントロールであって、野生型の塩基配列と区別可能な非感染性のポジティブコントロールを提供することを目的とする。
上記の課題を解決するために、本発明は、以下の態様を含む。
１） ポスピウイロイドのポジティブコントロール用の核酸構築物であって、リアルタイムＲＴ-ＰＣＲ用であり、宿主に非感染性であり、ポスピウイロイドのｃＤＮＡ増幅用のＰＣＲプライマーセットで増幅可能であり、並びに前記ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅される領域との比較で、異なる塩基配列を有し、塩基配列の長さの差が±５％の範囲内であり、かつ、塩基配列のＧＣ含有率の差が±５％の範囲内である、核酸構築物。
２） （ａ）配列番号１から３のいずれかに示す塩基配列；（ｂ）配列番号１から３のいずれかに示す塩基配列における、少なくとも１つの塩基が置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列；及び（ｃ）配列番号１から３のいずれかに示す塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列からなる群より選択されるいずれかの塩基配列からなる、１）に記載の核酸構築物。
３） ポスピウイロイドのｃＤＮＡの全長配列との同一性が８０％以上の塩基配列からなる、１）又は２）に記載の核酸構築物。
４） 前記ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域の塩基配列は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅される領域の塩基配列との同一性が７５％以上である、１）から３）のいずれかに記載の核酸構築物。
５） 前記ポスピウイロイドが、ジャガイモやせいもウイロイド、トマト黄化萎縮ウイロイド、カンキツエクソコーティスウイロイド、コルムネアラテントウイロイド、トマトアピカルスタントウイロイド、ペッパーチャットフルーツウイロイド、キク矮化ウイロイド、及びトマトプランタマッチョウイロイドからなる群より選択される、１）から４）のいずれかに記載の核酸構築物。
６） 前記ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域は、制限酵素で処理された場合に、前記ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅される領域とは異なる位置で切断される、１）から５）のいずれかに記載の核酸構築物。
７） 前記ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域は、前記ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅される領域には存在しない制限酵素認識配列を含む、１）から６）のいずれかに記載の核酸構築物。
８） １）から７）のいずれかに記載の核酸構築物を含む、ベクター。
９） １）から７）のいずれかに記載の核酸構築物及び被験植物由来のＲＮＡを、リアルタイムＲＴ-ＰＣＲにより増幅する増幅工程を包含する、ポスピウイロイドの解析方法。
１０） 前記増幅工程において増幅した前記核酸構築物及び前記ＲＮＡの解離曲線を生成する生成工程をさらに包含する、９）に記載のポスピウイロイドの解析方法。
１１） １）から７）のいずれかに記載の核酸構築物と、ポスピウイロイドのｃＤＮＡ増幅用のＰＣＲプライマーセットとを備えた、ポスピウイロイドの解析キット。
１２） 前記核酸構築物はベクターに組み込まれた形態である、１１）に記載のポスピウイロイドの解析キット。
１） ポスピウイロイドのポジティブコントロール用の核酸構築物であって、リアルタイムＲＴ-ＰＣＲ用であり、宿主に非感染性であり、ポスピウイロイドのｃＤＮＡ増幅用のＰＣＲプライマーセットで増幅可能であり、並びに前記ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅される領域との比較で、異なる塩基配列を有し、塩基配列の長さの差が±５％の範囲内であり、かつ、塩基配列のＧＣ含有率の差が±５％の範囲内である、核酸構築物。
２） （ａ）配列番号１から３のいずれかに示す塩基配列；（ｂ）配列番号１から３のいずれかに示す塩基配列における、少なくとも１つの塩基が置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列；及び（ｃ）配列番号１から３のいずれかに示す塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列からなる群より選択されるいずれかの塩基配列からなる、１）に記載の核酸構築物。
３） ポスピウイロイドのｃＤＮＡの全長配列との同一性が８０％以上の塩基配列からなる、１）又は２）に記載の核酸構築物。
４） 前記ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域の塩基配列は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅される領域の塩基配列との同一性が７５％以上である、１）から３）のいずれかに記載の核酸構築物。
５） 前記ポスピウイロイドが、ジャガイモやせいもウイロイド、トマト黄化萎縮ウイロイド、カンキツエクソコーティスウイロイド、コルムネアラテントウイロイド、トマトアピカルスタントウイロイド、ペッパーチャットフルーツウイロイド、キク矮化ウイロイド、及びトマトプランタマッチョウイロイドからなる群より選択される、１）から４）のいずれかに記載の核酸構築物。
６） 前記ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域は、制限酵素で処理された場合に、前記ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅される領域とは異なる位置で切断される、１）から５）のいずれかに記載の核酸構築物。
７） 前記ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域は、前記ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅される領域には存在しない制限酵素認識配列を含む、１）から６）のいずれかに記載の核酸構築物。
８） １）から７）のいずれかに記載の核酸構築物を含む、ベクター。
９） １）から７）のいずれかに記載の核酸構築物及び被験植物由来のＲＮＡを、リアルタイムＲＴ-ＰＣＲにより増幅する増幅工程を包含する、ポスピウイロイドの解析方法。
１０） 前記増幅工程において増幅した前記核酸構築物及び前記ＲＮＡの解離曲線を生成する生成工程をさらに包含する、９）に記載のポスピウイロイドの解析方法。
１１） １）から７）のいずれかに記載の核酸構築物と、ポスピウイロイドのｃＤＮＡ増幅用のＰＣＲプライマーセットとを備えた、ポスピウイロイドの解析キット。
１２） 前記核酸構築物はベクターに組み込まれた形態である、１１）に記載のポスピウイロイドの解析キット。
本発明の一態様によれば、ポスピウイロイドのリアルタイムＲＴ-ＰＣＲ用であって、野生型の塩基配列と区別可能な非感染性のポジティブコントロールを提供することができる。
以下、本発明の一実施形態について、詳細に説明する。なお、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上（Ａを含みかつＡより大きい）、Ｂ以下（Ｂを含みかつＢより小さい）」を意味する。
本明細書中で使用される場合、用語「核酸」は、「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。ここで、核酸は、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡ）、又は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態にて存在し得る。ＤＮＡ又はＲＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。本明細書において使用される場合、塩基の表記は、適宜ＩＵＰＡＣ及びＩＵＢの定める１文字表記を使用する。また、本明細書において、「３’末端」とは、遺伝子配列の下流における端部領域又は位置を意味し、「５’末端」とは、遺伝子配列の上流における端部領域又は位置を意味している。
〔核酸構築物〕
本発明の一実施形態に係る核酸構築物は、ポスピウイロイドのポジティブコントロール用の核酸構築物であって、リアルタイムＲＴ-ＰＣＲ用であり、宿主に非感染性であり、ポスピウイロイドのｃＤＮＡ増幅用のＰＣＲプライマーセットで増幅可能で、前記ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅される領域との比較で、異なる塩基配列を有し、塩基配列の長さの差が±５％の範囲内であり、かつ、塩基配列のＧＣ含有率の差が±５％の範囲内である。
本発明の一実施形態に係る核酸構築物は、ポスピウイロイドのポジティブコントロール用の核酸構築物であって、リアルタイムＲＴ-ＰＣＲ用であり、宿主に非感染性であり、ポスピウイロイドのｃＤＮＡ増幅用のＰＣＲプライマーセットで増幅可能で、前記ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅される領域との比較で、異なる塩基配列を有し、塩基配列の長さの差が±５％の範囲内であり、かつ、塩基配列のＧＣ含有率の差が±５％の範囲内である。
