KR101919605B1 - 인삼 속 5종의 엽록체 게놈 서열의 완전 해독 기반 종간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인삼 속 5종의 엽록체 게놈 서열의 완전 해독 기반 종간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 인삼 속 종간 구별용 InDel 마커, 및 상기 마커 증폭용 프라이머 세트를 이용하면 기존 방법들보다 저비용, 고효율로 인삼 속 주요 5종을 구별할 수 있다.

Description

인삼 속 5종의 엽록체 게놈 서열의 완전 해독 기반 종간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도{Marker derived from complete sequencing of chloroplast genome of five Panax species, primer set for discrimination of Panax species and uses thereof}

본 발명은 인삼 속 5종의 엽록체 게놈 서열의 완전 해독 기반 종간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.

고려인삼을 비롯한 미국삼, 전칠삼, 죽절삼, 베트남삼은 인삼 속(Panax)에 속하는 식물로 아시아 전역 및 북미 대륙에서 각 나라를 대표하는 약용작물로 널리 사용되어 왔다. 이들 인삼 속 식물들은 고가에 유통되기 때문에 위품 또는 다른 종과의 혼입 문제가 빈번히 일어나고 있으나, 뿌리 절편 또는 분말로 유통되는 약용 식물의 특성상 외형적인 특징으로 이를 구분하기가 매우 어렵다. 또한 이들은 생약뿐만 아니라 다양한 형태의 가공 과정을 거쳐서 유통되기 때문에 기존의 방법으로는 위·변조 및 혼입 여부를 판별하는 것이 불가능하다. 따라서 이를 위해 보다 체계적이고 과학적인 기술이 요구되고 있으며 이에 적합한 방법은 DNA 수준에서 종을 식별할 수 있는 분자 마커를 개발하는 것이다.

기존의 분자 마커를 이용한 식물 DNA 바코딩의 경우 엽록체 유전체에서 변이가 많다고 알려진 rbcL, matK, trnH-GUG-psbA와 같은 특정 유전자나 유전자간부위(intergenic region) 서열의 일부만을 대상으로 개발되어 왔다. 그러나 이들 지역을 증폭하기 위해서 사용되는 보편적인 바코딩 프라이머(universal barcoding primer)는 식물 종에 따라 PCR 증폭 효율이 떨어지거나 증폭이 되지 않는 문제점이 있으며, 증폭이 되었다 할지라도 염기서열의 다형성이 존재하지 않을 수 있는 문제점이 있다. 또한 이들 고변이 지역은 식물에 따라서는 동일한 종 내에서도 변이가 발견되는 경우가 있어 동일 종을 다른 종으로 구분할 수 있는 가능성을 내포하고 있다.

이에 본 발명에서는 엽록체 유전체의 일부 지역이 아닌 엽록체 전장 유전체 서열을 분석하여 인삼 속 주요 5종 간의 다형성이 높으면서도 보다 신뢰할 수 있는 변이 지역을 탐색하고자 하였다.

한편, 한국등록특허 제1426466호에는 '고려인삼 엽록체 지놈 완전 해독기반 품종 및 종 간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이를 포함하는 키트'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2017-0068093호에는 '방풍, 식방풍 및 해방풍의 엽록체 게놈 및 핵 리보솜 DNA 서열의 완전 해독 기반 종 식별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 인삼 속 5종의 엽록체 게놈 서열의 완전 해독 기반 종간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 인삼 속 주요 5종(고려인삼, 미국삼, 전칠삼, 죽절삼, 베트남삼)의 엽록체 게놈 서열을 완전 해독하고, 이들 사이의 변이를 분석하여 종간 차이가 발견된 InDel 다형성 기반 분자마커 14개를 개발하였다. 상기 분자마커들의 특이적 프라이머를 이용하여 인삼 속 주요 5종을 분석한 결과, 본 발명의 분자마커들이 인삼 속 주요 5종간 판별을 가능하게 함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 인삼 속(Panax)의 종 간에 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 서열번호 1 내지 36의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 고려인삼(Panax ginseng), 미국삼(P. quinquifolius), 전칠삼(P. notoginseng), 죽절삼(P. japonicus) 및 베트남삼(P. vietnamensis)을 포함하는 인삼 속의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 InDel 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 37과 38; 서열번호 39과 40; 서열번호 41과 42; 서열번호 43과 44; 서열번호 45와 46; 서열번호 47과 48; 서열번호 49와 50; 서열번호 51과 52; 서열번호 53과 54; 서열번호 55와 56; 서열번호 57과 58; 서열번호 59와 60; 서열번호 61과 62; 및 서열번호 63과 64;의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 고려인삼, 미국삼, 전칠삼, 죽절삼 및 베트남삼을 포함하는 인삼 속의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 InDel 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 고려인삼, 미국삼, 전칠삼, 죽절삼 및 베트남삼을 포함하는 인삼 속의 종으로부터 어느 하나 이상의 종 구별용 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 고려인삼, 미국삼, 전칠삼, 죽절삼 및 베트남삼을 포함하는 인삼 속의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 고려인삼, 미국삼, 전칠삼, 죽절삼 및 베트남삼을 포함하는 인삼 속의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명의 분자마커들은 세포내에서 카피수가 수백에서 수천개 존재하면서도 종 내 변이가 매우 드물게 존재하는 지역에서 발굴한 것으로 매우 안정적인 검증이 가능하며, 기존의 방법들보다 저비용, 고효율로 인삼 종을 식별할 수 있다. 또한, 인삼 종의 순도 유지나 품종 보호, 그리고 종자 분쟁의 해결 등에도 이용될 수 있다.

도 1은 5개 인삼 종의 완전한 엽록체 게놈을 보여주는 그림이다. 유색 박스는 유전자 산물의 기능에 근거하여 분류된 보존된 엽록체 유전자를 나타낸다. 원의 안쪽에 위치한 유전자는 시계 방향으로 전사가 이루어지는 유전자들이며, 원의 바깥에 위치한 유전자는 반시계 방향으로 전사가 이루어지는 유전자들을 나타낸다. 안쪽 원의 점선 지역은 엽록체 게놈의 GC 함량을 의미하고, 파란색 화살표 머리는 엽록체 게놈 상의 14개 분자마커의 위치를 가리킨다.
도 2는 5개 인삼 종의 엽록체 게놈 서열을 비교한 결과이다. 단백질 암호영역은 보라색으로, rRNA 또는 tRNA 코딩 유전자는 파란색으로, 비암호영역은 분홍색으로 표시하였다. Panax ginseng cv. CP: 고려인삼 천풍, Panax ginseng cv. YP: 고려인삼 연풍, P. quinquifolius: 미국삼, P. notoginseng: 전칠삼, P. japonicus: 죽절삼, P. vietnamensis: 베트남삼.
도 3은 본 발명의 14개의 분자마커를 검증한 결과로, A 내지 O의 좌측 모식도는 5개 인삼 종 사이의 InDel 영역을 나타낸 것이고, A 내지 O의 우측 사진은 PCR 산물의 로딩 결과이다. PgCP: 고려인삼 천풍, PgYP: 고려인삼 연풍, Pq: 미국삼, Pn: 전칠삼, Pj: 죽절삼, Pv: 베트남삼.
도 4는 본 발명의 InDel 마커의 서열정보로, 빨간색 괄호는 InDel 다형성 염기서열을, 푸른색은 정방향 및 역방향 프라이머의 위치를 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인삼 속(Panax)의 종 간에 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 서열번호 1 내지 36의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 고려인삼(Panax ginseng), 미국삼(P. quinquifolius), 전칠삼(P. notoginseng), 죽절삼(P. japonicus) 및 베트남삼(P. vietnamensis)을 포함하는 인삼 속의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 InDel 조성물을 제공한다.

