KR101673143B1 - 엽록체 염기서열을 활용한 쓴메밀과 보통메밀의 구별 마커 및 쓴메밀과 보통메밀의 혼입 여부 구별 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 쓴메밀(Fagopyrum tartaricum)과 보통메밀(Fagopyrum esculentum)을 구별하기 위한 마커에 관한 것이다. 또한 본 발명은 쓴메밀과 보통메밀을 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공하는 것이다. 또한 본 발명은 대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제2항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 동정하는 단계;를 포함하는, 쓴메밀과 보통메밀을 구별하는 방법에 관한 것이다.

Description

엽록체 염기서열을 활용한 쓴메밀과 보통메밀의 구별 마커 및 쓴메밀과 보통메밀의 혼입 여부 구별 방법 {MARKER FOR DISCRIMINATION OF FAGOPYRUM TATARICUM AND FAGOPYRUM ESCULENTUM USING CHLOROPLAST SEQUENCE AND DETECTING METHOD}

본 발명은 쓴메밀(Fagopyrum tartaricum)과 보통메밀(Fagopyrum esculentum)의 구별을 위한 마커, 상기 마커를 증폭하기 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다.

소비자는 식품 안전성을 위한 품질 표시에 대해 높은 관심을 나타내고 있다. 식품에 대한 조성 및 품질 표시는, 소비자 스스로가 식품의 품질을 판단하고 선택하는데 있어서 없어서는 안되는 것이다.　메밀은 다양한 가공 공정을 거쳐 각종 식제품이 되어 시장에 유통되고 있다. 그 대표적인 메밀 가공품의 예로서 보통메밀을 사용한 메밀국수, 메밀차, 쓴메밀을 사용한 메밀국수 및 메밀차 등을 들 수 있다. 그러나 상기 가공품에 보통메밀 또는 쓴메밀의 함량이 100% 들어가 있는지 여부는 제조 과정을 역추적하여 조사하지 않고서는 알 수 없다. 즉, 상기 가공품에 어떤 종류의 메밀이 혼입되어 있는지에 대한 정성적 또는　정량적 판별 기술은 존재하지 않아, 가장 효율적인 검정방법인 분자표지방법이 필요한 실정이다.

이에 따라, 염색체 내 제한효소 인식부위의 변이의 의해 발생하는 염기서열 길이 차이를 이용한 RFLPs(Restriction Fragment Length Polymorphisms) 방법이 개발되었으나 이 방법은 방사선 동위원소를 사용해야 하는 번거로움이 있다. 이후 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 이용한 핵산지문법(fingerprinting)으로서, RAPD(randomly amplified polymorphic DNA) 방법 등이 개발되었다. PCR 방법은 10~20여 개의 뉴클레오티드로 구성된 작은 올리고뉴클레오타이드(이하 프라이머)을 생물체의 DNA 또는 RNA와 결합(annealing)시킨 후, 내열성 DNA 중합 효소(Tag DNA Polymerase)를 첨가하여 합성반응이 반복적으로 이루어지게 하는 방법이다. 이것은 다른 방법에 비해 소량의 DNA(1-50ng)만을 요구하며, 간편하고 빠르게 결과를 확인할 수 있다는 장점을 갖고 있다. PCR 방법으로 분석하는 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP(Amplified Fragment Length polymorphism) 방법은 높은 DNA 다형성(polymorphism)검출로 각광을 받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡하며, SSR (single sequence repeat)방법은 DNA 반복 배열인 초위성체(microsatellite) 영역의 염기배열 정보를 근거로 PCR 프라이머를 제작하여 개체 내의 초위성체를 분석하는 방법으로 상기 단순염기서열의 반복수는 품종 간 또는 개체 간에 다르게 때문에 이 부분을 PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타나게 되며 이를 동물과 식물의 유전 연구에 활발히 이용하고 있으나 벼에서 기 개발된 SSR 마커의 수가 고밀도 유전자지도 제작에는 충분하지 않는 단점이 있다.

이에 반해 In/del(insertion　or deletion) 마커는 PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타나게 하는 장점을 유지하며 고밀도 유전자지도 제작에는 충분하지 않는 SSR 마커의 단점을 보완하는 것으로 특정 위치에 있는 DNA의 염기서열 분석을 통해 품종간 염기서열의 삽입 또는 결실을 기반으로 PCR 프라이머를 제작하는 방법이다.

대한민국 공개특허 제2012-0123360호는 보통계 밀을 정성적 및 정량적으로 검출하는 방법을 개시하나, 지금까지 보통메밀과 쓴메밀을 구별하기 위한 분자 마커에 대한 기술은 전무한 실정이다. 이에, 본 발명자들은 상기한 메밀 가공품 내의 메밀종 혼입 여부를 판별하기 위해 보통메밀과 쓴메밀을 구별하기 위한 In/del 마커를 발명하기에 이르렀다.

대한민국 공개특허 제2012-0123360호

본 발명의 목적은 쓴메밀(Fagopyrum tartaricum)과 보통메밀(Fagopyrum esculentum)을 구별하기 위한 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 쓴메밀과 보통메밀을 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 쓴메밀과 보통메밀을 구별하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나 이상의 염기서열로 이루어진 쓴메밀(Fagopyrum tartaricum)과 보통메밀(Fagopyrum esculentum)을 구별하기 위한 마커를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어, “쓴메밀”은 “보통메밀”(학명: Fagopyrum esculentum)과 구별되는 것으로, 그 학명은 Fagopyrum tataricum 이다. 메밀의 종(species)에는 재배종과 야생종을 포함하여 20여종이 지구상에 분포하고 있다. 재배종에는 보통메밀(단메밀)과 쓴메밀 두 종이 주류를 이루고 있다. 우리나라에 도입되어 지금까지 재배 이용되는 것은 보통메밀(단메밀, sweet buckwheat)이며 보통메밀이라고 불리어지기도 한다. 반면 쓴메밀(bitter buckwheat)은 중국, 네팔 등지에 많이 자생하거나 재배되는 종으로서 달단종이라고도 한다. 학명은 Fagopyrum tartaricum이며 타타리메밀이라고도 한다.