核酸構築物は、ポスピウイロイドの解析において解析基準として用いることができる。核酸構築物は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおいて、ポスピウイロイド検出の陽性判断の基準や、ポスピウイロイド定量の基準として用いることができる。核酸構築物は、ポスピウイロイドの塩基配列の一部が変異した塩基配列を有しており、野生型のポスピウイロイドが有する宿主植物への感染性は失われている。すなわち、核酸構築物は、宿主に非感染性である。したがって、核酸構築物を、トマトやジャガイモのようなポスピウイロイドの宿主となり得る植物に接種しても、これらの植物はポスピウイロイドに感染しない。
（ポスピウイロイド）
ポスピウイロイドは、ポスピウイロイド科ポスピウイロイド属に属するウイロイドである。ウイロイドは、塩基数の短い環状の１本鎖ＲＮＡのみで構成され、高等植物に対して感染性を有する。ポスピウイロイドの例として、ジャガイモやせいもウイロイド（ＰＳＴＶｄ）、トマト黄化萎縮ウイロイド（ＴＣＤＶｄ）、カンキツエクソコーティスウイロイド（ＣＥＶｄ）、コルムネアラテントウイロイド（ＣＬＶｄ）、トマトアピカルスタントウイロイド（ＴＡＳＶｄ）、ペッパーチャットフルーツウイロイド（ＰＣＦＶｄ）、キク矮化ウイロイド（ＣＳＶｄ）、及びトマトプランタマッチョウイロイド（ＴＰＭＶｄ）が挙げられる。核酸構築物は、これらのポスピウイロイド検出の陽性判断の基準や、ポスピウイロイド定量の基準として用いることができる。
ポスピウイロイドは、ポスピウイロイド科ポスピウイロイド属に属するウイロイドである。ウイロイドは、塩基数の短い環状の１本鎖ＲＮＡのみで構成され、高等植物に対して感染性を有する。ポスピウイロイドの例として、ジャガイモやせいもウイロイド（ＰＳＴＶｄ）、トマト黄化萎縮ウイロイド（ＴＣＤＶｄ）、カンキツエクソコーティスウイロイド（ＣＥＶｄ）、コルムネアラテントウイロイド（ＣＬＶｄ）、トマトアピカルスタントウイロイド（ＴＡＳＶｄ）、ペッパーチャットフルーツウイロイド（ＰＣＦＶｄ）、キク矮化ウイロイド（ＣＳＶｄ）、及びトマトプランタマッチョウイロイド（ＴＰＭＶｄ）が挙げられる。核酸構築物は、これらのポスピウイロイド検出の陽性判断の基準や、ポスピウイロイド定量の基準として用いることができる。
（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を意味しており、ＲＮＡを逆転写したｃＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応による増幅を経時的（リアルタイム）に測定するものである。核酸構築物は、ｃＤＮＡ又はＲＮＡである。核酸構築物がｃＤＮＡである場合、ＲＮＡに転写してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに用いる。
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を意味しており、ＲＮＡを逆転写したｃＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応による増幅を経時的（リアルタイム）に測定するものである。核酸構築物は、ｃＤＮＡ又はＲＮＡである。核酸構築物がｃＤＮＡである場合、ＲＮＡに転写してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに用いる。
核酸構築物をポジティブコントロールとして用いることができるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの例として、ＴａｑＭａｎ Ａｓｓａｙ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ａｓｓａｙ等が挙げられる。核酸構築物をポジティブコントロールとして用いるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲとして、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ａｓｓａｙがより適しているが、これに限定されない。
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ポスピウイロイドのＰＣＲ増幅に適した条件で実行される。当該ＰＣＲ増幅に適した条件の例として、後述する実施例の条件が挙げられるが、これに限定されない。
（ＰＣＲプライマーセット）
核酸構築物は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡ増幅用のＰＣＲプライマーセットで増幅可能である。すなわち、核酸構築物は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡを増幅するために用いられるＰＣＲプライマーセットと同一のＰＣＲプライマーセットに相補的な配列を有し、当該相補配列にＰＣＲプライマーセットが結合することで増幅されるものである。
核酸構築物は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡ増幅用のＰＣＲプライマーセットで増幅可能である。すなわち、核酸構築物は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡを増幅するために用いられるＰＣＲプライマーセットと同一のＰＣＲプライマーセットに相補的な配列を有し、当該相補配列にＰＣＲプライマーセットが結合することで増幅されるものである。
ＰＣＲプライマーセットは、核酸構築物における相補配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるように設計された配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを意味する。「ストリンジェントな条件」は、例えば、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中、６０℃で洗浄する条件である。
ＰＣＲプライマーセットは、フォワードプライマー及びリバースプライマーを組み合わせたものであり得る。ＰＣＲプライマーセットには、例として、配列番号４〜９のいずれかに示す配列からなるプライマーが含まれる。また、ＰＣＲプライマーセットは、配列番号４〜９のいずれかに示す配列に対して、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマーが含まれていてもよい。
後述する配列番号１に示す塩基配列からなる核酸構築物において、ＰＣＲプライマーセットにより増幅される領域は、配列番号４に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号５に示す塩基配列からなるプライマーからなるＰＣＲプライマーセットを用いて増幅可能である。後述する配列番号２に示す塩基配列からなる核酸構築物において、ＰＣＲプライマーセットにより増幅される領域は、配列番号６に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号７に示す塩基配列からなるプライマーからなるＰＣＲプライマーセットを用いて増幅可能である。後述する配列番号３に示す塩基配列からなる核酸構築物において、ＰＣＲプライマーセットにより増幅される領域は、配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号９に示す塩基配列からなるプライマーからなるＰＣＲプライマーセットを用いて増幅可能である。
なお、ＰＣＲプライマーセットは、ポスピウイロイドのｃＤＮＡと、本発明に係る核酸構築物（当該ポスピウイロイドのポジティブコントロールとなる）との双方を増幅可能なものであれば、上記した具体例のものに限定されない。例えば、配列番号４に示す塩基配列における少なくとも１５個の連続する塩基を含むプライマーは、配列番号４に示す塩基配列からなるプライマーと同様に使用し得る。プライマーの長さは、一例では１５ｂｐ〜５０ｂｐの範囲内であり、１５又は１７ｂｐ〜３５ｂｐの範囲内であり、１５又は１７ｂｐ〜３０ｂｐの範囲内であり、１５、１７又は２０ｂｐ〜２５ｂｐの範囲内である。配列番号５、６、７、８、及び９に示すプライマーも同様にして設計変更が可能であり得る。なお、配列番号４〜９に示すよりもプライマーの長さを延ばす場合は、増幅対象となるウイロイドの配列を参照して設計すればよい。
（増幅領域）
ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域（増幅領域）は、ＰＣＲプライマーセットに対する相補配列の領域と、これらの相補配列に挟まれた領域とを含む。核酸構築物及びポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅領域の長さは、一例では、８０塩基長〜３００塩基長の範囲内であり、１００塩基長〜３００塩基長の範囲内であり、１００塩基長〜２７０塩基長の範囲内であり、１３０塩基長〜２７０塩基長の範囲内であり、又は１３５塩基長〜２６５塩基長の範囲内である。また、核酸構築物及びポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅領域は、一例では、それらの全長配列における第２０番目の塩基から第３５０番目の塩基までの範囲内、第２５番目の塩基から第３００番目の塩基までの範囲内、第２８番目の塩基から第２９０番目の塩基までの範囲内、又は、第３０番目の塩基から第２９０番目の塩基までの範囲内の領域である。
ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域（増幅領域）は、ＰＣＲプライマーセットに対する相補配列の領域と、これらの相補配列に挟まれた領域とを含む。核酸構築物及びポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅領域の長さは、一例では、８０塩基長〜３００塩基長の範囲内であり、１００塩基長〜３００塩基長の範囲内であり、１００塩基長〜２７０塩基長の範囲内であり、１３０塩基長〜２７０塩基長の範囲内であり、又は１３５塩基長〜２６５塩基長の範囲内である。また、核酸構築物及びポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅領域は、一例では、それらの全長配列における第２０番目の塩基から第３５０番目の塩基までの範囲内、第２５番目の塩基から第３００番目の塩基までの範囲内、第２８番目の塩基から第２９０番目の塩基までの範囲内、又は、第３０番目の塩基から第２９０番目の塩基までの範囲内の領域である。
核酸構築物において、ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅される領域との比較で、異なる塩基配列を有している。すなわち、核酸構築物における増幅領域の塩基配列は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅領域の塩基配列と異なっている。
核酸構築物における増幅領域の塩基配列は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅領域の塩基配列との同一性が、一例では、９９％以下、９８％以下、９７％以下、９６％以下、又は、９５％以下である。
また、核酸構築物における増幅領域の塩基配列は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅領域の塩基配列との同一性が、一例では、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上，８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、又は、９５％以上であるが、完全同一ではない。これにより、核酸構築物をポスピウイロイドのポジティブコントロールとして用いた場合に、ポスピウイロイド以外の核酸を検出又は定量するリスクが低減し、ポスピウイロイド検出及び定量の精度の低下を防ぐことができる。
核酸構築物における増幅領域の塩基配列とポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅領域の塩基配列との同一性の範囲は、一例では、７５％〜９５％、８０％〜９５％、又は８５％〜９５％の範囲である。また、一例では、核酸構築物の増幅領域は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡの増幅領域との比較で、同一性の範囲が７５％〜９５％、かつ、塩基配列の長さの差は±５％の範囲内であり、同一性の範囲が８０％〜９５％、かつ、塩基配列の長さの差は±３％の範囲内である。さらに、一例では、核酸構築物の増幅領域は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡの増幅領域との比較で、同一性の範囲が７５％〜９５％、かつ、塩基配列のＧＣ含有率の差は±５％の範囲内であり、同一性の範囲が８０％〜９５％、かつ、塩基配列のＧＣ含有率の差は±３％の範囲内である。
このように、核酸構築物において増幅される領域の塩基配列とポスピウイロイドのｃＤＮＡにおいて増幅される領域の塩基配列とが異なっていることによって、増幅された塩基配列に基づいて核酸構築物とポスピウイロイドとを容易に区別することができる。その結果、検出又は定量された核酸構築物が、ポジティブコントロールであるのであって、野生型のポスピウイロイドによるコンタミネーションではないことを、明確に判別することができる。
核酸構築物とポスピウイロイドとは、ゲル電気泳動解析、キャピラリー電気泳動解析、自動シークエンサー等を用いた塩基配列決定解析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ解析等の公知の解析方法により区別することができるが、これらに限定されない。
（制限酵素認識配列）
核酸構築物において、ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域は、制限酵素で処理された場合に、ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおいて増幅される領域とは異なる位置で切断されることが好ましい。すなわち、核酸構築物において増幅される領域の制限酵素認識配列は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおいて増幅される領域の制限酵素認識配列とは異なることが好ましい。これにより、核酸構築物とポスピウイロイドのｃＤＮＡとを制限酵素で処理した場合に、切断された核酸断片の長さが異なる。したがって、核酸断片の長さを比較するのみで、核酸構築物をポスピウイロイドと容易に区別することができる。
核酸構築物において、ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域は、制限酵素で処理された場合に、ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおいて増幅される領域とは異なる位置で切断されることが好ましい。すなわち、核酸構築物において増幅される領域の制限酵素認識配列は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおいて増幅される領域の制限酵素認識配列とは異なることが好ましい。これにより、核酸構築物とポスピウイロイドのｃＤＮＡとを制限酵素で処理した場合に、切断された核酸断片の長さが異なる。したがって、核酸断片の長さを比較するのみで、核酸構築物をポスピウイロイドと容易に区別することができる。
また、核酸構築物において、ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域は、前記ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅される領域には存在しない制限酵素認識配列を含んでいてもよい。これにより、核酸構築物とポスピウイロイドのｃＤＮＡとを制限酵素で処理した場合に、核酸構築物を当該制限酵素認識配列において切断する制限酵素によって、ポスピウイロイドのｃＤＮＡは切断されない。したがって、当該制限酵素によって切断されるか否かを判断するのみで、核酸構築物をポスピウイロイドと容易に区別することができる。
核酸構築物において、ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域に含まれる制限酵素認識配列として、例えば、ＭｕｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍｉＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＡａｔＩＩI、ＡｃｃＩＩＩ、ＡｆａＩ、ＡｆｌＩＩ、Ａｏｒ１３ＨＩ、ＡｐａＩ、ＢａｌＩ、ＢｂｅＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｌｕＩ、Ｂｓｔ１１０７Ｉ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｐａＩ、ＭｌｕＩ、ＮａｅＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＰｍａＣＩ、ＳｐｅＩ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ等の制限酵素の認識配列が挙げられる。ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域には、２以上の上記制限酵素の認識配列が含まれていてもよい。ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域は、例えば、ＭｕｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＤｒａＩ、及びＥｃｏＲＩの４つの制限酵素認識配列を含んでいてもよい。
核酸構築物において、制限酵素認識配列は、ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域の５’末端及び３’末端から離れた位置に含まれていることが好ましい。制限酵素認識配列が、増幅される領域の５’末端及び３’末端に近い位置に含まれていると、制限酵素により切断される核酸断片と切断前の核酸との長さの差が小さく、長さの比較による核酸構築物とポスピウイロイドとの識別が困難になる。制限酵素認識配列が、増幅される領域の５’末端及び３’末端から離れた位置に含まれていれば、制限酵素により切断される核酸断片と切断前の核酸との長さの差が大きくなり、長さの比較による核酸構築物とポスピウイロイドとの識別が容易である。核酸構築物において、制限酵素認識配列は、ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域の５’末端又は３’末端から、増幅される領域の塩基長の約半分程度離れた塩基配列の領域に含まれていることが好ましい。