상기 서열번호 1 내지 36는 각각 삽입(insertion) 또는 결실(deletion) 부위의 염기서열을 포함하는 다형성 뉴클레오티드이다. InDel 다형성이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 일부가 중간에 더해지거나 없어져 종간에 길이 차이가 생긴 경우를 포함하는 서열을 말한다. 상기 다형성 뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA가 될 수 있다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 InDel 조성물에 있어서, 상기 InDel 다형성 염기 정보는 도 4에 나타내었다. 본 발명에서 InDel 정보는 인삼 속 주요 5종의 엽록체 완전서열 정보를 이용한 비교로, 다형성 위치 정보는 고려인삼 천풍 품종(GenBank No. KM088019)의 위치 정보에 준하여 표시하였다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 InDel 조성물에 있어서, 본 발명의 염기서열들은 인삼 속 내 특정 한 종에만 특이하게 나타나는 경우(서열번호 4, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 13, 서열번호 18, 서열번호 23, 서열번호 36)와 특정 종이 아닌 소수 종에서 동시에 차이를 나타내는 경우(서열번호 1 내지 3, 서열번호 5 내지 6, 서열번호 8, 서열번호 10 내지 12, 서열번호 14 내지 17, 서열번호 19 내지 22, 서열번호 24 내지 35)가 있어, 여러 개의 조합을 통해 인삼 속의 종을 식별하는 용도로 활용할 수 있고, 바람직하게는 상기 서열번호 1 내지 36의 모든 InDel 조성물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 InDel 조성물에 있어서, InDel 다형성을 포함하는 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 인삼 속 주요 5종(고려인삼, 미국삼, 전칠삼, 죽절삼 및 베트남삼) 중에서 죽절삼 또는 베트남삼을 구별할 수 있고; 서열번호 4 또는 5의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 인삼 속 주요 5종 중에서 고려인삼을 구별할 수 있고; 서열번호 6 또는 7의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 인삼 속 주요 5종 중에서 전칠삼을 구별할 수 있고; 서열번호 8 또는 9의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 인삼 속 주요 5종 중에서 미국삼을 구별할 수 있고; 서열번호 10 또는 11의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 인삼 속 주요 5종 중에서 베트남삼을 구별할 수 있고; 서열번호 12 또는 13의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 인삼 속 주요 5종 중에서 죽절삼을 구별할 수 있고; 서열번호 14 내지 16의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 인삼 속 주요 5종 중에서 고려인삼 또는 미국삼을 구별할 수 있고; 서열번호 17 또는 18의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 인삼 속 주요 5종 중에서 전칠삼을 구별할 수 있고; 서열번호 19 내지 21의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 인삼 속 주요 5종 중에서 죽절삼 또는 베트남삼을 구별할 수 있고; 서열번호 22 또는 23의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 인삼 속 주요 5종 중에서 전칠삼을 구별할 수 있고; 서열번호 24 내지 26의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 인삼 속 주요 5종 중에서 전칠삼 또는 베트남삼을 구별할 수 있고; 서열번호 27 내지 30의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 인삼 속 주요 5종 중에서 전칠삼 또는 베트남삼을 구별할 수 있을뿐만 아니라, 고려인삼의 종내 구별이 가능하고; 서열번호 31 내지 34의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 인삼 속 주요 5종 중에서 고려인삼, 전칠삼 또는 죽절삼을 구별할 수 있고; 서열번호 35 또는 36의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 인삼 속 주요 5종 중에서 베트남삼을 구별할 수 있다(도 3 및 도 4 참고).

본 발명은 또한, 서열번호 37과 38; 서열번호 39과 40; 서열번호 41과 42; 서열번호 43과 44; 서열번호 45와 46; 서열번호 47과 48; 서열번호 49와 50; 서열번호 51과 52; 서열번호 53과 54; 서열번호 55와 56; 서열번호 57과 58; 서열번호 59와 60; 서열번호 61과 62; 및 서열번호 63과 64;의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 고려인삼, 미국삼, 전칠삼, 죽절삼 및 베트남삼을 포함하는 인삼 속의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 프라이머 세트는 바람직하게는 상기 14개의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상의 프라이머 세트를 포함하며, 가장 바람직하게는 14개의 프라이머 세트 모두를 포함할 수 있다. 14개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면, 인삼 속의 종(species)를 더욱 효율적으로 구별할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 프라이머 세트에 있어서, 상기 서열번호 37과 38의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 3의 염기서열에서 InDel 다형성을 구별할 수 있으며, 서열번호 39과 40의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 4 및 5의 염기서열에서 InDel 다형성을 구별할 수 있으며, 서열번호 41과 42의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 6 및 7의 염기서열에서 InDel 다형성을 구별할 수 있으며, 서열번호 43과 44의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 8 및 9의 염기서열에서 InDel 다형성을 구별할 수 있으며, 서열번호 45와 46의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 10 및 11의 염기서열에서 InDel 다형성을 구별할 수 있으며, 서열번호 47과 48의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 12 및 13의 염기서열에서 InDel 다형성을 구별할 수 있으며, 서열번호 49와 50의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 14 내지 16의 염기서열에서 InDel 다형성을 구별할 수 있으며, 서열번호 51과 52의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 17 및 18의 염기서열에서 InDel 다형성을 구별할 수 있으며, 서열번호 53과 54의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 19 내지 21의 염기서열에서 InDel 다형성을 구별할 수 있으며, 서열번호 55와 56의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 22 및 23의 염기서열에서 InDel 다형성을 구별할 수 있으며, 서열번호 57과 58의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 24 내지 26의 염기서열에서 InDel 다형성을 구별할 수 있으며, 서열번호 59와 60의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 27 내지 30의 염기서열에서 InDel 다형성을 구별할 수 있으며, 서열번호 61과 62의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 31 내지 34의 염기서열에서 InDel 다형성을 구별할 수 있으며, 및 서열번호 63과 64의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 35 및 36의 염기서열에서 InDel 다형성을 구별할 수 있다.