본 발명의 구체예에서, 상기 마커는 In/del 마커일 수 있다. 용어 “In/del(Insertion Deletion) 마커”는 메밀 유전체에서 염기의 삽입 또는 결실이 일어난 부위를 말하며, 본 발명의 쓴메밀과 보통메밀을 구별하기 위한 분자 지표로 사용된다. 본 명세서에서 In/del 또는 Indel 로 혼용되어 사용될 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 쓴메밀의 엽록체 전체 유전자 염기서열 분석을 위하여 차세대염기서열분석(NGS, Next Generation Sequencing)를 수행하여 엽록체 유전자 지도를 완성하였다. 본 과정은 쓴메밀의 전체 게놈 DNA를 추출하고 엽록체 유전체를 어셈블리하여 콘틱(contig)을 작성하여 수행하였다. 어셈블리된 콘틱은 유전자은행에 보고된 보통메밀을 레퍼런스로 이용하여 유전자를 예측하고 구조를 결정지었다.

또한 본 발명은, 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16; 및 서열번호 17 및 18로 표시된 프라이머 세트로 이루어진 쓴메밀(Fagopyrum tartaricum)과 보통메밀(Fagopyrum esculentum)을 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다. 상기 프라이머 세트는 상기 In/del 마커를 증폭하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머를 포함할 수 있다. 보다 상세하게는, 상기 쓴메밀과 보통메밀을 구별하기 위한 프라이머 세트는 보통메밀과 쓴메밀 유전체의 삽입-결실 부위(In/del, Insertion and Deletion) 부위를 이용하여 보통메밀과 쓴메밀을 구별할 수 있는 프라이머 세트를 의미하며, 바람직하게는 보통메밀과 쓴메밀을 구별할 수 있도록 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도 (complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 발명의 상기 In/del(insertion deletion) 마커 및 상기 마커를 증폭하기를 위한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하는 경우, 다형화 현상을 나타나게 함으로써 고밀도 유전자지도 제작에는 충분하지 않은 SSR 마커의 단점을 보완하면서 보통메밀과 쓴메밀을 쉽게 구별할 수 있는 장점을 갖는다.

또한 본 발명은,

i) 대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; ii) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제2항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및 iii) 상기 ii) 단계의 증폭된 PCR 산물을 동정하는 단계;를 포함하는, 쓴메밀과 보통메밀을 구별하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명의 상기 방법은 iv) 상기 동정 산물을 분석하여, 상기 대상 시료에 쓴메밀과 보통메밀이 단독으로 존재하는지 또는 혼입하여 존재하는지 여부를 분석하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 방법을 이용하는 경우, 쓴메밀과 보통메밀을 구별할 수 있으며, 구체적으로 식품원료 혹은 가공식품 등에 포함된 보통메밀 및 쓴메밀을 특이적으로 정성적으로 검출할 수 있다. 또한 본 발명의 상기 방법은 대상 시료에서 상기 보통메밀 및 쓴메밀이단독 또는 혼입 존재하는지 여부를 검출할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 방법은 대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 본 발명의 구체예에서, 상기 대상시료는 쓴메밀과 보통메밀의 단독 또는 혼재 여부를 분석하기 위한 대상 시료일 수 있으며, 바람직하게는 쓴메밀과 보통메밀의 단독 또는 혼재 여부를 분석하기 위한 식품일 수 있으며, 가장 바람직하게는 쓴메밀과 보통메밀의 단독 또는 혼재 여부를 분석하기 위한 메밀 가공품일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어, “메밀 가공품”은 메밀을 원료로 하여 가공한 식품을 모두 포함하며, 바람직하게는 쓴메밀 및/또는 보통메밀을 원료로 한 가공품을 모두 포함한다.

상기 방법에서 게놈 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 (Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기한 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 인삼에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머 세트 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함한다.

상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시　32P 또는　35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 동정하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 동정은 In/del 마커의 경우에는 증폭 산물을 겔 전기영동함으로써 수행될 수 있다. 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다.

또한 본 발명은, 본 발명의 프라이머를 포함하는 쓴메밀과 보통메밀을 구별하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 및 필요에 따라 제한효소를 포함할 수 있으며, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 내열성 DNA 중합효소, dNTPs, 및 버퍼를 포함할 수 있다. 상기 dNTP 혼합물은 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, 내열성 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소, Tth DNA 중합효소 등 시판되는 내열성 중합효소를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 쓴메밀과 보통메밀을 구별하기 위한 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16; 및 서열번호 17 및 18로 표시된 프라이머 세트;를 포함할 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 본 발명의 프라이머 및 상기 방법을 이용하여 PCR을 수행함으로써 쓴메밀과 보통메밀종에 특이적인 밴드가 검출되는 것을 확인함으로써 두 가지 메밀을 동시에 구별할 수 있었다. 뿐만 아니라, 국내에서 시판중인 쓴메밀 가공품인 메밀국수와 메밀차를 대상 시료로 하여 본 발명의 PCR 방법을 사용함으로써 상기 가공품에서 보통메밀과 쓴메밀이 혼합되어 있는지 여부를 정성적으로 분석할 수 있었다.

본 발명의 마커, 프라이머 및 보통메밀과 쓴메밀을 구별하는 방법을 활용하는 경우, 주요 메밀 가공품에 함유된 보통메밀과 쓴메밀의 종류 및 혼입률을 확인할 수 있다. 따라서 생산자가 비의도적인 메밀의 혼입을 사전에 방지할 수 있어 소비자에게 제품의 신뢰도를 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 생산자의 메밀 가공품에 대한 QC(quality control)가 가능하다.