制限酵素で処理した核酸構築物の検出及び比較は、例えば、ゲル電気泳動解析、キャピラリー電気泳動解析等の塩基配列解析方法により行うことができるが、これらに限定されない。
（塩基配列の長さ）
核酸構築物において、ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅される領域との比較において、塩基配列の長さ（ｂｐ）の差が±５％の範囲内である。これにより、核酸構築物を、例えば、ポスピウイロイドの定量のポジティブコントロールとして用いた場合に、ポスピウイロイドとの増幅曲線の類似性が高いため、精度よく定量することができる。ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域の塩基配列の長さは、ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅される領域の塩基配列の長さと概ね同一であることが好ましい。
核酸構築物において、ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅される領域との比較において、塩基配列の長さ（ｂｐ）の差が±５％の範囲内である。これにより、核酸構築物を、例えば、ポスピウイロイドの定量のポジティブコントロールとして用いた場合に、ポスピウイロイドとの増幅曲線の類似性が高いため、精度よく定量することができる。ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域の塩基配列の長さは、ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅される領域の塩基配列の長さと概ね同一であることが好ましい。
核酸構築物において、ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅される領域との比較において、塩基配列の長さの差は、好ましくは±３％の範囲内であり、より好ましくは±１％の範囲内であり、最も好ましくはその長さが同一である。また、核酸構築物の塩基配列は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡの全長配列との比較において、塩基配列の長さの差は、好ましくは±５％の範囲内であり、より好ましくは±３％の範囲内であり、さらに好ましくは±１％の範囲内であり、最も好ましくはその長さが同一である。
（塩基配列のＧＣ含有率）
核酸構築物の塩基配列は、ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅される領域との比較において、塩基配列のＧＣ含有率の差が±５％の範囲内である。これにより、核酸構築物を、例えば、ポスピウイロイドの検出のポジティブコントロールとして用いた場合に、ポスピウイロイドと解離曲線のピーク値の類似性が高いため、精度よく検出することができる。ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域の塩基配列のＧＣ含有率は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅される領域の塩基配列のＧＣ含有率と概ね同一であることが好ましい。
核酸構築物の塩基配列は、ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅される領域との比較において、塩基配列のＧＣ含有率の差が±５％の範囲内である。これにより、核酸構築物を、例えば、ポスピウイロイドの検出のポジティブコントロールとして用いた場合に、ポスピウイロイドと解離曲線のピーク値の類似性が高いため、精度よく検出することができる。ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域の塩基配列のＧＣ含有率は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅される領域の塩基配列のＧＣ含有率と概ね同一であることが好ましい。
ＧＣ含有率は、対象領域内の塩基配列におけるグアニンとシトシンとの含有率を意味している。ＧＣ含有率は、当該領域内の塩基配列中に出現するグアニン及びシトシンの数を、当該塩基配列の長さで除算することにより算出することができる。
核酸構築物において、ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅される領域との比較において、塩基配列のＧＣ含有率の差は、好ましくは±３％の範囲内であり、より好ましくは±１％の範囲内であり、最も好ましくは塩基配列のＧＣ含有率が同一である。また、核酸構築物の塩基配列は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡの全長配列との比較において、塩基配列のＧＣ含有率の差は、好ましくは±５％の範囲内であり、より好ましくは±３％の範囲内であり、さらに好ましくは±１％の範囲内であり、最も好ましくは塩基配列のＧＣ含有率が同一である。
（核酸構築物の塩基配列）
核酸構築物は、（ａ）配列番号１から３のいずれかに示す塩基配列；（ｂ）配列番号１から３のいずれかに示す塩基配列における、少なくとも１つの塩基が置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列；及び（ｃ）配列番号１から３のいずれかに示す塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列からなる群より選択されるいずれかの塩基配列からなっていてもよい。
核酸構築物は、（ａ）配列番号１から３のいずれかに示す塩基配列；（ｂ）配列番号１から３のいずれかに示す塩基配列における、少なくとも１つの塩基が置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列；及び（ｃ）配列番号１から３のいずれかに示す塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列からなる群より選択されるいずれかの塩基配列からなっていてもよい。
前記（ａ）の塩基配列に関して、配列番号１に示す塩基配列は、ＰＳＴＶｄの塩基配列の一部が変異した塩基配列である。配列番号２に示す塩基配列は、ＰＣＦＶｄの塩基配列の一部が変異した塩基配列である。配列番号３に示す塩基配列は、ＣＬＶｄの塩基配列の一部が変異した塩基配列である。
配列番号１に示す塩基配列からなる核酸構築物は、ＰＳＴＶｄ、ＴＣＤＶｄ、ＴＡＳＶｄ、ＴＰＭＶｄ、ＣＳＶｄ、及びＣＥＶｄの６種類のポスピウイロイドのポジティブコントロールとして共通に用いることができる。配列番号２に示す塩基配列からなる核酸構築物は、ＰＣＦＶｄのポジティブコントロールとして用いることができる。配列番号３に示す塩基配列からなる核酸構築物は、ＣＬＶｄのポジティブコントロールとして用いることができる。
前記（ｂ）の塩基配列に関して、配列番号１から３のいずれかに示す塩基配列で示される核酸構築物の、機能的に同等の変異体、誘導体、バリアント、アレル、ホモログ、オルソログ、部分ヌクレオチド、他のヌクレオチドとの融合核酸等の塩基配列を意図しており、ポスピウイロイドのポジティブコントロールとして用いられる限り、その塩基配列については限定されない。
ここで、欠失、置換又は付加されてもよい塩基の数は、上記機能を失わせない限り、限定されていないが、部位特異的突然変異誘発法等の公知の導入法によって、欠失、置換、又は付加できる程度の数をいい、通常は、５０塩基以内であり、好ましくは３０塩基以内であり、より好ましくは２０塩基以内であり、さらに好ましくは１０塩基以内であり、最も好ましくは５塩基以内（例えば、５、４、３、２又は１塩基）である。前記（ｂ）の塩基配列に関して、配列番号１〜３のいずれかにおいて欠失、置換又は付加される塩基は、ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域外の塩基であることが好ましい。
本明細書中において「変異体」とは、部位特異的突然変異誘発法等によって人為的に導入された変異体を主に意味するが、天然に存在する同様の変異体であってもよい。本明細書において「機能的に同等」とは、対象となる塩基配列で示される核酸構築物が、目的とする塩基配列で示される核酸構築物と同等（同一および／または類似）の生物学的機能や生化学的機能を有することを意図する。変異を導入した核酸構築物が所望の機能を有するかどうかは、その変異した核酸構築物をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲすることにより得られる増幅曲線及び解離曲線と、ポスピウイロイドの増幅曲線及び解離曲線を比較することにより判断できる。
前記（ｃ）の塩基配列に関して、配列番号１から３のいずれかに示す塩基配列で示される核酸構築物の、機能的に同等の変異体、誘導体、バリアント、アレル、ホモログ、オルソログ、部分ヌクレオチド、他のヌクレオチドとの融合遺伝子等の塩基配列を意図しており、ポスピウイロイドのポジティブコントロールとして用いられる限り、その塩基配列については限定されない。前記（ｃ）の塩基配列に関して、配列番号１から３のいずれかにおいて変異する塩基は、ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域外の塩基であることが好ましい。
