CN116287412A - 一种基于二代测序开发用于三七药材真伪检测鉴定的引物、探针及其检测方法 - Google Patents

一种基于二代测序开发用于三七药材真伪检测鉴定的引物、探针及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于二代测序开发用于三七药材真伪检测鉴定的引物、探针及其检测方法，用于三七检测的上下游引物序列如SEQ ID NO.1和2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示，探针的5’端修饰VIC，3’端修饰MGB。用于三七的实时荧光定量PCR检测，本发明具有特异性强，灵敏度高等优点。

Description

一种基于二代测序开发用于三七药材真伪检测鉴定的引物、 探针及其检测方法
技术领域
本发明属于生物技术技术领域，具体的说，涉及一种基于二代测序开发用于三七药材真伪检测鉴定的引物、探针及其检测方法。
背景技术
三七(Panax notoginseng),为五加科人参属植物。具有化瘀止血，活血定痛的功效。主治出血症，跌打损伤，瘀血肿痛。
三七类中药的传统鉴定方法为基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定。传统鉴定方法的理论基础建立于分类群的性状特征分析，这些性状特征是与环境紧密相关的表现型。从分子遗传学角度来看，物种表现型的差异归根结底应追溯到基因型的差异，即在DNA序列上的差异。因此，对基因组序列差异的比较研究无疑为植物分类和鉴定提供了本质依据。随着生命科学不断取得重大突破，分子生物学鉴定方法应运而生，此类方法应用DNA分子标记技术鉴定中药原植物及其药材和饮片，取得了快速发展。DNA分子标记鉴别应用于参类药材鉴别已有不少的报道，RFLP、SSR、RAPD、AP-PCR、AFLP、ISSR、SNP等技术相继应用于参类药材的鉴别鉴定。然而，这些技术由于存在着操作步骤繁琐、工作量大、实验结果重复性差等弱点，难以在实际中得到应用而逐渐退出舞台。随着分子生物学的发展和基因组时代的到来，一些新的技术为参类药材的鉴定提供了新的方法。
实时荧光PCR技术在物种鉴定上已经是非常成熟与成功的技术，使用一组或多组特异性的引物探针，通过监测荧光强度变化达到鉴定的目的，该方法学不仅具备特异性强、灵敏度高，操作简单等优势，还具有较高的检测效率。运用实时荧光PCR技术鉴定三七，不仅特异性强，灵敏度高，结果准确快速，更具有良好的市场应用前景和推广应用价值。
发明内容
为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一种基于二代测序开发用于三七药材真伪检测鉴定的引物、探针及其检测方法。
为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
一种基于二代测序开发用于三七检测的引物、探针，用于三七检测的上下游引物序列如SEQ ID NO.1和2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示，探针的5’端修饰VIC，3’端修饰MGB。
本发明还提供一种基于二代测序开发用于三七检测的引物、探针的检测方法，包含以下步骤：
S1，使用植物基因组DNA提取试剂盒提取待测样品的基因组DNA；
S2，使用S1步骤提取的待测样品的基因组DNA作为待测模板，并使用如权利要求1所示的引物、探针对待测模板进行实时荧光定量PCR扩增反应；
S3，待测样品中是否含有三七基因组特有DNA片段的判断方法如下：依据CT值来判断待测样品中是否含有三七基因组特有DNA片段，CT值小于40则判断为阳性，样品CT值大于40或无任何数值则判断为阴性。
进一步的，所述S2步骤中实时荧光定量PCR扩增的反应体系为：2xT5 Fast qPCRMix 10μL、10uM的上游引物0.7μL、10uM的下游引物0.7μL、10uM的探针0.6μL、待测模板1μL，使用ddH2O补足至20μL反应体系。
进一步的，所述S2步骤中实时荧光定量PCR扩增程序为：95℃1min，一个循环；95℃15s，60℃1min，40个循环；在60℃退火延伸阶段采集对应荧光1min。
本发明还提供用于三七检测的引物、探针在制备三七检测试剂盒中的应用。
本发明的有益效果：本发明通过对三七叶绿体基因组的序列比对分析，筛选出具有一定特异性和灵敏度的TaqMan-MGB荧光探针，使探针可以特异性的检测目的基因片段的CT值，从而实现对三七的快速鉴定。