상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 37 내지 서열번호 64 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를들면, 서열번호 37 프라이머(22개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 37 내지 서열번호 64의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 InDel 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 고려인삼, 미국삼, 전칠삼, 죽절삼 및 베트남삼을 포함하는 인삼 속의 종으로부터 어느 하나 이상의 종 구별용 마이크로어레이를 제공한다. 바람직하게는, 상기 다형성 뉴클레오티드는 아미노-실란, 폴리-L-라이신 또는 알데히드의 활성기가 코팅된 기판에 고정될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 또는 플라스틱일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 다형성 뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 피에조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting) 법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 다형성 뉴클레오티드 또는 그의 상보적 다형성 뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 고려인삼, 미국삼, 전칠삼, 죽절삼 및 베트남삼을 포함하는 인삼 속의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한,

인삼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 다형성 뉴클레오티드를 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 고려인삼, 미국삼, 전칠삼, 죽절삼 및 베트남삼을 포함하는 인삼 속의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 있어서, 인삼 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 알려진 통상적인 방법을 통하여 이루어질 수 있으며, 그 방법은 전술한 바와 같다. 상기 분리된 인삼 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 방법에 있어서, 인삼 속의 특정 종을 다른 종으로부터 구별하기 위한 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 시퀀싱, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체 섬광 계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물 재료 및 게놈 DNA 추출

고려인삼(Panax ginseng) 천풍(이하 CP) 및 연풍(YP) 품종, 미국삼(P. quinquifolius)은 서울대학교 인삼 농장(수원)에서 수집하였다. 전칠삼(P. notoginseng) 및 죽절삼(P. japonicus)은 각각 중국 귀주성(Guizhou Province) 다팡현(Dafang County) 및 후베이성(Hubei Province) 은시현(Enshi County)으로부터 수집하였다. 베트남삼(P. vietnamensis)은 베트남 꼰뚬성(Kon Tum Province) 응옥린(Ngoc Linh) 산에서 수집하였다. 각 인삼 종의 뿌리 및 줄기를 수확하고 사용 전까지 -70℃에 저장하였다. 변형된 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide) 방법을 이용하여 각 시료로부터 게놈 DNA를 추출하였고, 추출된 게놈 DNA의 양과 질은 UV 분광광도계를 사용하여 측정하였다.

2. 엽록체 서열 비교분석 및 SSR 및 Large Sequence Repeat의 분석

고려인삼 천풍 품종(KM088019), 고려인삼 연풍 품종(KM088020), 미국삼(KM088018), 전칠삼(KP036468), 죽절삼(KP036468) 및 베트남삼(KP036471)의 엽록체 게놈 서열은 본 발명자들의 이전 연구를 통해 획득하였다(Kim, K. et al., PLoS One, 2015, 10, e0117159; Kim, K. et al., Sci. Rep. 2017, 7, 4917). MAFFT(http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/), MEGA 6 및 mVISTA(http://genome.lbl.gov/vista/mvista/submit.shtml) 프로그램을 사용하여 인삼 종 간 엽록체 서열을 비교하였다.

SSR(Simple Sequence Repeat)은 모노뉴클레오티드(mononucleotide) SSR에 대해서는 ≥10 반복, 디뉴클레오티드(dinucleotide) SSR에 대해서는 ≥5 반복, 트리뉴클레오티드(trinucleotide) SSR에 대해서는 ≥4 반복, 및 테트라-, 펜타- 및 헥사뉴클레오티드(tetra-, penta-, and hexanucleotide) SSR에 대해서는 ≥3 반복으로 설정하여 MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html) 프로그램을 사용하여 예측하였다.

엽록체 게놈 내에 종열(tandem), 분산(dispersed), 역상(reverse), 및 역배열(palindromic) 반복 서열의 수 및 위치 확인을 위해 REPuter 프로그램(Kurtz, S. et al., Nucleic acids Res. 2001, 29, 4633-4642)을 사용하였다. 모든 종류의 반복 서열에 대해서, 15bp의 최소 반복 길이 및 두 카피 사이의 최소 컷오프 유사성 90%를 설정하였다. 오버래핑 반복은 가능할 때마다 하나의 반복 모티프로 중합하였다.

3. InDel 마커의 개발 및 검증

엽록체 서열 내 종내(intraspecies) 및 종간(interspecies) 다형성을 검증하기 위해서, 5개의 주요 인삼 종을 증명할 수 있는 DNA 마커를 개발하였고, 종내 다형성 수준으로써 고려인삼 연풍을 포함하는 인삼 속 엽록체 게놈에서 발견된 InDel(Insertion/Deletion) 다형성 자리에 기반하여 특이적 프라이머를 고안하였다. 프라이머 세트는 Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) 프로그램을 사용하여 디자인하였다.

중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)은 20ng DNA 주형, 5pmole 각 프라이머, 1.25mM dNTP, 1.25 유닛 Taq 중합효소(Inclone, 한국) 및 2.5㎕ 10X 반응버퍼를 포함하는 25㎕의 반응액을 이용하여, 다음의 단계로 구성된 중합반응을 수행하였다: 94℃(5분); 94℃(30초) → 54~58℃(30초) → 72℃(30초)의 35회 사이클; 및 72℃(7분). PCR 산물은 1.5~3.0% 아가로스 겔에 로딩한 후, EtBr로 염색하여 확인하였으며, 단편 분석기(fragment analyzer, Advanced Analytical Technologies Inc., 미국)를 사용하여 분석하였다.

실시예 1. 인삼 속 5개 종의 엽록체 게놈 서열 분석

인삼 속 5개 종(고려인삼, 미국삼, 전칠삼, 죽절삼 및 베트남삼)에 대하여 dnaLCW 방법을 비롯한 본 발명자들의 이전 연구를 토대로 엽록체 유전체의 전장을 완성하였다(도 1). 이들 엽록체 유전체의 총 길이는 155,993bp (베트남삼)에서부터 156,466bp (전칠삼)에 이르렀으며, 유전자들의 순서와 방향 등이 종간에 매우 잘 보존되어 있음을 확인할 수 있었다. 인삼 속 엽록체 유전체는 공통적으로 79개의 단백질을 만드는 유전자, 30개의 tRNA 유전자, 그리고 4개의 rRNA 유전자로 구성되어 있으며, 구조상으로 한 개의 LSC(large single copy), 한 개의 SSC(small single copy), 그리고 두 개의 IR(inverted repeat blocks)을 가지고 있었다.

IR 지역 중 하나를 제외한 엽록체 유전체 서열 6개를 대상으로 다중 비교(multiple alignment)를 수행하고, 고려인삼 천풍 품종의 엽록체 유전체 서열을 기준으로 6개 인삼 종 엽록체 유전체간의 상동성을 mVISTA 프로그램으로 시각화하여 도 2와 같이 나타내었다. 암호영역(coding region)이 비암호영역(non-coding region)보다 더 잘 보존되어 있었으며, 특히 4개의 rRNA 유전자와 30개의 tRNA 유전자가 매우 높은 상동성을 나타내었다. 가장 다양성이 높은 암호영역은 ycf1 유전자로서, 다수의 InDel 반복서열로 인하여 서열 상동성이 낮은 것으로 확인되었다.

