CN116814812A - 一种鉴别条斑钳蝎的引物探针组及实时荧光pcr鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药材鉴定领域，具体涉及一种鉴别条斑钳蝎的引物探针组及实时荧光PCR鉴别方法。本发明以条斑钳蝎为研究对象，以东亚钳蝎、条斑钳蝎及其他常见混淆品尖刺信使蝎的线粒体基因序列为基础，研究找出条斑钳蝎的特异性引物及探针，将引物、探针及荧光PCR方法应用条斑钳蝎药材、粉末及含有该药材的中成药中，从DNA层面鉴别条斑钳蝎药材，该方法快捷、准确、有效、安全，能够实现对条斑钳蝎药材的定性检测。
Description
技术领域
本发明属于药材鉴定领域，具体涉及一种鉴别条斑钳蝎的引物探针组及实时荧光PCR鉴别方法。
背景技术
全蝎为我国常用动物中药材，地理分布较广，药用历史悠久，主要治疗病毒性疾病，具有抗哮喘、抗凝血、抗血栓等药理作用。2020年版《中国药典》全蝎的来源为钳蝎科动物东亚钳蝎的干燥体。但由于全蝎分布区域较广，种内及种间变异较大，药材来源复杂，市场上东亚钳蝎混伪品较多，但由于缺乏可靠的检验及检测方法，严重影响全蝎的药效研究及临床准确使用，目前市场流通的蝎子的种类除药典规定的东亚钳蝎外，还有条斑钳蝎、尖刺信使蝎等。条斑钳蝎为正钳蝎Mesobuthus属的药材，目前为东亚钳蝎的常见混伪品。对于完整形态的全蝎药材，两者可通过体色及个体大小进行区别，但由于药材市场的混乱及不规范性，市售全蝎药材中常混有残体碎块，从性状角度无法鉴定残体碎块的准确基源；2020年版《中国药典》四部通则中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则项下的动物细胞色素C氧化酶亚基I（COI）为引物的DNA条形码技术可以从DNA层面鉴别东亚钳蝎、条斑钳蝎及尖刺信使蝎药材，但对于混合样品，以及药材原粉入药的成药则不适用。
发明内容
针对现有技术中存在的无法准确的鉴别真伪等问题，本发明提供了一种鉴别条斑钳蝎的引物探针组。
本发明还提供了上述引物探针组用于实时鉴别条斑钳蝎的荧光PCR方法，补充完善了条斑钳蝎的检验检测方法，规范了全蝎药材的市场秩序；本发明所提供的实时荧光PCR方法，与DNA条形码技术相比较准确度更高，更快捷，无需一代测序，节约试验成本，其对于混合样品、以及以药材原粉入药的成药均能快速准确的鉴别条斑钳蝎。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种鉴别条斑钳蝎的引物探针组，所述引物探针组为：
A-F（如SEQ ID NO.1所示）：
B-5'- ATGCTGAAGTATTTTTGTAGTT-3'；
A-R（如SEQ ID NO.2所示）：
B-5'-TAACAATAATGTACTCTTTTCG-3'；
A-P（如SEQ ID NO.3所示）：
FAM5'-AGAAGTTCAAAGAGCACTAAAAGCAA-BQ1 3'。
进一步的，所述引物探针组特异性识别的条斑钳蝎的基因序列（如SEQ ID NO.4所示）为：
AGGGCTGCACCTAAGGTTAAGGCAAGGAGTGTTAAGAAAGAAATAGGAGTGGTTATTTCATTTTTTTCATATGCTGAAGTATTTTTGTAGTTTATATTAGAAGTTCAAAGAGCACTAAAAGCAAGTCGAAAAGAGTACATTATTGTTAGGCCAAAGGAAATTAAGATGAGAAGAGAAATAATTTGATTAGATTGGCTAGTTAGAAGGCCCTC。
本发明还提供了一种含有上述鉴别条斑钳蝎的引物探针组的检测试剂盒。
本发明的另一目的为提供了一种上述鉴别条斑钳蝎的引物探针组用于实时鉴别条斑钳蝎的荧光PCR方法，包括以下步骤：
（1）提取待测样品的模板DNA；
（2）PCR反应体系配制：荧光PCR反应混合液，探针，上下游引物，供试品溶液，灭菌超纯水；
（3）对照反应体系为用等体积对照药材溶液代替供试品溶液的反应体系；空白对照反应体系为用等体积灭菌超纯水代替供试品溶液的反应体系；供试品及对照均设二个重复，CT值取二个重复的平均值作为最终结果；
（4）进行PCR反应，进行定性检测。
进一步的，步骤（2）中，所述PCR反应体系具体为：总体积为20µl，分别加入荧光PCR反应混合液（2×）10µl，探针（0.5µmol/L）1µl，上下游引物（0.5µmol/L）各1µl，供试品溶液0.5µl。
本发明提供的鉴别方法，所述PCR反应的参数为：阶段1：95℃，3分钟；阶段2：95℃，10秒，57℃，35秒，40个循环。