도 1은 본 발명의 구체예에 따른 차세대염기서열분석(NGS)를 이용해 쓴메밀의 엽록체 유전자 염기서열을 분석 방법에 대한 모식도를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 구체예에 따른 NGS를 이용한 쓴메밀의 콘틱(contig) 작성 결과를 나타낸다. NGS 데이터를 이용하여 assembly 결과 4개의 contig로 구분되었으며 전체 159,597bp로 구성되었음을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 구체예에 따른 쓴메밀의 엽록체 유전자 지도 및 보통메밀 엽록체 유전체와의 Indel 마커 6개 지역을 나타낸다 (filled triangle로 마커지역 표시, 1번부터 8번).
도 4는 본 발명의 구체예에 따른 쓴메밀과 보통메밀을 구별하기 위한 엽록체 게놈상의 DNA 마커를 증폭하기 위한 프라이머를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 구체예에 따른 6종의 Indel 마커와 PCR 방법을 이용해 쓴메밀과 보통메밀의 구별한 전기영동 결과를 나타낸다(1~6: Indel 마커; M: 100bp DNA 마커; T: 쓴메밀; C: 보통메밀).
도 6은 본 발명의 구체예에 따라 Indel-06(서열번호 6) 마커를 증폭하기 위한 프라이머 세트 및 PCR을 이용해 75점의 쓴메밀 유전자원과 24점의 보통메밀 유전자원을 구별한 전기영동 결과를 나타낸다(M: 100bp DNA ladder, Lane 1 to 75:쓴메밀, Lane 76 to 96: 보통메밀).
도 7은 본 발명의 구체예에 따른 Indel-06(서열번호 6) 마커를 증폭하기 위한 프라이머 세트 및 PCR을 이용해 쓴메밀 및 보통메밀 DNA의 검출 한계를 설정한 전기영동 결과이다(M: 100bp DNA 마커; 좌측부터 레인 1: 20ng/u; 레인 2: 10ng/ul; 레인 3: 5ng/ul; 레인 4: 1ng/ul;레인 5: 500pg/ul; 레인 6: 250pg/ul; 레인 7: 100pg/ul; 레인 8: 10pg/ul).
도 8은 본 발명의 구체예에 따른 Indel-06(서열번호 6) 마커를 증폭하기 위한 프라이머 세트 및 PCR을 이용해 가공품에서 쓴메밀 및 보통메밀을 구별한 전기영동 결과이다(M: 100bp DNA 마커; T: 쓴메밀; C: 보통메밀; A~F: 메밀차 시료).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 쓴메밀 및 보통메밀의 유전자원 및 genomic DNA 추출

실험을 위하여 사용한 쓴메밀 및 보통메밀은 농촌진흥청 국립식량과학원 고령지농업연구센터에서 수집, 유지 및 증식중인 쓴메밀 75점과 보통메밀 24점을 사용하였다 (표 1). 또한 쓴메밀의 엽록체 유전자 분석을 위한 재료는 고령지농업연구센터에서 육종한 대관 3-3호를 이용하였다. 엽록체 DNA 추출은 Macherey-Nagel(MN) 회사의 NucleoSpin Plant II kit를 이용하였다.

쓴메밀의 유전자원 번호 및 원산지

No.	Accession No.z	Originy	No.	Accession No.z	Originy	No.	Accession No.z	Originy
1	K703229	RUS	26	K126457	CHN	51	K126497	BTN
2	K035548	CHN	27	K126458	CHN	52	K126498	BTN
3	K119867	JPN	28	K126459	CHN	53	K126499	BTN
4	K126427	CHN	29	K126460	CHN	54	K141188	CHN
5	K126428	CHN	30	K126461	CHN	55	K141189	CHN
6	K126429	CHN	31	K126462	CHN	56	K141190	CHN
7	K126430	CHN	32	K126463	CHN	57	K141191	CHN
8	K126431	CHN	33	K126464	CHN	58	K141192	CHN
9	K126432	CHN	34	K126465	CHN	59	K141193	CHN
10	K126434	CHN	35	K126466	CHN	60	K141194	CHN
11	K126435	CHN	36	K126467	CHN	61	K141195	CHN
12	K126436	CHN	37	K126470	CHN	62	K141196	CHN
13	K126437	CHN	38	K126472	CHN	63	K141197	CHN
14	K126438	CHN	39	K126475	CHN	64	K141198	CHN
15	K126439	CHN	40	K126476	CHN	65	K141199	CHN
16	K126442	CHN	41	K126478	PAK	66	K141200	CHN
17	K126445	CHN	42	K126479	PAK	67	K141229	CHN
18	K126447	CHN	43	K126480	PAK	68	TJ	CHN
19	K126448	CHN	44	K126481	PAK	69	M1	CHN
20	K126449	CHN	45	K126482	PAK	70	M2	CHN
21	K126450	CHN	46	K126491	NPL	71	M3	CHN
22	K126452	CHN	47	K126492	NPL	72	T8	JPN
23	K126453	CHN	48	K126494	NPL	73	T10	JPN
24	K126454	CHN	49	K126495	NPL	74	SA	CHN
25	K126455	CHN	50	K126496	BTN	75	YS	CHN

y; 쓴메밀 생식질은 농촌진흥청 유전자 은행에서 수집 및 동정되었고, 식별 번호가 K-번호로 할당되었으며, 쓴메밀 생식질은 68 ~ 75가 수집되어 하이랜드 농업 연구 센터에서 수집되어 유지되었음.

z; RUS (러시아), CHN (중국), JPN (일본), PAK (파키스탄), NPL (네팔), BTN (부탄)

실시예 2: 쓴메밀 및 보통메밀 구별용 프라이머 선발을 위한 엽록체 유전체 분석

쓴메밀의 엽록체 전체 유전자 염기서열 분석을 위하여 차세대염기서열분석(NGS, Next Generation Sequencing)를 수행하여 엽록체 유전자 지도를 완성하였다. 본 과정은 쓴메밀의 total genomic DNA를 추출하고 Illumina Hiseq용 library를 구축하였다. 구축된 library는 Illumina Highseq을 이용하여 시퀀싱 후 평균 read length 100bp이상, Q-score 20이상을 대상으로 엽록체 유전체를 assembly하여 contig를 작성하였다. Assembly된 contig는 유전자은행에 보고된 보통메밀을 reference로 이용하여 유전자를 예측하고 구조를 결정지었다. (도 1 및 2).