5개 인삼 종의 엽록체 게놈간 뉴클레오티드 치환 및 InDel의 수 및 비율

	고려인삼 천풍	고려인삼 연풍	미국삼	전칠삼	죽절삼	베트남삼
천풍	-	1	141	480	511	559
연풍	3(0.33)	-	142	481	512	560
미국삼	34(4.15)	35(4.06)	-	509	508	542
전칠삼	101(4.75)	98(4.91)	110(4.63)	-	484	548
죽절삼	92(5.55)	93(5.51)	90(5.64)	111(4.36)	-	331
베트남삼	102(5.48)	103(5.44)	104(5.21)	124(4.42)	74(4.47)	-

(대각선 윗쪽 삼각형은 뉴클레오티드 치환의 총합을 나타내며, 대각선 아래쪽 삼각형은 InDel의 수를 나타낸다. 괄호는 InDel에 대한 뉴클레오티드 치환의 비율(substitutions/InDels)을 의미한다.)

고려인삼의 두 품종인 천풍과 연풍은 엽록체 게놈 서열이 전체적으로 매우 비슷하였으며 3개의 InDel과 1개의 SNP(single nucleotide polymorphism)가 존재하였다. 5개의 인삼 속 식물들도 매우 높은 서열 상동성을 보였는데(98.9%), 이는 인삼 속에서 엽록체 서열이 종간에 매우 잘 보존되어 있음을 의미하며, 두릅나무과(Araliaceae) 식물에 대해 수행된 기존의 선행연구와도 일치하는 결과라 할 수 있다. 위와 같이 고려인삼 종내(intraspecies)의 엽록체 유전체 간 다양성은 낮게 확인되었지만, 종간(interspecies)에서는 다양한 변이가 관찰되었다. 종간 수준에서 보면 SNP의 경우 적게는 141개(인삼과 미국삼), 많게는 560개(인삼과 베트남삼)가 관찰되었다. Indel의 경우에도 최소 34개(인삼과 미국삼)부터 최대 124개(전칠삼과 베트남삼)가 관찰되었다(표 1). A/T 염기 치환 형태가 다른 유형보다 빈번하게 관찰되었으며, 이는 기존에 보고된 결과와도 일치하였다. 인삼과 미국삼간에는 다른 세 인삼 종 식물보다 비교적 적은 SNP 및 InDel이 관찰되었을 뿐만 아니라, InDel 발생 빈도에 대한 SNP 발생 빈도 비율(S/I)이 4.06으로 가장 낮게 확인되었다. 반면 미국삼과 베트남삼 사이에서는 S/I 비율이 5.64로 가장 높게 나타났다. S/I 비율은 분화시기가 오래될수록 늘어나는 것으로 알려져 있으므로, 이를 토대로 볼 때 주요 인삼 5종의 유전체간의 연관도는 인삼과 미국삼과 가장 가까우며 미국삼과 전칠삼이 가장 멀다고 할 수 있다(표 1).

실시예 2. 인삼 종 구별을 위한 InDel 마커의 개발 및 검증

엽록체 서열 정렬 결과를 바탕으로 InDel이 가장 다양하게 분포하는 14개의 지역을 선정하여 총 14개의 인삼 종 구별 분자 마커를 제작하였다.

상기 14개 마커들은 PCR로 잘 증폭됨을 확인하였으며 다양한 변이양상을 보여주었고, 이 중 8개 마커들은 각각 다른 인삼 종 식물체에 특이적인 크기의 밴드를 증폭하였다(도 3).

마커 gcpm2는 rps16 유전자와 trnQ-UUG 유전자 사이에 위치한 33bp의 반복 서열에서 유래하였으며 두 고려인삼 품종인 천풍과 연풍에 특이적인 크기의 밴드를 증폭하였다. 전칠삼 특이 마커인 gcpm3, gcpm8, gcpm10은 각각 atpH-atpI 지역의 25bp 반복서열, petA-psbJ 지역의 38bp 반복서열, rpl14-rpl16 지역의 25bp 반복서열에서 유래하였다. 미국삼 특이 마커인 gcpm4는 rps2-rpoC2 지역의 23bp 반복서열에서 유래하였다. 전칠삼 특이 마커인 gcpm6는 trnE-trnT 지역에 위치한 67bp의 반복서열과 19bp의 반복서열에서 유래하였다. 마지막으로 두 개의 베트남삼 특이 마커인 gcpm9와 gcpm14는 각각 clpP-psbB 지역에 위치한 25bp의 반복서열과 6bp의 SSR, 그리고 ycf1지역의 30bp 반복서열에서 유래하였다.