附图说明
图1是本发明中实时荧光定量PCR的标准曲线和相关扩增曲线图；
图2是本发明中引物探针特异性验证试验扩增曲线图；
图3是本发明中引物探针灵敏度验证试验扩增曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。
实施例一、引物对和探针的设计
设计：基于三七叶绿体基因组DNA，利用分子生物学软件进行引物和探针设计。
引物和探针序列如下表1所示：
表1Panax notoginseng三七的引物探针序列
Figure BDA0004152137370000031
反应体系：
Figure BDA0004152137370000032
Figure BDA0004152137370000041
扩增程序：
Figure BDA0004152137370000042
实施例二、三七标准质粒的制备和探针标准曲线的创建
1、申请人委托生物公司提取三七的基因组DNA，根据实施例一的引物序列、反应体系和扩增程序，进行PCR扩增，获得PCR产物。
2、根据PCR产物制备阳性克隆样品，然后进行测序，选择测序结果中序列完全正确的阳性克隆样品，使用质粒提取试剂盒完成质粒的提取。
3、运用公式：C＝A·B-1×6.02×1014(其中A代表质粒浓度ng·μL-1，B代表质粒DNA分子量，C代表copies·μL-1)计算出质粒浓度拷贝数，获得母液浓度：三七标准质粒(2.53*1010copies·μL-1)作为实验质粒标准品使用。
4、使用溶剂将三七质粒标准品稀释至2.53*108copies·μL-1，再按10倍浓度将其稀释为5个梯度。分别以稀释过的质粒标准品为模板，在前述反应条件下进行TaqMan RT-qPCR检测，每组试验重复3次，制定标准曲线。三七质粒标准品检测结果如表2所示，标准曲线和相关扩增曲线如图1所示。
三七标准曲线方程：y＝-3.8916x+49.666，R2＝0.9996；
且标准曲线的相关系数(R2)大于0.98。
表2Panax notoginseng三七质粒标准品检测结果
标准质粒 碱基数 分子量 浓度(ng/μL) 拷贝数(copies/μL)
6-P.notog 2038 1345080 56.555 2.53E+10
稀释倍数 基因 拷贝数 拷贝数log值 CT值平均值
10*2 6-P.notog 2.53E+08 8.403319383 16.965
10*2 6-P.notog 2.53E+08 8.403319383 16.965
10*2 6-P.notog 2.53E+08 8.403319383 16.965
10*3 6-P.notog 2.53E+07 7.403319383 20.727
10*3 6-P.notog 2.53E+07 7.403319383 20.727
10*3 6-P.notog 2.53E+07 7.403319383 20.727
10*4 6-P.notog 2.53E+06 6.403319383 24.911
10*4 6-P.notog 2.53E+06 6.403319383 24.911
10*4 6-P.notog 2.53E+06 6.403319383 24.911
10*5 6-P.notog 2.53E+05 5.403319383 28.689
10*5 6-P.notog 2.53E+05 5.403319383 28.689
10*5 6-P.notog 2.53E+05 5.403319383 28.689
10*6 6-P.notog 2.53E+04 4.403319383 32.442
10*6 6-P.notog 2.53E+04 4.403319383 32.442
10*6 6-P.notog 2.53E+04 4.403319383 32.442
实施例三、实时荧光PCR检测三七样品的方法
1、根据实施例一配制反应体系和设置扩增程序。
2、检测过程除了样品外，设置阳性对照、阴性对照，阳性对照为：质粒标准品，阴性对照为：ddH2O。
3、在阳性对照、阴性对照结果均正常的情况下，依据CT值来判断待测样品中是否含有三七基因组特有DNA片段，CT值小于40则判断为阳性，样品CT值大于40或无任何数值则判断为阴性。
实施例四、引物探针特异性验证
验证内容：特定引物探针分别对七个近缘种进行扩增，每个样本重复3次；结果如表3所示，扩增曲线如图2所示。
验证目的：验证引物探针的特异性；
表3Panaxnotoginseng三七引物探针特异性检测结果