실시예 3: 쓴메밀 및 보통메밀 구별용 프라이머 디자인 및 마커 선발

유전자은행(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에 등록된 보통메밀의 엽록체 염기서열 (EU254477)과 본 발명에서 새롭게 밝혀진 쓴메밀의 엽록체 유전자와 비교하였다. 보통메밀은 159,599bp로 구성된 반면 쓴메밀은 159,222bp로 377bp의 차이가 있음을 알 수 있었다. 또한 두 종간의 엽록체 유전체 분석결과 50bp이상의 In/del이 8개 존재함을 발견하였다(도 3). 8개의 In/del 부위는 주로 유전자 사이의 부위(inter-genic region)으로 62bp부터 173bp까지로 나타났다 (표 2). 이들 8개의 In/del 중 쓴메밀과 보통메밀을 구분하기 위하여 염기서열을 비교한 후 (표 3) 6개의 지역을 증폭할 수 있는 프라이머를 제작하였다 (표 4 및 도 4).

쓴메밀과 보통메밀의 In / del 정보

No.	Species	Position		Size(bp)	Region
		start	end
In/del_1	F. esculentum	8136	8309	173	IGS: trn_S, trn_G
In/del_2	F. tataricum	27077	27170	93	IGS: rpoB, trn_C
In/del_3	F. esculentum	29628	29742	114	IGS: psbM, trn_D
In/del_4	F. tataricum	51632	51740	108	IGS: ndhC, trn_V
In/del_5	F. esculentum	55471	55646	175	IGS: atpB, rbcL
In/del_6	F. esculentum	67160	67311	151	IGS: trn_P, psaJ
In/del_7	F. tataricum	110770	110832	62	CDS: ycf1
In/del_8	F. tataricum	132859	132921	62	CDS: ycf1

이하 표는 쓴메밀과 보통메밀 In/del 지역의 유전자 염기서열을 나타낸다. (In/del 지역은 이탤릭체 및 볼드체로 표시; 프라이머 서열은 볼드체와 밑줄로 표시)

상기 표 3은 쓴메밀과 보통메밀 엽록체 게놈상의 DNA 마커를 증폭하기 위한 프라이머 정보를 나타낸다.

상기 표에서,

Indel_1 마커 증폭용 프라이머 서열: 정방향 프라이머(서열번호 7),역방향 프라이머(서열번호 8);

Indel_2 마커 증폭용 프라이머 서열: 정방향 프라이머(서열번호 9),역방향 프라이머(서열번호 10);

Indel_3 마커 증폭용 프라이머 서열: 정방향 프라이머(서열번호 11),역방향 프라이머(서열번호 12);

Indel_4 마커 증폭용 프라이머 서열: 정방향 프라이머(서열번호 13),역방향 프라이머(서열번호 14);

Indel_5 마커 증폭용 프라이머 서열: 정방향 프라이머(서열번호 15),역방향 프라이머(서열번호 16);

Indel_6 마커 증폭용 프라이머 서열: 정방향 프라이머(서열번호 17),역방향 프라이머(서열번호 18)이다.

실시예 4: 본 발명의 마커를 이용한 쓴메밀과 보통메밀의 구별

총 6개의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였다. 본 발명의 PCR 방법으로 아가로스 겔상에서 PCR 밴드의 차이만으로 쓴메밀과 보통메밀을 구분할 수 있었다. PCR 조건은 다음과 같다: 예비변성 95℃ 5분, 2) 35 사이클 (변성 95℃ 30초, 어닐링 55℃, 연장 72℃ 1분), 3) 최종 연장 72℃ 10분. PCR 조건은 쓴메밀과 보통메밀 DNA 20ng/ul 의 농도를 2ul, 10pmol의 forward와 reverse 프라이머를 각각 0.5ul씩 첨가 후 멸균수 17ul를 첨가하여 전체 반응 용액이 20ul가 되도록 조절하여 바이오니어에서 판매되는 AccuPower PCR premix (Bioneer, K-2016) 시약을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 후 1.8% 아가로스 젤상에서 전기영동 결과(도 5) 본 발명의 상기 프라이머가 쓴메밀과 보통메밀 특이 밴드를 증폭함을 알 수 있었다. 6 개의 마커 중 재현성이 뛰어난 In/del-6 마커를 이용하여 쓴메밀 75점과 보통메밀 24점에 대한 PCR 수행 결과 모두 쓴메밀과 보통메밀 특이 밴드를 확인 할 수 있었다(도 6).

실시예 5: 본 발명의 마커를 이용한 쓴메밀과 보통메밀의 검출 한계 설정

본 발명의 마커를 이용하여 보통메밀과 쓴메밀 두 종의 DNA를 이용하여 두 가지 종에 특이적 밴드 검출을 확인하였다. 보통메밀과 쓴메밀의 각 DNA 농도를 20ng/ul, 10ng/ul, 5ng/ul, 1ng/ul, 500pg/ul, 250pg/ul, 100pg/ul, 10pg/ul의 조절하여 In/del-6 마커 증폭용 프라이머 세트(서열번호 17 및 서열번호 18)를 이용하여 PCR을 수행하였다(도 7). PCR후 전기영동 결과 본 발명의 프라이머를 이용할 경우 10pg/ul까지도 검출이 가능함을 알 수 있어 미량이 포함된 시료에서도 활용이 가능함을 알 수 있었다.

실시예 6: 본 발명의 마커를 이용한 메밀 가공품에서의 쓴메밀과 보통메밀 구분

본 발명의 마커를 이용하여 메밀 가공품에 대한 활용성을 검토하고자 국내에서 시판중인 쓴메밀 가공품인 메밀국수 2종과 쓴메밀차 6종을 구매한 후 Macherey-Nagel(MN) 회사의 NucleoSpin Food kit를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출 후 20ng/ul로 정량 후 상기의 PCR 조건과 In/del-6 마커 증폭용 프라이머 세트(서열번호 17 및 서열번호 18)를 이용하여 PCR 수행 한 결과 보통메밀로 만든 국수(A)와 쓴메밀 100%로 만든 국수(B)를 확인 할 수 있었다. 또한 쓴메밀차 6종 중 1종(차 F)은 보통메밀과 쓴메밀이 혼합되어 있음을 알 수 있었다(도 8).