개발된 InDel 마커 14개 마커 중 6개의 마커(gcpm1, 5, 7, 11, 12, 및 13)를 이용할 경우 2개 이상의 종을 구분할 수 있었다. 이 중 gcpm12 마커로부터 가장 다양한 밴드가 증폭되었으며, 고려인삼 두 품종도 이 마커를 이용하여 구분되는 것을 확인하였다. 또한 2개의 마커에 대해 전칠삼으로부터 증폭된 밴드가 엽록체 서열상으로 예측한 크기와 다르게 나타나는 현상이 관찰되었다. trnK-UUU-rps16 지역에서 유래한 gcpm1은 서열상에서 예측된 것보다 더 작은 크기의 밴드가 증폭되었으며 ycf1에서 유래한 gcpm12에서는 이중 밴드가 증폭되는 것을 확인하였다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Marker derived from complete sequencing of chloroplast genome of five Panax species, primer set for discrimination of Panax species and uses thereof <130> PN17357 <160> 64 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 392 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 1 tgggggaata aataaggaag aagtagaaaa aaatctcgga tttagattta ttcaatcaat 60 aataagtaga ataaaaatca ataattcctt gtttattacg tgttagtaaa gttccaacga 120 aagccgcccg attgaaggaa atgccagaat tttacatttc taggatcaac caactggggt 180 tatgtcgtta taaaatatta gattctatag aagcaatcaa tgataaatag atacgaatag 240 ggcgcaaaaa aaggggggga aataaaaaac aaagtataga aaagttatac aaaattttat 300 acgaatcact gccccctttt tttatttcct taattgaatt tcgtttgatt ttgattaggg 360 caaagttact taaaaacctc cgccttcttt aa 392 <210> 2 <211> 415 <212> DNA <213> Panax japonicus <400> 2 tgggggaata aataaggaag aagtagaaaa aaatctcgga tttagattta ttcaatcaat 60 aataagtaga ataaaaatca ataattaagt agaataaaaa ttttttattc cttgtttatt 120 acgtgttagt aaagttccaa cgaaagccgc ccgattgaag gaaatgccag aattttacat 180 ttctaggatc aaccaactgg ggttatgtcg ttataaaata ttagattcta tagaagcaat 240 caatgataaa tagatacgaa tagggcgcaa aaaaaggggg ggaaataaaa aacaaagtat 300 agaaaagtta tacaaaattt tatacgaatc actgccccct ttttttattt ccttaattga 360 atttcgtttg attttgatta gggcaaagtt acttaaaaac ctccgccttc tttaa 415 <210> 3 <211> 432 <212> DNA <213> Panax vietnamensis <400> 3 tgggggaata aataaggaag aagtagaaaa aaatctcgga tttagattta ttcaatcaat 60 aaatttattc aatcaataat aagtagaata aaaatcaata attaagtaga ataaaaattt 120 tttattcctt gtttattacg tgttagtaaa gttccaacga aagccgcccg attgaaggaa 180 atgccagaat tttacatttc taggatcaac caactggggt tatgtcgtta taaaatatta 240 gattctatag aagcaatcaa tgataaatag atacgaatag ggcgcaaaaa aaggggggga 300 aataaaaaac aaagtataga aaagttatac aaaattttat acgaatcact gccccctttt 360 tttatttcct taattgaatt tcgtttgatt ttgattaggg caaagttact taaaaacctc 420 cgccttcttt aa 432 <210> 4 <211> 194 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 4 tggaaaggct gttgtcactg aacgttgtca ctaaaataga acgaaatcga ataataaaaa 60 tacatatata ttacatatta agttaaacta agcatttcct cattttatat gtatttttat 120 tttttaacct ggaattttta tatgtatttt tattttttaa cctggaatta agtaatcttt 180 ctgcaatctt ggca 194 <210> 5 <211> 161 <212> DNA <213> Panax quinquifolius <400> 5 tggaaaggct gttgtcactg aacgttgtca ctaaaataga acgaaatcga ataataaaaa 60 tacatatata ttacatatta agttaaacta agcatttcct cattttatat gtatttttat 120 tttttaacct ggaattaagt aatctttctg caatcttggc a 161 <210> 6 <211> 424 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 6 tggtcaatcg ctgaagaaaa tcaactgaaa ggggaatcgt tctataaaac atcccctttt 60 tctttttatt taattttatt taatcacatg ttgtaaacta caagaattct tattcaaatt 120 atgactccga atattaacta ttcggattgg ctgaccaata taaaacgaat attcattgag 180 gagaggtatg atataagtag accaaccggg aattttagga aaaagatctt ttagatctct 240 ttcctttttt tattttacaa ttctctgccc taatcttttt tgcgttgtat atttatattt 300 cttaattcta tttttttggg ccgcgcatac gtttccttgg gctaaggcaa aaaaagaatc 360 tttcgaaaac tagtcaatgc tagtcaatga tggccctcca tggattcacc tatataagcc 420 gcgg 424 <210> 7 <211> 449 <212> DNA <213> Panax notoginseng <400> 7 tggtcaatcg ctgaagaaaa tcaactgaaa ggggaatcgt tctataaaac atcccctttt 60 tctttttatt taattttatt taatcacatg ttgtaaacta caagaattct tattcaaatt 120 atgactccga atattaacta ttcggattgg ctgaccaata taaaacgaat attcattgag 180 gagaggtatg atataagtag accaaccggg aattttagga aaaagatctt ttagatctct 240 ttcctttttt tattttacaa ttctctgccc taatcttttt tgctattact ctagattgta 300 tatagtgagt tgtatattta tatttcttaa ttctattttt ttgggccgcg catacgtttc 360 cttgggctaa ggcaaaaaaa gaatctttcg aaaactagtc aatgctagtc aatgatggcc 420 ctccatggat tcacctatat aagccgcgg 449 <210> 8 <211> 272 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 8 ctcttccaaa ttgatgttcc aatatctttt tgtcatttct ccacatatcc cccctttttc 60 aaaaaaaaaa gagacgaggg tatcctgaaa taaataattg ttccgatgga accttctctt 120 ctaccgcaaa ttagccgtag atacacgacc caagccatta ttcttttcta ttcaaatgac 180 cggacaaaat acagattgtt ttcaaataaa aagacgaatc tactcttagg aatcattaaa 240 tcctataaat gattgttctg gtgtatcatg ga 272 <210> 9 <211> 295 <212> DNA <213> Panax quinquifolius <400> 9 ctcttccaaa ttgatgttcc aatatctttt tgtcatttct ccacatatcc cccctttttc 60 aaaaaaaaaa gagacgaggg tatcctgaaa taaataattg ttccgatgga accttctctt 120 ctaccgcaaa ttagccgtag atacacgacc caagccatta ttcttttcta ttcgttatta 180 tctttattac taaatcaaat gaccggacaa aatacagatt gttttcaaat aaaaagacga 240 atctactctt aggaatcatt aaatcctata aatgattgtt ctggtgtatc atgga 295 <210> 10 <211> 457 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 10 tcctgaacca ctagacgatg ggggcatact tacccaatag ccatcatact atgttcatag 60 tatgaacagt tttttgaaat tgtcaatata atggaatgat atgattcgat ccgggggatc 120 tttccgtttt tcatcatttc atatttcata gaatttttga attcatattc atgaatcatt 180 cattagattc gctattgtat ttgtatataa aatacaatag cgaattaata tatcattcta 240 ttatatttta ttttaataaa attcttatta atataattat taattatata taaaataata 300 taaaatataa ttatagaata aaaaaataga aaaaatacgg ggaatacttt cagggagtgg 360 ttggtccgtc agaaaagaaa aagaaaaagg ggctcgcact aagctcggaa attcacaaac 420 aaaaaatctg agaagaggga tcaagaagtt atcgaaa 457 <210> 11 <211> 444 <212> DNA <213> Panax vietnamensis <400> 11 tcctgaacca ctagacgatg ggggcatact tacccaatag ccatcatact atgttcatag 60 tatgaacagt tttttgaaat tgtcaatata atggaatgat atgattcgat ccgggggatc 120 tttccgtttt tcatcatttc atatttcata gaatttttga attcatattc atgaatcatt 180 cattagattc gctattgtat ttgtatattt tttttatata aaaatacaat agcgaattaa 240 tatatcattc tattatattt attatatttt attttaataa aattcttatt aatataatta 300 tagaataaaa aaatagaaaa aatacgggga atactttcag ggagtggttg gtccgtcaga 360 aaagaaaaag aaaaaggggc tcgcactaag ctcggaaatt cacaaacaaa aaatctgaga 420 agagggatca agaagttatc gaaa 444 <210> 12 <211> 475 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 12 ctcgcactaa gctcggaaat tcacaaacaa aaaatctgag aagagggatc aagaagttat 60 cgaaaaattt tttctatttc tataagaatt tagttcaggg acaaatagaa tctcttcatc 120 acatgatttg atgaaatatc ttgaatctat gtcgaattga taggtgtacg tgtattaatc 180 aaatgaattt cgttctgatg gggatcattt cattcaataa aagaaaagaa attaggatcg 240 gttttgaaac gattcattgc tagacttgct aggtaaataa atttgattat tcaagaataa 300 gccactatcc actatgagtt tactggatgg acttatgtat atatatacta cttatgtata 360 tatatactta agtatataat attatgtata tggatagact ttacctatat agtggctgat 420 tcaggagttg aatcaaacgg gcccttttaa ctcagcggta gagtaacgcc atggt 475 <210> 13 <211> 559 <212> DNA <213> Panax japonicus <400> 13 ctcgcactaa gctcggaaat tcacaaacaa aaaatctgag aagagggatc aagaagttat 60 cgaaaaattt tttctatttc tataagaatt tagttcaggg acaaatagaa tctcttcatc 120 acatgatttg atgaaatatc ttgaatctat