进一步的，鉴别过程中的判定原则为：东亚钳蝎、尖刺信使蝎无荧光对数增长，条斑钳蝎有荧光对数增长，且相应的CT值＜30.0。
本发明的有益效果为：本发明以条斑钳蝎为研究对象，以东亚钳蝎、条斑钳蝎及其他常见混淆品尖刺信使蝎的线粒体基因序列为基础，研究找出条斑钳蝎的特异性引物及探针，将引物、探针及荧光PCR方法应用条斑钳蝎药材、粉末及含有该药材的中成药中，该方法快捷、准确、有效、安全，能够实现对条斑钳蝎药材的定性检测。
附图说明
图1为针对序列B的引物和探针的条斑钳蝎的扩增曲线；
图2为针对序列B的引物和探针的东亚钳蝎的扩增曲线；
图3为针对序列B的引物和探针的尖刺信使蝎的扩增曲线；
图4为本发明鉴别方法的东亚钳蝎的特异性扩增曲线；
图5为本发明鉴别方法的尖刺信使蝎的特异性扩增曲线；
图6为本发明鉴别方法的条斑钳蝎的特异性扩增曲线；
图7为重复性试验结果图；
图8为精密度试验结果图；
图9为检出限结果图；
图10为样品实时荧光扩增曲线。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
全蝎药材详细信息表，具体见表1。
表1 样品收集情况
实施例1
（一）荧光定量PCR方法建立
1. 仪器与试剂试药
电子分析天平（Sartorius CP225D），纯水仪，离心机（Eppendorf 2545），迷你离心机，恒温混匀仪（瑞诚仪器有限公司TS100），实时定量PCR仪（ABI公司，QuantStudio5），动物基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN，DP304-02），BestarTMqPCR Master Mix（DBI，P-2025259），引物（上海生工生物工程有限公司合成），无水乙醇为分析纯，东亚钳蝎（中检院，批号：121696-201401）。
2 样品处理及DNA提取
2.1 样品处理
取药材，用75%乙醇擦拭药材表面，晾干表面水分，置乳钵中研磨成极细粉，备用。
2.2 DNA提取
2.2.1 模板DNA提取
样品模板DNA提取：取供试品粉末约30mg，置1.5ml离心管中，用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（DP304，TIANGEN）提取DNA，具体操作：加入20µl Proteinase K溶液混匀，56℃放置，直至组织溶解，加入200µl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。加入200µl无水乙醇，充分震荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。将所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱GB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm（～13400×g）离心30sec，倒掉废液，将吸附柱GB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入500µl缓冲液GD，12000rpm（～13400×g）离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入600µl缓冲液PW，12000rpm（～13400×g）离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。再向吸附柱CB3中加入500µl缓冲液PW，12000rpm（～13400×g）离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm（～13400×g）离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50µl洗脱缓冲液TE，室温放置5min，12000rpm（～13400×g）离心2min，将溶液收集到离心管中，得到DNA溶液，即为供试品溶液。
阳性对照：取条斑钳蝎药材（编号：TB-01），研成极细粉，取约30mg，同样品模板DNA溶液制备方法制成阳性药材溶液。
阴性对照：取东亚钳蝎对照药材，研成极细粉，取约30mg，同样品模板DNA溶液制备方法制成阴性对照药材溶液。
2.3 实时荧光PCR方法建立
2.3.1 探针及引物设计