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 이 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> REPUBLIC OF KOREA <120> MARKER FOR DISCRIMINATION OF FAGOPYRUM TATARICUM AND FAGOPYRUM ESCULENTUM USING CHLOROPLAST SEQUENCE AND DETECTING METHOD <130> P14R12D0406 <160> 30 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 173 <212> DNA <213> Fagopyrum esculentum <400> 1 tttttagaac tatattaaga ctatagctac taataattaa gaaaggatct tatattttag 60 gcaagtattc ttctttcgtt ttattagact atctactcta gaaataaaaa aaagtacttg 120 ttagtttttt tattaaagca agaacaaaaa aaggaatgtt tctaatcttt cga 173 <210> 2 <211> 94 <212> DNA <213> Fagopyrum tartaricum <400> 2 tttccctttt caatcgaaag gataggcgaa gtttttcggt attgtctatt ttgcgatacc 60 atagaatcaa tcgaaggagt ggatctaatc aaaa 94 <210> 3 <211> 115 <212> DNA <213> Fagopyrum esculentum <400> 3 gagaactcaa aactcctatt tttttgtaag aaaaagaaaa gtgtgaaaaa gaaaaattcc 60 ggctaataaa gaaaacaatt attcattacc tcactaagaa taaggctaaa ggggg 115 <210> 4 <211> 125 <212> DNA <213> Fagopyrum tartaricum <400> 4 tacatagaat caataaacca gtcttctttt ttttgtcgtg atttatagtg attggatatg 60 aaaagaaaaa ctacttgttt tgttctttgc taggttaagg tataccacga gaaacaaaag 120 tctat 125 <210> 5 <211> 176 <212> DNA <213> Fagopyrum esculentum <400> 5 tcaatgagtg agttcaatca atcgattttc aaaatataaa gtcaatgaac aaaaattttg 60 ataaagtctt ttatttgtcg attattatcg acaatcccat atatattatc gacggaattc 120 gaagctgaac tctaacttct atttaattta tggttcttat ttcgtttcta tcgcat 176 <210> 6 <211> 153 <212> DNA <213> Fagopyrum esculentum <400> 6 ttttttccta ttatgtatta ttatgtatta taagtaaaat gttggtagta gtagtagtag 60 gttattagta ccttacggct ggtaaagtta acaaaggctt tttagggtta tgctctagat 120 taggaatata gtatgcatct ttttcccttt ttt 153 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Fagopyrum esculentum <400> 7 tcaaaattag aaatacctat cgaaaaa 27 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Fagopyrum esculentum <400> 8 cgttaaattt cgttgttcga ca 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Fagopyrum tartaricum <400> 9 tttctgcctt aacccccttt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Fagopyrum tartaricum <400> 10 gagaagaccg gaaatccctc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Fagopyrum esculentum <400> 11 cctaccgtct tccttggaca 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Fagopyrum esculentum <400> 12 attgtgcctc ttttgccaga 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Fagopyrum tartaricum <400> 13 cgaatcaccc agtttcgttt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Fagopyrum tartaricum <400> 14 ttttaggctt cggctctgaa 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Fagopyrum esculentum <400> 15 tgccagttag cattggattt c 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Fagopyrum esculentum <400> 16 ttgatgagtt gtagggaggg a 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Fagopyrum esculentum <400> 17 acccgctgac attttgtacc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Fagopyrum esculentum <400> 18 ctaatcccct gccctttctc 20 <210> 19 <211> 824 <212> DNA <213> Fagopyrum tartaricum <400> 19 ctattgaaaa cggaaaaaag taattccaaa aaatattttt tttctatttt ttttaggttt 60 tcaatatata taatatatat aataataatt tcaattagaa attctttact taatattatt 120 tatatttaat ttataaatat ataattttat attaagaatt ttatacatta ttatagtaat 180 aagtataata taataataaa catcatatat tagtataaac ataatataga aaaaatgtat 240 acaaatataa tatctaaatt agaaatacct attgaaaaaa atacatacaa taaagatatg 300 aaatcttaaa ttaagttaaa taaaaaagaa taataaatcg aaaaaataga aatacataca 360 agatatacta caaggtttat caaaaattct aactcaacta aggattcaat aacaagaaaa 420 atttaatcaa tccatataaa taaaaccata aatacttctc ctgaaaggcc ttatattccc 480 atggcccggc ctggtcaata cctcgccggg cctttttttt tttagttcaa cggatccgag 540 ctagaaaatt cattagatta tagaatccgt ttttgtttaa gaaaactata ggttcttgca 600 caattcgtat taggccttta gctattttgt tgaaacgtat ccgtcaaaac tctccactaa 660 aaatcgaact tcgtgcttag ttatttcaat ctcttttctg agtctcctcc ttacgaaaaa 720 gcccaatact ctccgtttta atgattattt tatgatccta tcttgattac gttaaatttc 780 ggtgttcgac aaaagttaca tttcgataca ataatcgaaa tgga 824 <210> 20 <211> 962 <212> DNA <213> Fagopyrum esculentum <400> 20 ctaacatatt