gtcgaattga taggtgtacg tgtattaatc 180 aaatgaattt cgttctgatg gggatcattt cattcaataa aagaaaagaa attaggatcg 240 gttttgaaac gattcattgc tagacttgct aggtaaataa atttgattat tcaagaataa 300 gccactatcc actatgagtt tactggatgg acttatgtat atatatacta cttatgcaag 360 aataagccac tatccactat gagtttactg gatggactta tgtatatata tactacttat 420 gtatatatat actacttatg tatatatata cttaagtata taatattatg tatatggata 480 gactttacct atatagtggc tgattcagga gttgaatcaa acgggccctt ttaactcagc 540 ggtagagtaa cgccatggt 559 <210> 14 <211> 297 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 14 tggtgtgttg aatccacaat taatccgatg gatccttagg attggtatat tcttttctat 60 cctggaattt ctctggatcg agccaagtat cacaactctt tctacccatc ctgtatattg 120 tccttttcgt tccgtgttgg aatataaact tattacttat tttagttatt ggacgagatt 180 ttacaaaaaa attcttcata ggagaaaaat ctttcttttt ttcgatgcga atttgacacg 240 acatagtaga gtagaaagcc caattctatt tataattgga tattattgga aaggggg 297 <210> 15 <211> 289 <212> DNA <213> Panax quinquifolius <400> 15 tggtgtgttg aatccacaat taatccgatg gatccttagg attggtatat tcttttctat 60 cctggaattt ctctggatcg agccaagtat cacaactctt tctacccatc ctgtatattg 120 tccttttcgt tccgtataaa cttattactt attttagtta ttggacgaga ttttacaaaa 180 aaattcttca taggagaaaa atctttcttt ttttcgatgc gaatttgaca cgacatagta 240 gagtagaaag cccaattcta tttataattg gatattattg gaaaggggg 289 <210> 16 <211> 322 <212> DNA <213> Panax notoginseng <400> 16 tggtgtgttg aatccacaat taatccgatg gatccttagg attggtatat tcttttctat 60 cctggaattt ctctggatcg agccaagtat cacaactctt tctacccatc ctgtatattg 120 tccttttcgt tccgtgttgg aatataaact tattacttat tttagttatt ggacgagatt 180 ttacaaaaaa attcttcata ggagaaaaat ctttcttttt ttcgatgcga atttgacacg 240 acatagtaga gtagaaagcc caattctatt tataattaga tattattggt ctatttataa 300 ttggatatta ttggaaaggg gg 322 <210> 17 <211> 237 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 17 tccaaagagg aatccttcca gtagtatcag ccatttaccc cacttccctc cacatttcat 60 caagcggtcg tgctagagac ataaacagtc atggataatt atgagatgag atccttccga 120 atgggctaag agagagtgcc tagaattatt attctccttc gttttcttaa ttgaagaaat 180 aattggaaaa taaaacagca agtacaaaaa tgagtaataa cccccagtag aggctgg 237 <210> 18 <211> 313 <212> DNA <213> Panax notoginseng <400> 18 tccaaagagg aatccttcca gtagtatcag ccatttaccc cacttccctc cacatttcat 60 caagcggtcg tgctagagac ataaacagtc atggataatt atgagatgag atccttccga 120 atgggctaag agagagtgcc tagaattatt attctccttc gttttcttaa ttgaagaaat 180 aaattattat tctccttcgt tttcttaatt gaagaaataa attattattc tccttcgttt 240 tcttaattga agaaataatt ggaaaataaa acagcaagta caaaaatgag taataacccc 300 cagtagaggc tgg 313 <210> 19 <211> 498 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 19 tccaggactt cgaaagggta cttttggaac accaataggc atgaaaaaaa agaaaaaaga 60 attaagtact atatttcact ttgatgtgga aacgtaacaa tgggtttatt gtctttataa 120 tattgtcctt tatcatattt tatacataga ttagaaatac agaataaata agggaaaatt 180 cttatgaata ggcccttcta atgatgaaga agtatggacg cattcgctca tagaaaacgg 240 tatcaacctc cccattgcgt attggtactt atcgagtata gaataaatct gcttctcttt 300 gttcctacga acggaatcgt tccattatta ccaacagaat agaacaaata ttaacccttg 360 ctctgaaaca atcccctgaa caggggaaca tagtcatagt catagtatag tcttttccaa 420 tgcaataaag ttacgtagtg tctttttttc tttgatataa ataaggggta tttccatggg 480 tttgccttgg tatcgtgt 498 <210> 20 <211> 492 <212> DNA <213> Panax japonicus <400> 20 tccaggactt cgaaagggta cttttggaac accaataggc atgaaaaaaa agaaaaaaga 60 attaagtact atatttcact ttgatgtgga aacgtaacaa tgggtttatt gtctttataa 120 tattgtcctt tatcatattt tatacataga ttagaaatac agaataaata agggaaaatt 180 cttatgaata ggcccttcta atgatgaaga agtatggacg cattcgctca tagaaaacgg 240 tatcaacctc cccattgcgt attggtactt atcgagtata gaataaatct gcttctcttt 300 gttcctacga acggaatcgt tccattatta ccaacagaat agaacaaata ttaacccttg 360 ctctgaaaca atcccctgaa caggggaaca tagtcatagt atagtctttt ccaatgcaat 420 aaagttacgt agtgtctttt tttctttgat ataaataagg ggtatttcca tgggtttgcc 480 ttggtatcgt gt 492 <210> 21 <211> 517 <212> DNA <213> Panax vietnamensis <400> 21 tccaggactt cgaaagggta cttttggaac accaataggc atgaaaaaaa agaaaaaaga 60 attaagtact atatttcact ttgatgtgga aacgtaacaa tgggtttatt gtctttataa 120 tattgtcctt tatcatattt tatacataga ttagaaatac agatttatac atagattaga 180 aatacagaat aaataaggga aaattcttat gaataggccc ttctaatgat gaagaagtat 240 ggacgcattc gctcatagaa aacggtatca acctccccat tgcgtattgg tacttatcga 300 gtatagaata aatctgcttc tctttgttcc tacgaacgga atcgttccat tattaccaac 360 agaatagaac aaatattaac ccttgctctg aaacaatccc ctgaacaggg gaacatagtc 420 atagtatagt cttttccaat gcaataaagt tacgtagtgt ctttttttct ttgatataaa 480 taaggggtat ttccatgggt ttgccttggt atcgtgt 517 <210> 22 <211> 227 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 22 ccgctgttat ccgctacatt caaaagggtc tgaggttgaa tcatatcatt ttttttttta 60 atctattctt tcaatgcaaa gggcgaagaa aaaagaaata ttgtttgtcc aaaaaaataa 120 atcagtacct gcaattgttt tttttttaat tctcaagacc tatttccttt gattctccat 180 ttttatgccg aaataatgaa ttgagttcgt ataggcattt tagacga 227 <210> 23 <211> 254 <212> DNA <213> Panax notoginseng <400> 23 ccgctgttat ccgctacatt caaaagggtc tgaggttgaa tcatatcatt ttttttttta 60 atctattctt tcaatgcaaa gggcgaagaa aaaagaaata ttgcaaaggg cgaagaaaaa 120 agaaatattg tttgtccaaa aaaataaatc agtacctgca attgtttttt ttttaattct 180 caagacctat ttcctttgat tctccatttt tatgccgaaa taatgaattg agttcgtata 240 ggcattttag acga 254 <210> 24 <211> 220 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 24 ctggacgatc ctatttggtc aaatacctag cgacaaactc ctatgttcct ttcattacgg 60 tatttctgaa caagttcctg gataacaagc ctaaaggttt tcttattgat gatatcgata 120 ttgatgctag tgacgatatt gatgctagtg acgatattga tgctagtgac gatattgatg 180 ctagtgacga tatcgatcgt gaccttcata cggagctgga 220 <210> 25 <211> 238 <212> DNA <213> Panax notoginseng <400> 25 ctggacgatc ctatttggtc aaatacctag cgacaaactc ctatgttcct ttcattacgg 60 tatttctgaa caagttcctg gataacaagc ctaaaggttt tcttattgat gatatcgata 120 ttgatgctag tgacgatatt gatgctagtg acgatattga tgctagtgac gatattgatg 180 ctagtgacga tattgatgct agtgacgata tcgatcgtga ccttcatacg gagctgga 238 <210> 26 <211> 202 <212> DNA <213> Panax vietnamensis <400> 26 ctggacgatc ctatttggtc aaatacctag cgacaaactc ctatgttcct ttcattacgg 60 tatttctgaa caagttcctg gataacaagc ctaaaggttt tcttattgat gatatcgata 120 ttgatgctag tgacgatatt gatgctagtg acgatattga tgctagtgac gatatcgatc 180 gtgaccttca tacggagctg ga 202 <210> 27 <211> 430 <212> DNA <213> Panax ginseng cv. Chunpoong <400> 27 gcagaatacc gtcacccatt attactaaga aactgaaaga aaccccaaca acggaagaaa 60 ggggggaaag tgaggaagaa acagatgtag aaatagaaac cccaacaacg gaagaaaggg 120 gggaaagtga ggaagaaaca gatgtagaaa tagaaacccc aacaacggaa gaaagggggg 180 aaagtgagga agaaacagat gtagaaatag aaaccccaac aacggaagaa aggggggaaa 240 gtgaggaaga aacagatgta gaaatagaaa ccccaacaac ggaagaaagg ggggaaagtg 300 aggaagaaac agatgtagaa atagaaacag cttccgaaac gaagggggct aaacaggaac 360 aagagggatc caccgaagaa gatccttctc cttccctttt ttcggaagaa aaggaggatc 420 cggacaaaat 430 <210> 28 <211> 487 <212> DNA <213> Panax ginseng cv. Yunpoong <400> 28 