Sample Name Target Name Reporter Quencher CT Ct Mean Ct SD
NC 6-P.notog VIC NFQ-MGB Undetermined
NC 6-P.notog VIC NFQ-MGB Undetermined
NC 6-P.notog VIC NFQ-MGB Undetermined
人参 6-P.notog VIC NFQ-MGB Undetermined
人参 6-P.notog VIC NFQ-MGB Undetermined
人参 6-P.notog VIC NFQ-MGB Undetermined
西洋参 6-P.notog VIC NFQ-MGB Undetermined
西洋参 6-P.notog VIC NFQ-MGB Undetermined
西洋参 6-P.notog VIC NFQ-MGB Undetermined
姜状三七 6-P.notog VIC NFQ-MGB Undetermined
姜状三七 6-P.notog VIC NFQ-MGB Undetermined
姜状三七 6-P.notog VIC NFQ-MGB Undetermined
狭叶竹节参 6-P.notog VIC NFQ-MGB Undetermined
狭叶竹节参 6-P.notog VIC NFQ-MGB Undetermined
狭叶竹节参 6-P.notog VIC NFQ-MGB Undetermined
珠子参 6-P.notog VIC NFQ-MGB Undetermined
珠子参 6-P.notog VIC NFQ-MGB Undetermined
珠子参 6-P.notog VIC NFQ-MGB Undetermined
三七 6-P.notog VIC NFQ-MGB 21.679 21.627 0.084
三七 6-P.notog VIC NFQ-MGB 21.531 21.627 0.084
三七 6-P.notog VIC NFQ-MGB 21.672 21.627 0.084
屏边三七 6-P.notog VIC NFQ-MGB Undetermined
屏边三七 6-P.notog VIC NFQ-MGB Undetermined
屏边三七 6-P.notog VIC NFQ-MGB Undetermined
结果：如上表3所示，Panax notoginseng三七引物探针只与三七种有扩增与其它种无扩增反应，特异性较好，3个重复CT值接近，重复性较好。
实施例五、引物探针灵敏度验证
验证内容：对应样本DNA浓度从0.00001ng/μL、0.0001ng/μL、0.001ng/μL、0.01ng/μL、0.1ng/μL、1ng/μL，6个浓度梯度测试对应引物探针的灵敏度，每个样本重复三次，并使用实时荧光定量PCR仪进行测定；检测结果如表4和图3所示。
验证目的：验证在反应体系下Panax notoginseng三七种引物探针的最低检测下限即灵敏度。
QuantStudio Dx检测结果(灵敏度)
表4 Panax notoginseng三七种引物探针灵敏度：0.0001ng/μL
Sample Name Target Name Task Reporter Quencher Cт CтMean CтSD
1 6-P.notog UNKNOWN VIC NFQ-MGB 21.901 21.925 0.110
1 6-P.notog UNKNOWN VIC NFQ-MGB 22.046 21.925 0.110
1 6-P.notog UNKNOWN VIC NFQ-MGB 21.829 21.925 0.110
0.1 6-P.notog UNKNOWN VIC NFQ-MGB 25.904 25.736 0.209
0.1 6-P.notog UNKNOWN VIC NFQ-MGB 25.802 25.736 0.209
0.1 6-P.notog UNKNOWN VIC NFQ-MGB 25.503 25.736 0.209
0.01 6-P.notog UNKNOWN VIC NFQ-MGB 29.516 29.666 0.154
0.01 6-P.notog UNKNOWN VIC NFQ-MGB 29.659 29.666 0.154
0.01 6-P.notog UNKNOWN VIC NFQ-MGB 29.823 29.666 0.154
0.001 6-P.notog UNKNOWN VIC NFQ-MGB 33.556 33.649 0.355