tttttttagg ttttcaatat atataataat aaaaattcaa ttagaaattc 60 tttacttaat attatttata ttaaatttat aactatatag ataattttat attaagaatt 120 taatactata ttattattat agtaataagt ataatataat aataaacatc atatattagt 180 ataaacataa tatagaaaaa atgtatacaa atataatatc aaaattagaa atacctatcg 240 aaaaaaatgc atacaataaa tatatgaaat cttaaattaa gttaaataaa aaagaataat 300 aaatcgaaaa aatagaaatc catacaagat atactacata tactacaagg tttatcaaaa 360 attctaagga ttcaataaca cgaaaaattg aatcaatcca tagaaataaa accataaata 420 cttctcctga aaggccttat attcccatgg cccggcctag tcaatacctc gccgggcctt 480 tttttttagt tcaacggatc cgagctagaa aattgattac atttttttag aactatatta 540 agactatagc tactaataat taagaaagga tcttatattt taggcaagta ttcttctttc 600 gttttattag actatctact ctagaaataa aaaaaagtac ttgttagttt ttttattaaa 660 gcaagaacaa aaaaaggaat gtttctaatc tttcgatata gaatccattt ttgtttaaga 720 aaaccatagg ttcttgcaca attcgtatta ggcctttagc tattttgttg aaacgtatcc 780 gtcaaaactc tccactacaa atcgaacgtc gtgcttagtt atttcaatct cttttctgag 840 tctcctcctt acgaaaaagc ccaatactct cagttttcat gattatttta tgatcctatc 900 ttgattacgt taaatttcgt tgttcgacaa aagttacatt tcgatacaat aatcgaaatg 960 ga 962 <210> 21 <211> 1368 <212> DNA <213> Fagopyrum tartaricum <400> 21 ttgaaaaaat ttcccattta tagaaaaatc ccattattcg cgcattcttc atcgaatcca 60 atcctataga tcgacccaac gccgatggaa tttatattct gtttactgaa tcacataaaa 120 ttttacccaa ttccatatcc gagatgtcca tatggggaaa gtatgaaaga tgtatgaccg 180 ggggaataga gaaaattttc tactcaagta aaatttttga attgaatttg taagagaaga 240 gatgaaagga attgataaaa cattcttgga accaagattt tgctgcttag atttatgggc 300 tttactatat cagaacaaaa gtgattcaat tactactaac tactattata atgtataatg 360 atattacgta ttccaatcga ttggatacca gaaaaatcaa cgaattcata attttatctg 420 ttcgtcgata caacgttgat tttttctgcc ttaaccccct ttgggatttt tttgtaaaaa 480 aaaaagattt gctgagcaaa gaaagagaaa ctttgaccga ttctcttatt attactagaa 540 ttttaaaaat aggtttggga agcgggtggg ttgtatttat taaacatgta tagctatctt 600 ctatatatcc gtctccccag ttagattcga ggcagcacgg gcggtgttct atccaaattt 660 atactttttt cgtcaatcaa ttcaatgaaa aatttaagta cgatattttc tgacaattcc 720 ctacgagcat catatatttt agattatatt tgaatatccg attctctgtc tgggtaagtt 780 ctgttctggt tccggggttt cctttcccta cataaatctt tttttatata ttattttgtt 840 ataatatcta attatatata atctaattga aattaagaaa gattttttga ttgaaaagaa 900 tcaataataa ttagttatta tttcgacttt cttataccat taggtaaaca aaatggaaga 960 tacaaatcga agactcatta atgaattcgc agtcaagtca caagccgatg gttaatggtt 1020 caaaatgctt atgcattttt tggggggaag gaaaatccgc atttcccttt tcaatcgaaa 1080 ggataggcga agtttttcgg tattgtctat tttgcgatac catagaatca atcgaaggag 1140 tggatctaat caaaaagggg aatggtttct tttggttaag gcaaacgaga ttaaagatgc 1200 aagtaaaaaa aaaagaagtt cagtaatcca ccccaaacaa aaaaggggtt aatattgtca 1260 tctatttttg gggggcgaca tggccgagcg gtaaggcgga ggactgcaaa tccttttttc 1320 cccggttcaa atctgggtgt cgcctgaaga gaagaccgga aatccctc 1368 <210> 22 <211> 1271 <212> DNA <213> Fagopyrum esculentum <400> 22 ttgacaaaat ttcccattta tagaaaaatc ccattattcg cgcattcttc atcgaatcca 60 atcctataga tcgacccaac gccgatggaa tttatattct gtttactgaa tcacataaaa 120 ttttacccaa ttccatatca gagatgtcca tatggggaaa gtatgaaata tgtatgacca 180 ggggaataga gaaaattttc tactcaagta aaatttcgga attgaatttg taagagaaga 240 gatgaaagga attgataaaa cattcttgga accaaaattc tgctgcttag atttatgggc 300 tttactatat cagaacaaaa gtgattcaat tactactaac tactattata atgtataatg 360 atattacgta ttccaatcga ttggatacca gaaaaatcaa cgaattcata attttatctg 420 ttcgtcgaga caacgttgat tttttctgcc ttaacccctt tggcattttt ttgtaaaaaa 480 aagatttgcc gagaaaagaa agagaaactt tgaccgattc tcttattatt actagaattt 540 taaaaatagg tttgggaagc gggtgggttg tatttattaa acatgtatag ctatcttctc 600 tatatccgtc tccccagtta gattcggggc agcacgggcg gtgttctatc caaatttaga 660 cttttttcgt caatcaattc aatgaaaaat tgaagtacga tattttttga caattcccta 720 cgagcatcat atattttaga ttctatttga atatccgatt ctctggctgg gtaagttctg 780 ttctggttcc ggggtttcct ttccctacat aaatatttat atatatatta ttttgttatt 840 tgttataata tataattata tatataatct aattgaaatt aagaaaaatg gaaattccga 900 aagatttttt tattgaaaag aatcaataat aattagttat tatttcgact ttcttagacc 960 cttagggaaa caaaatggaa gatacaaatc gaagaatcct taatgaattc gccgtcaagt 1020 cccaagccaa