gcagaatacc gtcacccatt attactaaga aactgaaaga aaccccaaca acggaagaaa 60 ggggggaaag tgaggaagaa acagatgtag aaatagaaac cccaacaacg gaagaaaggg 120 gggaaagtga ggaagaaaca gatgtagaaa tagaaacccc aacaacggaa gaaagggggg 180 aaagtgagga agaaacagat gtagaaatag aaaccccaac aacggaagaa aggggggaaa 240 gtgaggaaga aacagatgta gaaatagaaa ccccaacaac ggaagaaagg ggggaaagtg 300 aggaagaaac agatgtagaa atagaaaccc caacaacgga agaaaggggg gaaagtgagg 360 aagaaacaga tgtagaaata gaaacagctt ccgaaacgaa gggggctaaa caggaacaag 420 agggatccac cgaagaagat ccttctcctt cccttttttc ggaagaaaag gaggatccgg 480 acaaaat 487 <210> 29 <211> 373 <212> DNA <213> Panax quinquifolius <400> 29 gcagaatacc gtcacccatt attactaaga aactgaaaga aaccccaaca acggaagaaa 60 ggggggaaag tgaggaagaa acagatgtag aaatagaaac cccaacaacg gaagaaaggg 120 gggaaagtga ggaagaaaca gatgtagaaa tagaaacccc aacaacggaa gaaagggggg 180 aaagtgagga agaaacagat gtagaaatag aaaccccaac aacggaagaa aggggggaaa 240 gtgaggaaga aacagatgta gaaatagaaa cagcttccga aacgaagggg gctaaacagg 300 aacaagaggg atccaccgaa gaagatcctt ctccttccct tttttcggaa gaaaaggagg 360 atccggacaa aat 373 <210> 30 <211> 316 <212> DNA <213> Panax vietnamensis <400> 30 gcagaatacc gtcacccatt attactaaga aactgaaaga aaccccaaca acggaagaaa 60 ggggggaaag tgaggaagaa acagatgtag aaatagaaac cccaacaacg gaagaaaggg 120 gggaaagtga ggaagaaaca gatgtagaaa tagaaacccc aacaacggaa gaaagggggg 180 aaagtgagga agaaacagat gtagaaatag aaacagcttc cgaaacgaag ggggctaaac 240 aggaacaaga gggatccacc gaagaagatc cttctccttc ccttttttcg gaagaaaagg 300 aggatccgga caaaat 316 <210> 31 <211> 485 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 31 aagattttta tgaagatacc gaaaataaaa atttcaatta ttattacatg aatttatatt 60 catagagtaa ggataaagaa ttactctaaa aagagtactt gattctgcta tgaatcatag 120 gattaactaa gataaaaaac ttgtcctaat aaaataagaa cttttagtta gtttgttcca 180 aatcattaac tagttcatta tggaattgat ttattatttt ccatttcaat aaaaaaaaac 240 atttatagat tatagaaaac gctataatat ccgacatttt atataaaatt aacttgttat 300 ataaaattaa cttgattttc tatttatcga tatttatcga aaggggtaaa ataaaattaa 360 taaaaaaata actaagatct cttttatcaa accacgtatc ctttaacaga ttaataactt 420 taattactag tctcattcaa atttaaaaat gaaatttagg agtattcttt cctcgaattt 480 gaccg 485 <210> 32 <211> 467 <212> DNA <213> Panax quinquifolius <400> 32 aagattttta tgaagatacc gaaaataaaa atttcaatta ttattacatg aatttatatt 60 catagagtaa ggataaagaa ttactctaaa aagagtactt gattctgcta tgaatcatag 120 gattaactaa gataaaaaac ttgtcctaat aaaataagaa cttttagtta gtttgttcca 180 aatcattaac tagttcatta tggaattgat ttattatttt ccatttcaat aaaaaaaaac 240 atttatagat tatagaaaac gctataatat ccgacatttt atataaaatt aacttgattt 300 tctatttatc gatatttatc gaaaggggta aaataaaatt aataaaaaaa taactaagat 360 ctcttttatc aaaccacgta tcctttaaca gattaataac tttaattact agtctcattc 420 aaatttaaaa atgaaattta ggagtattct ttcctcgaat ttgaccg 467 <210> 33 <211> 462 <212> DNA <213> Panax notoginseng <400> 33 aagattttta tgaagatacc gaaaataaaa atttcaatta ttattacatg aatttatatt 60 catagagtaa ggataaagaa ttactctaaa aagagtactt gattctgcta tgaatcatag 120 gattaactaa gataaaaaac ttgtcctaat aaaataagaa cttttagtta gtttgttcca 180 aatcattaac tagttcatta tggaattgat ttattatttt ccatttcaat aaaaaaaaac 240 atttatagat tatagaaaac gctataatat ccgacatttt atataaaatt aacttgattt 300 tctatttatc gatatttatc gaaaggggta aaattaataa aaaaataact aagatctctt 360 ttatcaaacc acgtatcctt taacagatta ataactttaa ttactagtct cattcaaatt 420 taaaaatgaa atttaggagt attctttcct cgaatttgac cg 462 <210> 34 <211> 457 <212> DNA <213> Panax japonicus <400> 34 aagattttta tgaagatacc gaaaataaaa atttcaatta ttattacatg aatttatatt 60 catagagtaa ggataaagaa ttactctaaa aagagtactt gattctgcta tgaatcatag 120 gattaactaa gataaaaaac ttgtcctaat aaaataagaa cttttagtta gtttgttcca 180 aatcattaac tagttcatta tggaattgat ttattatttt ccatttcaat aaaaaaaaac 240 atttatagat tatagaaaac gctataatat ccgacatttt atataaaatt aacttgattt 300 tctatttatc gaaaggggta aaataaaatt aataaaaaaa taactaagat ctcttttatc 360 aaaccacgta tcctttaaca gattaataac tttaattact agtctcattc aaatttaaaa 420 atgaaattta ggagtattct ttcctcgaat ttgaccg 457 <210> 35 <211> 208 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 35 tggttagttt caccggattc atatacttct ttcaatctaa atagagttgg atttactttt 60 gagagctctt tttttattct ttttagaaac agaaataaaa cgtttttgat aaaccccctt 120 tttgtttctt ttgaaccttg tagaaaatgt tttgttcttc ttattaaaac tcttagagct 180 agaaaatcct taaaaatggg ctcaaaaa 208 <210> 36 <211> 178 <212> DNA <213> Panax vietnamensis <400> 36 tggttagttt caccggattc atatacttct ttcaatctaa atagagttgg atttactttt 60 gagagctctt tttttattct ttttagaaac agaaataaaa cgtttttgat aaaccccctt 120 tttgttcttc ttattaaaac tcttagagct agaaaatcct taaaaatggg ctcaaaaa 178 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 tgggggaata aataaggaag aa 22 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 ttaaagaagg cggaggtttt t 21 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 tggaaaggct gttgtcactg 20 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 tgccaagatt gcagaaagat t 21 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 tggtcaatcg ctgaagaaaa 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 ccgcggctta tataggtgaa 20 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 ctcttccaaa ttgatgttcc aa 22 <210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 tccatgatac accagaacaa tca 23 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 tcctgaacca ctagacgatg g 21 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 tttcgataac ttcttgatcc ctct 24 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 ctcgcactaa gctcggaaat 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 accatggcgt tactctaccg 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 tggtgtgttg aatccacaat 20 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 ccccctttcc aataatatcc a 21 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 tccaaagagg aatccttcca 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 ccagcctcta ctgggggtta 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 tccaggactt cgaaagggta 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 acacgatacc aaggcaaacc 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 ccgctgttat ccgctacatt 20 <210> 56 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 tcgtctaaaa tgcctatacg aactc 25 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 ctggacgatc ctatttggtc a 21 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 tccagctccg tatgaaggtc 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 gcagaatacc gtcacccatt 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 attttgtccg gatcctcctt 20 <210> 61 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 aagattttta tgaagatacc gaaaat 26 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 cggtcaaatt cgaggaaaga 20 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 tggttagttt caccggattc a 21 <210> 64 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 tttttgagcc catttttaag ga 22