塩基配列の同一性とは、塩基配列全体（または機能発現に必要な領域）で、少なくとも９０％以上、より好ましくは９５％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を有することを意味する。塩基配列の同一性は、BLASTNのプログラム（Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990）を利用して決定することができる。該プログラムは、KarlinおよびAltschulによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993）に基づいている。BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore ＝１００、wordlength ＝１２とする。この解析方法の具体的な手法は公知である。比較対象の塩基配列を最適な状態にアラインメントするために、付加または欠失（例えば、ギャップ等）を許容してもよい。
上述した配列番号１から３のいずれかに示す塩基配列で示される核酸構築物の変異体を得る方法としては、通常行われるポリヌクレオチド改変方法を用いてもよい。すなわち、配列番号１から３のいずれかに示す塩基配列で示されるポリヌクレオチドの特定の塩基を置換、欠失、挿入および／または付加することで、所望の変異体を作製することができる。ポリヌクレオチドの塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（KOD-Plus Site-Directed Mutagenesis Kit；東洋紡製，Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit; Clontech製，QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit; Stratagene製など）の使用、またはポリメラーゼ連鎖反応法（polymerase chain reaction：ＰＣＲ）の利用が挙げられる。これらの方法は当業者に公知である。
核酸構築物は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡの全長配列との同一性が９０％以上の塩基配列からなってもよい。核酸構築物は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡの全長配列との同一性が、より好ましくは９５％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の塩基配列からなる。これにより、核酸構築物をポスピウイロイドのポジティブコントロールとして用いた場合に、ポスピウイロイド以外の核酸を検出又は定量するリスクが低減し、ポスピウイロイド検出及び定量の精度の低下を防ぐことができる。
ポスピウイロイドのｃＤＮＡの全長配列は、ＧｅｎＢａｎｋ配列データベースにおいて、ＰＳＴＶｄは、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＥＵ８６２２３１、ＰＣＦＶｄは、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＨＱ７３１６５２、ＣＬＶｄは、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ３７２３９２に登録されている全長塩基配列を示している。
核酸構築物における増幅領域以外の領域の塩基配列は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅領域以外の領域の塩基配列との同一性が、一例では、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は完全同一である。
また、核酸構築物の全長塩基配列は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡの全長塩基配列との同一性が、一例では、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上であるが、完全同一ではない。核酸構築物の全長塩基配列とポスピウイロイドのｃＤＮＡの全長塩基配列との同一性の範囲は、一例では、８０％〜９９％、９０％〜９８％、又は９０％〜９５％の範囲である。また、一例では、核酸構築物の全長配列は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡの全長配列との比較で、同一性の範囲が９０％〜９８％、かつ、塩基配列の長さの差は±３％の範囲内であり、同一性の範囲が９０％〜９５％、かつ、塩基配列の長さの差は±１％の範囲内である。さらに、一例では、核酸構築物の全長配列は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡの全長配列との比較で、同一性の範囲が９０％〜９８％、かつ、塩基配列のＧＣ含有率の差は±３％の範囲内であり、同一性の範囲が９０％〜９５％、かつ、塩基配列のＧＣ含有率の差は±１％の範囲内である。
（核酸構築物の作製）
核酸構築物は、鋳型となるｃＤＮＡと、適切なプライマーセットとを用いてＰＣＲ増幅することにより作製することができる。また、核酸構築物は、公知の他のポリヌクレオチド合成方法により作製してもよい。
核酸構築物は、鋳型となるｃＤＮＡと、適切なプライマーセットとを用いてＰＣＲ増幅することにより作製することができる。また、核酸構築物は、公知の他のポリヌクレオチド合成方法により作製してもよい。
配列番号１から３のいずれかに示す塩基配列からなる核酸構築物は、配列番号１から３のいずれかに示す塩基配列が挿入されたベクターと、配列番号１０〜１２のいずれかに示す塩基配列からなるプライマーを含むプライマーセットを用いて、ＰＣＲ増幅することにより作製することができる。
配列番号１に示す塩基配列からなる核酸構築物は、配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマーからなるプライマーセットを用いて、ＰＣＲ増幅することにより作製することができる。配列番号２に示す塩基配列からなる核酸構築物は、配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマーからなるプライマーセットを用いて、ＰＣＲ増幅することにより作製することができる。配列番号３に示す塩基配列からなる核酸構築物は、配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１２に示す塩基配列からなるプライマーからなるプライマーセットを用いて、ＰＣＲ増幅することにより作製することができる。
配列番号１から３のいずれかに示す塩基配列が挿入するベクターとしては、ｐＵＣ１９のような公知のクローニングベクターを用いることができる。このようなクローニングベクターを上述したプライマーセットと共に、適切なＰＣＲ条件下でＰＣＲ増幅することで、配列番号１から３のいずれかに示す塩基配列からなる核酸構築物のｃＤＮＡを得ることができる。核酸構築物がＲＮＡである場合には、ＰＣＲ増幅により得られたｃＤＮＡを用いて適切なＲＮＡ転写反応条件下でＲＮＡ転写し、鋳型ｃＤＮＡを除去することで得られる。適切なＰＣＲ条件及びＲＮＡ転写反応条件として、例えば、後述する実施例の条件であり得るが、これに限定されない。
得られた核酸構築物は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおけるポスピウイロイドのポジティブコントロールとして使用するのに適した濃度に希釈して用いられる。核酸構築物がｃＤＮＡである場合には、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに用いる前にＲＮＡ転写する。ＲＮＡはｃＤＮＡと比較して不安定であるため、ｃＤＮＡの核酸構築物を流通又は保管し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行う作業者が、作業前にＲＮＡ転写して用いることが好ましい。
〔ベクター〕
本発明の一実施形態に係るベクターは、上述した核酸構築物のいずれかを含む。核酸構築物が挿入されるベクターとして、例えば、ｐＵＣ系プラスミド、ｐＨＳＧ系プラスミド（ＴａＫａＲａ）、ｐＣＲ系プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＭ系プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）等の公知のクローニングベクターが挙げられるがこれに限定されない。上述した核酸構築物のいずれかを含むベクターは、核酸構築物の作製に有用である。
本発明の一実施形態に係るベクターは、上述した核酸構築物のいずれかを含む。核酸構築物が挿入されるベクターとして、例えば、ｐＵＣ系プラスミド、ｐＨＳＧ系プラスミド（ＴａＫａＲａ）、ｐＣＲ系プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＭ系プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）等の公知のクローニングベクターが挙げられるがこれに限定されない。上述した核酸構築物のいずれかを含むベクターは、核酸構築物の作製に有用である。
上述した核酸構築物は、本発明に係るベクターに含まれる核酸構築物の一態様である。したがって、本発明に係るベクターの詳細については、上述した本発明の一実施形態に係る核酸構築物の説明に準じる。
〔ポスピウイロイドの解析方法〕
本発明の一実施形態に係るポスピウイロイドの解析方法は、上述したいずれかの核酸構築物及び被験植物由来のＲＮＡを、リアルタイムＲＴ-ＰＣＲにより増幅する増幅工程を包含する。