tggttaatgg ttcaaaatgc ttatgaattt tggggggaag gaaaatcccc 1080 aaggggaatg gtttcttttg gttaaggcaa acgggattaa agatgcaagt aaaaaaaaaa 1140 gaagttaagt aatccacccc aaacaaaaag ggggttacta ttgtcatcta ttttgggggg 1200 gcgacatggc cgagcggtaa ggcggaggac tgcaaatcct tttttcccgg gttcaaatct 1260 gggtgtcgcc t 1271 <210> 23 <211> 881 <212> DNA <213> Fagopyrum tartaricum <400> 23 aatctaattg gtttttacgt cacaataact cgggatttaa tcccatagag ataatcaaac 60 tttcccctgt aaattcaata ttatgaataa caatatctgg gctatcaaaa aacttcgccg 120 tcgcgaattg aatagtataa catagtaaga tcctttatcc atactcaata caaaatggaa 180 ttcgtaatcg aatcaataac tcgttttatt tattattctt ttacattctt tctacaacct 240 accgtcttcc ttggacaatc atcggatgaa gtctcatctg accgttttac acgtacgttg 300 tattgataac aaaccccaca aaaataacaa caagagaagt aaaacgaaag ggggtggttg 360 tttgatcttt attttcttaa tattatcttt tcttggattt agtactagta tatatgaaaa 420 gaaaagttcg gtgtaaaatt tgaatgagat agattttttc aaaggagtta atttgagtca 480 ttgagactac ataaaatcgg aaaaggagag agttttaatc tgaaaagtat ttttcggggt 540 aacccgcatt ccatttttta ctgtacaaga aaaaaatgat agttgtgtac atgttcccga 600 gaaacacatg atactctatt ccattagata gagtcaataa attgaaagac cagatccagt 660 atgctatccc ttggaatcct gaataggatg ttcccaataa ttggactaat ccaattatat 720 ctctctccca ccaatcggta ctagttgaag taattaaaat ttatatatat atttatttgt 780 gtttgatgag aaataacgaa aaaatcccga tattgtgcct cttgcctctt ttgccagaaa 840 ataaaaatgg agagatgagt tgatgtattt attggatccg t 881 <210> 24 <211> 990 <212> DNA <213> Fagopyrum esculentum <400> 24 aatctaagtg gtttttacgt cacaataact cgggatttaa tcccatagag ataataaaac 60 tttcccctgt aaattcaata ttatgaataa caatatctgg gctatcaaaa aacttcgccg 120 tcgcgaattg aatagtataa catagtaaga tcctttatcc atactcaata caaaatggaa 180 ttcataatcg aatcaagaac tcgttttatt tattattctt ttacattctt tctacaacct 240 accgtcttcc ttggacaatc atcggatgaa gtctcatctg cccgttttac acttacgttg 300 tattgataac aaaccccaca aaaataacaa caagagaagt aaaacgaaag gggggagaac 360 tcaaaactcc tatttttttg taagaaaaag aaaagtgtga aaaagaaaaa ttccggctaa 420 taaagaaaac aattattcat tacctcacta agaataaggc taaagggggt ggttgtttga 480 tctttcttgt attaatatta tcttttcttg gatttagcac taatatctat gaaaagaaaa 540 gttcggtgta aaatttgaat gagatagatt ttttcaaagg agttaatttg agtcattgag 600 actacacaaa atcggaaaag gagagagttt taatcggaaa agtatttttc ggggtaaccc 660 acattccatt ttttactgta caagaaaaaa atgatagttg tgtacatgtt cccgagaaac 720 atatgatact ctattccatt agatagaggc aataaattga aagacccgat ccagtatgct 780 atcccttgga atgctgaata gggatgttcc caataattgg attcatccaa ttctatctct 840 atcccaccaa tcggtactag ttgaagtaat tacaatttat atatatattt atttgtgttt 900 gatgagaaat aacgaaaaaa tcccgatatt gtgcctcttt tgccagaaaa agaaaatgga 960 gagatgagtt gatgtattta ttggatccgt 990 <210> 25 <211> 970 <212> DNA <213> Fagopyrum tartaricum <400> 25 agacgcactc ctatgaatgt ggaaaatata acgaattaga cgatttgact tggaattgtc 60 aagtcatcca taactgtttc gtcaaaacaa caattcattt tgaccgaatc acccagtttc 120 gtttgtttaa cgcgagacat atatcctttc acgattcatt ggctggaatc ttcttttcct 180 tacacctagc ttacttagtt aagttatata actatttcaa ataaaataac aaataagtaa 240 actaataata atagagattg ctcttatcgt atattataca tatccacaaa atagatatac 300 aaagaaaacg ttctcgcttt caccgcgctt cctattttat ctaacaaaag ggaatgggaa 360 atctaattct ttttttttag tatatttttt atttgaattt atcttatgaa tacatagaat 420 caataaacca gtcttctttt ttttgtcgtg atttatagtg attggatatg aaaagaaaaa 480 ctacttgttt tgttctttgc taggttaagg tataccacga gaaacaaaag tctatttcac 540 aacgttggaa attaaattga ctaaagatct ttttcaagat ctcgcttgtc cacttaagta 600 gtacgttccg agatcaatat taccaaagtg agcttgctcg ttcagccatg attttgactc 660 caaaaattaa ctcggattac ctagtgaaaa ggggattctc aataattgat tggggatcga 720 aaagcgaaaa agtcacatgg cattcgccta cgaagattaa tggataaaaa tgggtttgtt 780 tatctgaaat tctaaaaatc ccaattggat ccctttaaat gtgcttttgt tttctgtttt 840 aggcttcggc tctgaacgat cctggggagc aagcttctgg taatcatttt tttttttttt 900 agatgaatcg cccggccatt taaaataaca aacaatacgg gggaaattcc aattttcatc 960 gagaaaattc 970 <210> 26 <211> 832 <212> DNA <213> Fagopyrum esculentum <400> 26 agatgcactc ctatgaatgt ggaaaatata acgaattaga cgattttact tggaattgtc 60 aagtcatcca taactgtttc gtcaaaacaa caattcattt tgaccgaatc ccccagtttc 120 gtttgtttaa cgcgagacat atatcctttc acgattcatt ggctggaatc