GenBank数据库下载条斑钳蝎、东亚钳蝎及尖刺信使蝎的COI序列或线粒体序列，与测序获得的序列共同使用BioEdit软件进行同源对齐，手动校正后寻找差异性SNP位点，通过软件分析，在种内保守、种间差异区域设计引物和探针，其中探针5＇端标记荧光素基团FAM，3＇端标记淬灭基团BHQ1，通过Primer Premier 5.0软件设计出条斑钳蝎特异性鉴别引物及探针。
条斑钳蝎引物和探针（编号：A）序列（如SEQ ID NO.4所示）来源：
AGGGCTGCACCTAAGGTTAAGGCAAGGAGTGTTAAGAAAGAAATAGGAGTGGTTATTTCATTTTTTTCATATGCTGAAGTATTTTTGTAGTTTATATTAGAAGTTCAAAGAGCACTAAAAGCAAGTCGAAAAGAGTACATTATTGTTAGGCCAAAGGAAATTAAGATGAGAAGAGAAATAATTTGATTAGATTGGCTAGTTAGAAGGCCCTC。
条斑钳蝎引物和探针（编号：B）序列（如SEQ ID NO.5所示）来源：
ATATCATATGTTTGTAAGGAAAAATAAATTTTGTTTGTGGAGGTTAAGAGGGGAGAGAAAAACTCAAAGAATGAATCCGAGTAATATTCCGAATAAAATTAAAAGAATCCCTGAAGTTTTTAAGAGTGGGGGAAGAAAGAAAGGGGAGGAGTTCATAATAATTCAATTTAGGGCTGCACCTAAGGTTAAGGCAAGGAGTGTTAAGAAAGAAATAGGAGTGGTTATTTCATTTTTTTCATATGCTGAAGTATTTTTGTAGTTTATATTAGAAGTTCAAAGAGCACTAAAAGCAAGTCGAAAAGAGTACATTATTGTTAGGCCA。
鉴别探针及引物序列见表2。
表2 探针及引物序列表
2.3.2 探针及引物筛选
PCR反应体系配制总体积为20µl，分别加入荧光PCR反应混合液（2×）10µl，探针（0.5µmol/L）1µl，上下游引物（0.5µmol/L）各1µl，供试品溶液0.5µl，灭菌超纯水6.5µl。阳性对照反应体系为用等体积阳性药材溶液代替供试品溶液的反应体系；阴性对照反应体系为用等体积阴性对照溶液代替供试品溶液的反应体系；空白对照反应体系为用等体积灭菌超纯水代替供试品溶液。供试品及对照均设二个重复，CT值取二个重复的平均值作为最终结果。
PCR反应：将以上反应体系置于荧光定量PCR仪中进行，设定如下参数：阶段1：95℃，3分钟；阶段2：95℃，10秒，57℃，35秒，40个循环。
结果针对序列（编号A）的引物和探针（A-F、A-R、A-P），条斑钳蝎（编号TB-01）有S型荧光扩增曲线，东亚钳蝎对照药材（编号DYDZ）及尖刺信使蝎药材（编号JC-01）无荧光扩增曲线，特异性及有效性较好。针对序列（编号B）的引物和探针（B-F、B-R、B-P），条斑钳蝎（编号TB-01）有S型荧光扩增曲线，东亚钳蝎对照药材（编号DYDZ）及尖刺信使蝎药材（编号JC-01）也有荧光扩增曲线，引物和探针特异性较差，因此选择针对序列（编号A）的引物和探针进行试验。具体结果见表图1-图3。
通过针对序列（编号A）的引物和探针（A-F、A-R、A-P）的浓度、扩增循环数等一系列试验参数的考察，根据试验结果确定荧光PCR反应的体系为：
总体积为20µl，分别加入荧光PCR反应混合液（2×）10µl，探针（0.5µmol/L）1µl，上下游引物（0.5µmol/L）各1µl，供试品溶液0.5µl，灭菌超纯水6.5µl。阳性对照反应体系为用等体积阳性药材溶液代替供试品溶液的反应体系；阴性对照反应体系为用等体积阴性对照溶液代替供试品溶液的反应体系；空白对照反应体系为用等体积灭菌超纯水代替供试品溶液。供试品及对照均设二个重复，CT值取二个重复的平均值作为最终结果。
PCR反应条件：将以上反应体系置于荧光定量PCR仪中进行，设定如下参数：阶段1：95℃，3分钟；阶段2：95℃，10秒，57℃，35秒，40个循环。
质量要求：实验应同时满足以下条件：（1）空白对照无荧光对数增长或相应的CT值＞35.0；（2）阴性对照无荧光对数增长或相应的CT值＞35.0；（3）阳性对照有荧光对数增长，且相应的CT值＜30.0。
结果判定：东亚钳蝎、尖刺信使蝎无荧光对数增长，条斑钳蝎有荧光对数增长，且相应的CT值＜30.0。扩增曲线图如图4-图6所示。
2.3.3方法学试验
2.3.3.1重复性试验