Claims (9)

1. 인삼 속(Panax)의 종 간에 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 서열번호 1 내지 36의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 고려인삼(Panax ginseng), 미국삼(P. quinquifolius), 전칠삼(P. notoginseng), 죽절삼(P. japonicus) 및 베트남삼(P. vietnamensis)을 포함하는 인삼 속의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 InDel 조성물.
2. 삭제
3. 서열번호 37과 38; 서열번호 39과 40; 서열번호 41과 42; 서열번호 43과 44; 서열번호 45와 46; 서열번호 47과 48; 서열번호 49와 50; 서열번호 51과 52; 서열번호 53과 54; 서열번호 55와 56; 서열번호 57과 58; 서열번호 59와 60; 서열번호 61과 62; 및 서열번호 63과 64;의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 고려인삼, 미국삼, 전칠삼, 죽절삼 및 베트남삼을 포함하는 인삼 속의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 프라이머 세트.
4. 삭제
5. 제1항의 InDel 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 고려인삼, 미국삼, 전칠삼, 죽절삼 및 베트남삼을 포함하는 인삼 속의 종으로부터 어느 하나 이상의 종 구별용 마이크로어레이.
6. 제3항의 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 고려인삼, 미국삼, 전칠삼, 죽절삼 및 베트남삼을 포함하는 인삼 속의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 키트.
7. 제6항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
8. 인삼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제3항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 다형성 뉴클레오티드를 증폭하는 단계; 및
   상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 고려인삼, 미국삼, 전칠삼, 죽절삼 및 베트남삼을 포함하는 인삼 속의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 서열분석, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는, 고려인삼, 미국삼, 전칠삼, 죽절삼 및 베트남삼을 포함하는 인삼 속의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 방법.

Images