taattttcct 180 tttcaaataa aataacaaag aagtaaacta ataataatag agattgctct tatcgtatat 240 tatacatata cacaaaatag atatacaaat aaagcgttct cgctttcacc gcgcttccta 300 ttttctctaa taaaagggaa tgggaaatcg aattcttttt tttttgagta tattttttat 360 tttaatttat ctcacgagaa acaaaagtat atttcacaac gttgacaacg tttcaaatga 420 aattgactaa agatcttttt caagatctcg cttgtccact taagtagtac gttccgagat 480 caatattacc aaagtgagct tgctcgttca gccatgattt tgactccaaa aatgcactcg 540 gattacctag tgaaaagggg gattctcaat aattgattgg ggatcgaaaa gcgaaaaagt 600 cacatggcat ttgcctacga agattaatgg ataaaaatgg gtttgtttat ccgaaattct 660 aaaaatccca attggatccc tttaaatgcg cttttgtttt ctgttttagg cttcggctct 720 gaacgatcct ggagagcaag cttctggtaa tcattttttt ttcgatgaat cgcccggcca 780 tttaaaataa caaacaatac gggggaaatt ccaattttca tctagaaaat ta 832 <210> 27 <211> 617 <212> DNA <213> Fagopyrum tartaricum <400> 27 aattataaag taataaagta aaaataatat tatatattta tattattttt tgcgaaaatg 60 aaaaaaaaaa gaaatgtccg ataacaagtt gatcggttaa ttcactacga aatgccagtt 120 agcattcgat tttgttggga tcagacaacc gaattcaatt gtttacttat tccttctttt 180 ttgtagtttt ttgattcaat tcggccctta ttttgttttt 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catatttctc gcctattctt 420 tttttttctg ccttatttat accctttcgt ctatgaattc cgcatatttt cacagctagg 480 atttacatat ttacatatac acgatatagt gctgtcaaga gtgctgtttt ttgattagtg 540 atttagtcaa ttcaaaaaag gttaagacat tataaacttg aaaaagaaag gttgggttgc 600 gccacatata ggaaagagta tacaataatg atgtatttgg cgaatcaaat actatggtct 660 aataacgaac cctttgaatt tgttgataat tttatgaaag attcctgtaa aaggtttaat 720 taacgcctaa ttcatgtcga gtagaccttg ttgttgtgag aattagtaat tgatgagttg 780 tagggaggga ctt 793 <210> 29 <211> 587 <212> DNA <213> Fagopyrum tartaricum <400> 29 tagggatgac aggatttgaa cccgtgacat tttgtaccca aaacaaacgc gctaccaagc 60 tgcgctacat ccctttttat aggtttacag tattattgta aataatcctt ttcttttttt 120 ccacatgatt atttctcata tttagataca cactagatct tgccattttt ccttttttta 180 agttaaacaa attataaaat aaaggtcgaa aatctgatcg accggattgt tgtacatttt 240 tatttgttta agaaatttca tgtacaaata caagtggtta aaaaaaaata catatgcatc 300 tgattatcta ttctatatgt catattctta tgtgttataa tatataaata aagaaaaaaa 360 aagaaggagg attttccatg cgaaatctaa aaacatatct ctccgtggca cccgtactaa 420 gtactttatg gttcggatct ttagcaggtc tattgataga aatcaatcgt tttttcccgg 480 acgctttaac attccccttt ttttcattct agttattgac atggtaaggg ggtaacgaag 540 attagagata ggacccacaa tccgtgacta atcccctgcc ctttctc 587 <210> 30 <211> 737 <212> DNA <213> Fagopyrum esculentum <400> 30 tagggatgac aggatttgaa cccgctgaca ttttgtaccc aaaacaaacg cgctaccaag 60 ctgcgctaca tcccttttta taggtttaca gtattattta taataatact tttttttcac 120 atcattattt agaatattta gatacacact agatcttgcc attttttctt tttttttttt 180 tcctattatg tattattatg tattataagt aaaatgttgg tagtagtagt agtaggttat 240 tagtacctta cggctggtaa agttaacaaa ggctttttag ggttatgctc tagattagga 300 atatagtatg catctttttc ccttttttaa gttaaaccaa ttataaaata aaggtataaa 360 atctgatcga ccggattgtt gtacattttt atttgtttaa gaaatttcat gtacaaatac 420 aagtggttaa aaaaaaaatg catatgcatc tgattatcta ttatatatgt catattctta 480 tgtgttataa tatataatta aagaaaaaaa aagaaggagg attttccatg cgaaatctaa 540 aaacatatct ctccgtggca cccgtgctaa gtactttatg gttcggatct ttagcaggtc 600 tattaataga aatcaatcgt tttttcccgg acgctttaac attccctttt ttttcattct 660 agttattgac atggtaaggg ggtaacgaag attagagata ggacccacaa tccgtgacta 720 atcccctgcc ctttctc 737

Claims (8)

1. 삭제
2. 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16; 및 서열번호 17 및 18로 표시된 프라이머 세트;로 이루어진 쓴메밀과 보통메밀을 구별하기 위한 프라이머 세트.
   
3. i) 대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   ii) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16; 그리고 서열번호 17 및 18로 표시된 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
   iii) 상기 ii) 단계의 증폭된 PCR 산물을 동정하는 단계;
   를 포함하는, 쓴메밀과 보통메밀을 구별하는 방법.
   
4. 제3항에 있어서,
   iv) 상기 동정 산물을 분석하여, 상기 대상 시료에 쓴메밀과 보통메밀이 단독으로 존재하는지 또는 혼입하여 존재하는지 여부를 분석하는 단계;를 추가로 포함하는 것인 방법.
   
5. 제3항에 있어서, 상기 대상 시료는 식품인 것인 방법.
   
6. 제3항에 있어서, 상기 대상 시료는 메밀 가공품인 것인 방법.
   
7. 제2항의 프라이머 세트를 포함하는 쓴메밀과 보통메밀을 구별하기 위한 키트.
   
8. 제2항의 프라이머 세트를 포함하는 쓴메밀과 보통메밀을 구별하기 위한 조성물.

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