本発明の一実施形態に係るポスピウイロイドの解析方法は、上述したいずれかの核酸構築物及び被験植物由来のＲＮＡを、リアルタイムＲＴ-ＰＣＲにより増幅する増幅工程を包含する。
ポスピウイロイドの解析方法における被験植物として、例えば、ポスピウイロイドに対して被感染性を有する植物が挙げられるがこれに限定されない。そのような被験植物の例としては、ナス科植物（例えば、ナス属、ペチュニア属、トウガラシ属、タバコ属）、クマツヅラ科植物（例えば、クマツヅラ属）、キク科植物（例えば、キク属、シュンギク属）等が挙げられる。具体例としては、ジャガイモ、トマト、ペチュニア、ピーマン、タバコ、バーベナ、シュンギク等が挙げられる。ポスピウイロイドの感染の可能性がある植物は、ポスピウイロイドの解析方法の適用対象として特に好適である。
ポスピウイロイドの解析方法における被験植物の試料は、それら被験植物の植物体全体であってもよく、そこから採取した植物体の一部（例えば、葉、茎、果実、がく、花弁、根、塊茎又は種子等）であってもよく、その細胞又は細胞培養物（培養細胞、カルス等）であってもよい。被験植物試料由来のＲＮＡは、例えば、被験植物試料から抽出したＲＮＡ（例えば、全ＲＮＡ）又はその精製物である。被験植物試料からのＲＮＡ抽出は、植物分子生物学の分野で慣用されているＲＮＡ抽出技術に従って抽出することができる。例えば、シングルステップＲＮＡ精製法、ガラス吸着法、酸性フェノール抽出法等の公知の任意のＲＮＡ抽出法を使用することができる。ＲＮＡの抽出は、例えばＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＲＮＡｉｓｏ（ＴａＫａＲａ）、ＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ）、ＴｏＴＡＬＬＹ ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ等の市販のＲＮＡ抽出試薬や市販のＲＮＡ抽出キット（例えば、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｐｌｕｓ ＲＮＡ精製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｍａｘｗｅｌｌ １６ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）等）を用いて行うこともできる。抽出したＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲに供する前に、必要に応じてＨＰＬＣ精製等の周知技術により精製してもよい。
増幅工程においては、ポスピウイロイドのｃＤＮＡ増幅用のＰＣＲプライマーセットを用いて、核酸構築物及び被験植物由来のＲＮＡから得られるｃＤＮＡを鋳型としたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによりＰＣＲ増幅を行う。増幅工程においては、まず、核酸構築物及び被験植物由来のＲＮＡから、逆転写酵素及び第一鎖ｃＤＮＡ合成プライマーを用いてｃＤＮＡを合成する。そして合成したｃＤＮＡを、ｃＤＮＡ増幅用のＰＣＲプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅する。そして、ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅する反応系に蛍光色素を存在させ、ＰＣＲ増幅中の蛍光シグナルを検出する。これにより、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによりポスピウイロイドを解析する。
増幅工程において用いられるＰＣＲ増幅の反応系に存在させる蛍光色素としては、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ色素、ＴＢ Ｇｒｅｅｎ色素等の公知の蛍光色素を用いることができる。増幅工程におけるＰＣＲ増幅は、ポスピウイロイドのＰＣＲ増幅に適した条件で実行される。当該ＰＣＲ増幅に適した条件の例として、実施例の条件が挙げられるが、これに限定されない。
ｃＤＮＡ増幅用のＰＣＲプライマーセットは、ポスピウイロイドのｃＤＮＡ増幅用のＰＣＲプライマーセットであり、フォワードプライマー及びリバースプライマーを組み合わせたものであり得る。例えば、ｃＤＮＡ増幅用のＰＣＲプライマーセットには、配列番号４〜９のいずれかに示す配列からなるプライマーが含まれる。
増幅工程においては、ＰＳＴＶｄ、ＴＣＤＶｄ、ＴＡＳＶｄ、ＴＰＭＶｄ、ＣＳＶｄ、及びＣＥＶｄの６種類のポスピウイロイドの解析を行う場合、配列番号４に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号５に示す塩基配列からなるプライマーからなるＰＣＲプライマーセットを共通して用いることができる。また、ＰＣＦＶｄの解析を行う場合、配列番号６に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号７に示す塩基配列からなるプライマーからなるＰＣＲプライマーセットを用いることができる。さらに、ＣＬＶｄの解析を行う場合、配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号９に示す塩基配列からなるプライマーからなるＰＣＲプライマーセットを用いることができる。
ポスピウイロイドの解析方法は、増幅工程において増幅した核酸構築物及びＲＮＡの解離曲線を生成する生成工程をさらに包含していてもよい。生成した解離曲線のピーク値を比較することで、被験植物由来のＲＮＡがポスピウイロイドであるか否かを検出することができる。
また、増幅工程において増幅した核酸構築物とＲＮＡとを、例えば、ゲル電気泳動解析、キャピラリー電気泳動解析等の塩基配列解析方法により解析し、核酸構築物とＲＮＡとのバンドを比較することで、被験植物由来のＲＮＡがポスピウイロイドであるか否かを検出してもよい。
増幅工程においてＰＣＲ増幅中の蛍光シグナルを検出することで、核酸構築物及び被験植物由来のＲＮＡの増幅曲線を生成してもよい。生成した増幅曲線を比較することで、被験植物由来のＲＮＡを定量することができる。
ポスピウイロイドの解析方法は、増幅工程において増幅した核酸構築物を、核酸構築物に含まれる制限酵素認識配列を認識する制限酵素で処理する工程を包含してもよい。そして、制限酵素で処理した核酸構築物を、例えば、ゲル電気泳動解析、キャピラリー電気泳動解析等の塩基配列解析方法により解析してもよい。制限酵素で処理した核酸構築物のバンドと野生型のポスピウイロイドの公知のバンドとを比較することで、核酸構築物の増幅が、野生型のポスピウイロイドのコンタミネーションではないことを判別することができる。
ここで、ポスピウイロイドの解析方法について、図１を参照して説明する。図１は、本発明の一実施形態に係るポジティブコントロールを用いたポスピウイロイドの解析方法を説明する図である。増幅工程は、図１に示す１次検定に相当する。図１に示す１次検定及び２次検定は、非特許文献２の記載に従って、好適に行なうことができる。
増幅工程において、ＰＳＴＶｄ、ＴＣＤＶｄ、ＴＡＳＶｄ、ＴＰＭＶｄ、ＣＳＶｄ、及びＣＥＶｄの６種類のポスピウイロイドに対するユニバーサルプライマーを用いて、ＰＳＴＶｄ、ＴＣＤＶｄ、ＴＡＳＶｄ、ＴＰＭＶｄ、ＣＳＶｄ、及びＣＥＶｄの６種類のポスピウイロイドに対する核酸構築物及び被験植物由来のＲＮＡを増幅してもよい。その結果、被験植物由来のＲＮＡが上記６種類のいずれかのポスピウイロイドであるか否かを検出することができる。
ユニバーサルプライマーを用いた１次検定の結果が陽性であった場合には、さらに図１に示す２次検定を行ってもよい。これにより、被験植物由来のＲＮＡが、ＰＳＴＶｄ、ＴＣＤＶｄ、ＴＡＳＶｄ、ＴＰＭＶｄ、ＣＳＶｄ、及びＣＥＶｄの６種類のポスピウイロイドのうち、いずれのポスピウイロイドであるかを識別することができる。なお、１次検定のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲはＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法であり、２次検定のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲはＴａｑＭａｎ法であることが好ましい。
また、増幅工程において、ＰＣＦＶｄ特異的プライマーを用いて、ＰＣＦＶｄに対する核酸構築物を及び被験植物由来のＲＮＡを増幅してもよい。その結果、被験植物由来のＲＮＡがＰＣＦＶｄであるか否かを検出することができる。
さらに、増幅工程において、ＣＬＶｄ特異的プライマーを用いて、ＰＣＦＶｄに対する核酸構築物を及び被験植物由来のＲＮＡを増幅してもよい。その結果、被験植物由来のＲＮＡがＣＬＶｄであるか否かを検出することができる。
なお、上述した核酸構築物は、本発明に係るポスピウイロイドの解析方法において用いられる核酸構築物の一態様である。したがって、本発明に係るポスピウイロイドの解析方法の他の詳細については、上述した本発明の一実施形態に係る核酸構築物の説明に準じる。
〔ポスピウイロイドの解析キット〕
本発明の一実施形態に係るポスピウイロイドの解析キットは、上述したいずれかの核酸構築物と、ポスピウイロイドのｃＤＮＡ増幅用のＰＣＲプライマーセットとを備えている。また、ポスピウイロイドの解析キットにおいて、核酸構築物はベクターに組み込まれた形態である。
本発明の一実施形態に係るポスピウイロイドの解析キットは、上述したいずれかの核酸構築物と、ポスピウイロイドのｃＤＮＡ増幅用のＰＣＲプライマーセットとを備えている。また、ポスピウイロイドの解析キットにおいて、核酸構築物はベクターに組み込まれた形態である。