取条斑钳蝎药材（编号TB-01），用75%乙醇擦拭药材表面，晾干表面水分，置乳钵中研磨成极细粉，平行取样六份，每份约30mg，置1.5ml离心管中，用动物基因组DNA提取试剂盒提取，即得模板DNA溶液。
按确定的方法和条件进行测定，结果6份条斑钳蝎药材平均CT值为24.035，RSD为1.3%，表明该方法重复性良好。结果见表3及图7。
表3重复性考察结果
2.3.3.2精密度
取条斑钳蝎药材（编号TB-01），置乳钵中研磨成极细粉，取约30mg，置1.5ml离心管中，用动物基因组DNA提取试剂盒提取，即得模板DNA溶液。
按确定的方法和条件进行测定，设六个复孔，结果平均CT值为24.598，RSD为1.1%，结果表明精密度良好。结果见表4及图8。
表4精密度考察结果
2.3.3.3 检测限
为了考察方法的检测灵敏度，在东亚钳蝎对照药材粉末中掺入不同比例的条斑钳蝎药材（编号TB-01）粉末进行实验，条斑钳蝎粉末比例分别为1.2%、3.0%、5.1%、9.8%、20.7%、50.4%。置1.5ml离心管中，用动物基因组DNA提取试剂盒提取，即得模板DNA溶液。
结果显示当掺入比例为9.8%时，有荧光对数增长且CT值为28.505<30，视为检出条斑钳蝎。考虑到药材及饮片的市场现状和实验环境等因素带来的误差，暂将掺入比例为10%时定为检出限。结果见表5及图9。
表5掺入比例考察结果
2.4样品测定
采用建立的方法对收集到的条斑钳蝎、东亚钳蝎、尖刺信使蝎进行实时荧光PCR鉴别。对于条斑钳蝎样品，结果2批条斑钳蝎均有荧光扩增曲线，且相应的CT值均＜30，检测结果为阳性；而东亚钳蝎、尖刺信使蝎则无荧光扩增曲线，检测结果为阴性。具体实验结果见图10和表6。
表6样品测定结果
注：“—”代表无荧光扩增曲线。
Claims (7)
1.一种鉴别条斑钳蝎的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组为：
A-F：5'- ATGCTGAAGTATTTTTGTAGTT-3'；
A-R：5'-TAACAATAATGTACTCTTTTCG-3'；
A-P：FAM5'-AGAAGTTCAAAGAGCACTAAAAGCAA-BQ1 3'。
2.根据权利要求1所述的鉴别条斑钳蝎的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组特异性识别的条斑钳蝎的基因序列为：
AGGGCTGCACCTAAGGTTAAGGCAAGGAGTGTTAAGAAAGAAATAGGAGTGGTTATTTCATTTTTTTCATATGCTGAAGTATTTTTGTAGTTTATATTAGAAGTTCAAAGAGCACTAAAAGCAAGTCGAAAAGAGTACATTATTGTTAGGCCAAAGGAAATTAAGATGAGAAGAGAAATAATTTGATTAGATTGGCTAGTTAGAAGGCCCTC。
3.一种含有如权利要求1所述的鉴别条斑钳蝎的引物探针组的检测试剂盒。
4.一种权利要求1所述的鉴别条斑钳蝎的引物探针组用于实时鉴别条斑钳蝎的荧光PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取待测样品的模板DNA；
（2）PCR反应体系配制：荧光PCR反应混合液，探针，上下游引物，供试品溶液，灭菌超纯水；
（3）对照反应体系为用等体积对照药材溶液代替供试品溶液的反应体系；空白对照反应体系为用等体积灭菌超纯水代替供试品溶液的反应体系；供试品及对照均设二个重复，CT值取二个重复的平均值作为最终结果；
（4）进行PCR反应，进行定性检测。
5.根据权利要求4所述的鉴别条斑钳蝎的引物探针组用于实时鉴别条斑钳蝎的荧光PCR方法，其特征在于，步骤（2）中，所述PCR反应体系具体为：总体积为20µl，分别加入荧光PCR反应混合液10µl，浓度为0.5µmol/L的探针1µl，浓度为0.5µmol/L的上下游引物各1µl，供试品溶液0.5µl。
6.根据权利要求4所述的鉴别条斑钳蝎的引物探针组用于实时鉴别条斑钳蝎的荧光PCR方法，其特征在于，所述PCR反应的参数为：阶段1：95℃，3分钟；阶段2：95℃，10秒，57℃，35秒，40个循环。
7.根据权利要求4-6任一项所述的鉴别条斑钳蝎的引物探针组用于实时鉴别条斑钳蝎的荧光PCR方法，其特征在于，鉴别过程中的判定原则为：东亚钳蝎、尖刺信使蝎无荧光对数增长，条斑钳蝎有荧光对数增长，且相应的CT值＜30.0。
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