0.001 6-P.notog UNKNOWN VIC NFQ-MGB 33.349 33.649 0.355
0.001 6-P.notog UNKNOWN VIC NFQ-MGB 34.040 33.649 0.355
0.0001 6-P.notog UNKNOWN VIC NFQ-MGB 35.678 36.857 1.023
0.0001 6-P.notog UNKNOWN VIC NFQ-MGB 37.505 36.857 1.023
0.0001 6-P.notog UNKNOWN VIC NFQ-MGB 37.388 36.857 1.023
0.00001 6-P.notog UNKNOWN VIC NFQ-MGB 37.449 38.417 1.369
0.00001 6-P.notog UNKNOWN VIC NFQ-MGB 39.386 38.417 1.369
0.00001 6-P.notog UNKNOWN VIC NFQ-MGB Undetermined 38.417 1.369
如表4和图3所示，本发明记载的引物探针灵敏度较高。
实施例六、引物探针重复性验证
分别从以下两个方面验证：
1.同实验员同实时荧光定量PCR仪(QuantStudio Dx)不同批次酶之间比较；
2.同批次酶同实时荧光定量PCR仪(QuantStudio Dx)不同人员操作；
验证内容：每个样本重复3次，通过计算变异系数(CV％)值来进行重复性评价。计算公式：cv＝sd(标准偏差)/mean(平均值)×100％。
验证目的：验证重复性、人员操作性、不同批次聚合酶的稳定性。
表5 同实验员同QPCR仪(QuantStudio Dx)不同批次酶结果
Figure BDA0004152137370000081
Figure BDA0004152137370000082
表6 同批次酶同QPCR仪(QuantStudio Dx)不同人员操作
Figure BDA0004152137370000083
Figure BDA0004152137370000084
结果：据表5-6所示，同实验员同实时荧光定量PCR仪(QuantStudio Dx)不同批次酶之间比较；同批次酶同实时荧光定量PCR仪(QuantStudio Dx)不同人员操作；实验结果：重复性CV％均小于3％，实验重复性好，不同批次聚合酶稳定性优良。
最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其做出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (5)

1.一种基于二代测序开发用于三七药材真伪检测鉴定的引物、探针，其特征在于：用于三七检测的上下游引物序列如SEQ ID NO.1和2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示，探针的5’端修饰VIC，3’端修饰MGB。
2.如权利要求1所述的一种基于二代测序开发用于三七药材真伪检测鉴定的引物、探针的检测方法，其特征在于：包含以下步骤：
S1，使用植物基因组DNA提取试剂盒提取待测样品的基因组DNA；
S2，使用S1步骤提取的待测样品的基因组DNA作为待测模板，并使用如权利要求1所示的引物、探针对待测模板进行实时荧光定量PCR扩增反应；
S3，待测样品中是否含有三七基因组特有DNA片段的判断方法如下：依据CT值来判断待测样品中是否含有三七基因组特有DNA片段，CT值小于40则判断为阳性，样品CT值大于40或无任何数值则判断为阴性。
3.根据权利要求2所述的一种基于二代测序开发用于三七药材真伪鉴别的引物、探针的检测方法，其特征在于：所述S2步骤中实时荧光定量PCR扩增的反应体系为：2xT5 FastqPCR Mix 10μL、10uM的上游引物0.7μL、10uM的下游引物0.7μL、10uM的探针0.6μL、待测模板1μL，使用ddH2O补足至20μL反应体系。
4.根据权利要求2所述的一种基于二代测序开发用于三七药材真伪鉴别的引物、探针的检测方法，其特征在于：所述S2步骤中实时荧光定量PCR扩增程序为：95℃ 1min，一个循环；95℃ 15s，60℃ 1min，40个循环；在60℃退火延伸阶段采集对应荧光1min。
5.如权利要求1所述的引物、探针在制备三七检测试剂盒中的应用。
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