なお、上述した核酸構築物は、本発明に係るポスピウイロイドの解析キットに含まれる核酸構築物の一態様である。したがって、本発明に係るポスピウイロイドの解析キットの詳細については、上述した本発明の一実施形態に係る核酸構築物の説明に準じる。
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
〔１．ポジティブコントロールの作成〕
ＤＮＡ合成メーカーに依頼し、配列番号１〜３の塩基配列が挿入されたクローニングベクター（ｐＵＣ１９）を入手した。このクローニングベクターを鋳型として、以下に示すプライマーセットを用い、以下に示すＰＣＲ反応液中で以下に示すＰＣＲ反応条件でＰＣＲ増幅した。
ＤＮＡ合成メーカーに依頼し、配列番号１〜３の塩基配列が挿入されたクローニングベクター（ｐＵＣ１９）を入手した。このクローニングベクターを鋳型として、以下に示すプライマーセットを用い、以下に示すＰＣＲ反応液中で以下に示すＰＣＲ反応条件でＰＣＲ増幅した。
配列番号１の塩基配列からなるユニバーサルポジティブコントロールを、フォワードプライマー(pUC19vector-F):TCCGATCTGATGTAATACGACTCAC（配列番号１０）及びリバースプライマー(6Pospi-R): TTCAGTTGTTTCCACCGGGTA（配列番号１１）を用いて作製した。配列番号２の塩基配列からなるＰＣＦＶｄ特異的ポジティブコントロールを、フォワードプライマー(pUC19vector-F):TCCGATCTGATGTAATACGACTCAC（配列番号１０）及びリバースプライマー(6Pospi-R): TTCAGTTGTTTCCACCGGGTA（配列番号１１）を用いて作製した。配列番号３の塩基配列からなるＣＬＶｄ特異的ポジティブコントロールを、フォワードプライマー(pUC19vector-F):TCCGATCTGATGTAATACGACTCAC（配列番号１０）及びリバースプライマー(CLV-R3): AGGAAAGGAAACCCGAAGAA（配列番号１２）を用いて作製した。
以下の組成のＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液組成
ＫＯＤ Ｏｎｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＴＯＹＯＢＯ ２５μｌ
ＤＮＡ （１ｎｇ／ｕｌ） ２μｌ
フォワードプライマー（２０ｕＭ） ２μｌ
リバースプライマー（２０ｕＭ） ２μｌ
蒸留水 １９μｌ
計 ５０μｌ
ＰＣＲ反応液組成
ＫＯＤ Ｏｎｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＴＯＹＯＢＯ ２５μｌ
ＤＮＡ （１ｎｇ／ｕｌ） ２μｌ
フォワードプライマー（２０ｕＭ） ２μｌ
リバースプライマー（２０ｕＭ） ２μｌ
蒸留水 １９μｌ
計 ５０μｌ
ＰＣＲ反応は、９８℃で１分の変性処理後、９８℃で１０秒、５８℃で５秒、６８℃で１０秒を１サイクルとして３５サイクル行い、続いて１２℃で保存することにより行った。
次いで、Ｔ７ ＲｉｂｏＭＡＸ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ製）を用いて、得られたｃＤＮＡの逆転写反応を行った。得られたｃＤＮＡ 約５〜６μｇを、バッファー（ＲｉｂｏＭＡＸ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｔ７ ２Ｘ Ｂｕｆｆｅｒ、プロメガ製）２０μＬ及びＲＮＡ転写酵素（Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ，Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ、プロメガ製）４μＬと混合し、蒸留水を添加して４０μＬの逆転写反応液を調製した。３７℃で一晩逆転写反応を行った。
反応産物をＴｕｒｂｏ ＤＮＡａｓｅ（Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ−Ｆｒｅｅ Ｋｉｔ、Ａｍｂｉｏｎ）で処理し、鋳型ｃＤＮＡの除去を行い、ＲＮＡのみを得た。得られたＲＮＡを、ポジティブコントロールとして使用するのに適切な濃度（通常、２０〜２５サイクルで増幅される濃度に設定）に希釈した。
また、得られたＰＣＲ反応産物のそれぞれを、２％アガロースゲルに注入して１×ＴＡＥバッファーを使用して電気泳動を行い、バンドを確認した。結果を図５に示す。図５において、レーン１にはユニバーサルポジティブコントロールのバンドが確認され、レーン２にはＣＬＶｄ特異的ポジティブコントロールのバンドが確認され、レーン３にはＰＣＦＶｄ特異的ポジティブコントロールのバンドが確認された。レーンＭは、１００ｂｐラダーマーカーである。図５に示すように、それぞれのポジティブコントロールが特異的に増幅された。
ここで、作製したそれぞれのポジティブコントロールと野生型ポスピウイロイドとの塩基配列とを、図２〜４を参照して比較する。図２は、野生型のＰＳＴＶｄの塩基配列及び実施例で作製したユニバーサルポジティブコントロールの塩基配列を示す図である。図３は、野生型のＰＣＦＶｄの塩基配列及び実施例で作製したＰＣＦＶｄのポジティブコントロールの塩基配列を示す図である。図４野生型のＣＬＶｄの塩基配列及び実施例で作製したＣＬＶｄのポジティブコントロールの塩基配列を示す図である。
図２〜４において、下線を付した領域はポスピウイロイド由来の配列を示しており、枠囲みした領域はポスピウイロイドのｃＤＮＡ増幅用のＰＣＲプライマーの塩基配列に相補的な配列を示しており、網掛けを付した領域はポジティブコントロールに挿入した制限酵素認識配列を示している。
図２に示すように、ユニバーサルポジティブコントロールは、ＰＳＴＶｄにおいてＰＣＲプライマーに相補的な配列に挟まれた増幅領域内に、４つの制限酵素認識配列（ＭｕｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＤｒａＩ、及びＥｃｏＲＩ）を含むように変異した塩基配列を有している。ユニバーサルポジティブコントロールの塩基長及びＧＣ含有率は、ＰＳＴＶｄと同一である。
また、図３に示すように、ＰＣＦＶｄ特異的ポジティブコントロールは、ＰＣＦＶｄにおいてＰＣＲプライマーに相補的な配列に挟まれた増幅領域内に、４つの制限酵素認識配列（ＭｕｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＤｒａＩ、及びＥｃｏＲＩ）を含むように変異した塩基配列を有している。ＰＣＦＶｄ特異的ポジティブコントロールの塩基長及びＧＣ含有率は、ＰＣＦＶｄと同一である。
さらに、図４に示すように、ＣＬＶｄ特異的ポジティブコントロールは、ＣＬＶｄにおいてＰＣＲプライマーに相補的な配列に挟まれた増幅領域内に、４つの制限酵素認識配列（ＭｕｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＤｒａＩ、及びＥｃｏＲＩ）を含むように変異した塩基配列を有している。ＣＬＶｄ特異的ポジティブコントロールの塩基長及びＧＣ含有率は、ＣＬＶｄと同一である。
〔２．リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ〕
１．で作成したポジティブコントロール及び野生型ポスピウイロイドについて、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＮＡ−ｔｏ−Ｃｔ １−Ｓｔｅｐ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液として、２μＬのＲＮＡ、１０μＬのＲＴ−ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、２００ｎＭのフォワードプライマー溶液及びリバースプライマー溶液、０．１６μＬのＲＴ−Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘを含み、蒸留水により２０μＬとしたＰＣＲ反応液を用いた。プライマーダイマーの抑制を、ＰＣＲサイクルを比較することで確認した。
１．で作成したポジティブコントロール及び野生型ポスピウイロイドについて、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＮＡ−ｔｏ−Ｃｔ １−Ｓｔｅｐ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液として、２μＬのＲＮＡ、１０μＬのＲＴ−ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、２００ｎＭのフォワードプライマー溶液及びリバースプライマー溶液、０．１６μＬのＲＴ−Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘを含み、蒸留水により２０μＬとしたＰＣＲ反応液を用いた。プライマーダイマーの抑制を、ＰＣＲサイクルを比較することで確認した。
配列番号１の塩基配列からなるユニバーサルポジティブコントロール及び野生型のＰＳＴＶｄに対して、フォワードプライマー: TCCTGTGGTTCACACCTGACC（配列番号４）及びリバースプライマー: TACCCGGTGGAAACAACTGAA（配列番号５）を用いて増幅した。配列番号２の塩基配列からなるＰＣＦＶｄ特異的ポジティブコントロール及び野生型のＰＣＦＶｄに対して、フォワードプライマー: CCCGAAGCCCGCTTAGG（配列番号６）及びリバースプライマー: TACCCGGTGGATACAACTGACAGA（配列番号７）を用いて増幅した。配列番号３の塩基配列からなるＣＬＶｄ特異的ポジティブコントロール及び野生型のＣＬＶｄに対して、フォワードプライマー: AAGAGCGCAAGAGCGGTCTCAG（配列番号８）及びリバースプライマー: TTCTTCGGGTTTCCT
（配列番号９）を用いて増幅した。
（配列番号９）を用いて増幅した。
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ反応を、Step One Plus real-time PCR systems(Applied Biosystems)において、９６ウェル中で行った。ＰＣＲ反応は、４８℃で３０分及び９５℃で１５分のサイクルを１サイクル行った後、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で３０秒のサイクルを４０サイクル行った。
ＰＣＲ増幅後、増幅曲線分析及び解離曲線分析を行った。結果を図６〜１１に示す。図６〜８は、実施例のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおける各ポジティブコントロールと野生型ポスピウイロイドの増幅曲線を示す図である。図６はユニバーサルポジティブコントロールと野生型ＰＳＴＶｄの増幅曲線を示している。図７はＣＬＶｄ特異的ポジティブコントロールと野生型ＣＬＶｄの増幅曲線を示している。図８はＰＣＦＶｄ特異的ポジティブコントロールと野生型ＰＣＦＶｄの増幅曲線を示している。
図９〜１１は、実施例のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおける各ポジティブコントロールと野生型ポスピウイロイドの解離曲線を示す図である。図９はユニバーサルポジティブコントロールと野生型ＰＳＴＶｄの解離曲線を示している。図１０はＣＬＶｄ特異的ポジティブコントロールと野生型ＣＬＶｄの解離曲線を示している。図１１はＰＣＦＶｄ特異的ポジティブコントロールと野生型ＰＣＦＶｄの解離曲線を示している。
図６〜１１に示すように、各ポジティブコントロールは、野生型のポスピウイロイドと同様に増幅し、解離曲線のピークが一致した。したがって、これらのポジティブコントロールは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるポスピウイロイド解析のポジティブコントロールとして適していることが示された。
また、これらのポジティブコントロールをトマトに接種しても感染は認められなかった。したがって、これらのポジティブコントロールが宿主植物に非感染性であることも示された。
次に、各ポジティブコントロールに挿入した４種の制限酵素認識配列を認識する制限酵素（ＭｕｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＤｒａＩ、及びＥｃｏＲＩ）により、各ポジティブコントロールを処理した。それぞれの制限酵素で処理した反応産物を、２％アガロースゲルに注入して１×ＴＡＥバッファーを使用して電気泳動を行い、バンドを確認した。
結果を図１２〜１４に示す。図１２〜１４は、実施例のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで増幅した各ポジティブコントロールを制限酵素で処理し、電気泳動した結果を示す図である。図１２は、ユニバーサルポジティブコントロールを制限酵素で処理し、電気泳動した結果を示している。図１２において、「ＰＳｐ」はユニバーサルポジティブコントロールのレーンを表しており、枠囲みした「ＰＳｐ」は制限酵素で処理したユニバーサルポジティブコントロールのレーンを表している。
また、図１２において、「ＰＳ」は野生型ＰＳＴＶｄ、「ＴＣ」は野生型ＴＣＤＶｄ、「ＴＡ」は野生型ＴＡＳＶｄ、「ＣＳ」は野生型ＣＳＶｄ、「ＣＥ」は野生型ＣＥＶｄ、「ＴＰ」は野生型ＴＰＭＶｄ、「Ｍ」は分子量マーカーのレーンをそれぞれ表している。図７において、一番上はＨｉｎｄＩＩＩにより処理した結果であり、その下はＥｃｏＲＩにより処理した結果であり、さらにその下はＤｒａＩにより処理した結果であり、一番下はＭｕｎＩにより処理した結果である。
また、図１３は、ＣＬＶｄ特異的ポジティブコントロールを制限酵素で処理し、電気泳動した結果を示しており、図１４は、ＰＣＦＶｄ特異的ポジティブコントロールを制限酵素で処理し、電気泳動した結果を示している。図１３及び図１４において、「ＨｉｎｄＩＩＩ」、「ＥｃｏＲＩ」、「ＤｒａＩ」、及び「ＭｕｎＩ」は、それぞれの制限酵素によりポジティブコントロールのレーンを表しており、「Ｍ」は分子量マーカーのレーンを表している。なお、図１３及び図１４において、表記のないレーンは、野生型ポスピウイロイド及び制限酵素で処理していないポジティブコントロールのレーンである。
図１２〜１４に示すように、制限酵素で処理した各ポジティブコントロールは、野生型ポスピウイロイド及び制限酵素で処理していないポジティブコントロールとは異なる位置にバンドが見られた。このように、制限酵素で処理することにより、ポジティブコントロールと野生型ポスピウイロイドとを容易に区別することができた。
本発明は、ウイロイド感染植物を解析することにより、植物検疫、植物防疫等の分野に利用することができる。また、ウイロイド感染植物を育種対象から排除することにより植物育種分野に利用することもできる。
Claims (12)
- ポスピウイロイドのポジティブコントロール用の核酸構築物であって、
リアルタイムＲＴ-ＰＣＲ用であり、
宿主に非感染性であり、
ポスピウイロイドのｃＤＮＡ増幅用のＰＣＲプライマーセットで増幅可能であり、並びに
前記ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅される領域との比較で、異なる塩基配列を有し、塩基配列の長さの差が±５％の範囲内であり、かつ、塩基配列のＧＣ含有率の差が±５％の範囲内である、
核酸構築物。 - （ａ）配列番号１から３のいずれかに示す塩基配列；
（ｂ）配列番号１から３のいずれかに示す塩基配列における、少なくとも１つの塩基が置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列；及び
（ｃ）配列番号１から３のいずれかに示す塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列
からなる群より選択されるいずれかの塩基配列からなる、請求項１に記載の核酸構築物。 - ポスピウイロイドのｃＤＮＡの全長配列との同一性が８０％以上の塩基配列からなる、請求項１又は２に記載の核酸構築物。
- 前記ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域の塩基配列は、ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅される領域の塩基配列との同一性が７５％以上である、
請求項１から３のいずれか１項に記載の核酸構築物。 - 前記ポスピウイロイドが、ジャガイモやせいもウイロイド、トマト黄化萎縮ウイロイド、カンキツエクソコーティスウイロイド、コルムネアラテントウイロイド、トマトアピカルスタントウイロイド、ペッパーチャットフルーツウイロイド、キク矮化ウイロイド、及びトマトプランタマッチョウイロイドからなる群より選択される、請求項１から４のいずれか１項に記載の核酸構築物。
- 前記ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域は、制限酵素で処理された場合に、前記ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅される領域とは異なる位置で切断される、請求項１から５のいずれか１項に記載の核酸構築物。
- 前記ＰＣＲプライマーセットで増幅される領域は、前記ポスピウイロイドのｃＤＮＡにおける増幅される領域には存在しない制限酵素認識配列を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の核酸構築物。
- 請求項１から７のいずれか１項に記載の核酸構築物を含む、ベクター。
- 請求項１から７のいずれか１項に記載の核酸構築物及び被験植物由来のＲＮＡを、リアルタイムＲＴ-ＰＣＲにより増幅する増幅工程を包含する、ポスピウイロイドの解析方法。
- 前記増幅工程において増幅した前記核酸構築物及び前記ＲＮＡの解離曲線を生成する生成工程をさらに包含する、請求項９に記載のポスピウイロイドの解析方法。
- 請求項１から７のいずれか１項に記載の核酸構築物と、
ポスピウイロイドのｃＤＮＡ増幅用のＰＣＲプライマーセットと
を備えた、ポスピウイロイドの解析キット。 - 前記核酸構築物はベクターに組み込まれた形態である、請求項１１に記載のポスピウイロイドの解析キット。
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| JP2002335981A (ja) * | 2001-03-02 | 2002-11-26 | F Hoffmann La Roche Ag | コントロールを用いる核酸の決定方法 |
| WO2010140518A1 (ja) * | 2009-06-02 | 2010-12-09 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 | ウイロイドPSTVd及びTCDVdの同時検出方法 |
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